固定化D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰基-7-氨基头孢霉烷酸

部分纯化的变异三角酵母D-氨基酸氧化酶(DAO)在碱性条件下变性过氧化氢酶,再与大孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯高聚物共价交联。与游离酶相比,固定化酶的最适反应温度升高,最适pH范围变宽,对温度和pH的稳定性都有明显的提高。固定化DAO在搅拌反应器中催化头孢霉素C(CPC)转化为戊二酰基-7-氨基头孢霉烷酸(Gl-7-ACA)。以0.03g/mL的CPC为底物,在温度25℃、pH7.2条件下,产物的得率>93%,副产物得率<5%。经过110批反应后,固定化酶保持64%的初始活力。

三角酵母整细胞酶促转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢烷酸

研究了利用含D 氨基酸氧化酶 (D aminoacidoxidase ,DAOEC1.4.3 .3)的透性化三角酵母多倍体FA10(TrigonopsisvariabilisFA10 )细胞酶促转化头孢菌素C(cephalosporinC ,CPC)为戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (Glutaryl 7 ACA ,GL 7ACA)的反应过程和细胞中同时存在的过氧化氢酶 (Catalase ,CAT)通过水解H2 O2 而对转化反应产生的干扰作用及其对策。实验证明适量添加外源H2 O2 (6 % )或在反应体系中加入过氧化氢酶抑制剂NaN3(0 .13mg/mL)可使GL 7ACA生成率分别为 73 0 %和 70 1%。如果将透性化的FA10细胞在 pH10 .5～ 11 0 ,2 0℃条件下保温 30min ,CAT被不可逆性完全钝化 ,以无过氧化氢酶的FA10细胞进行CPC的酶促转化反应 ,GL 7ACA的生成率可达 84%。

D-氨基酸氧化酶和戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰基转移酶基因在大肠杆菌中的克隆和共表达 Luo H等[Enzyme Microb Technol，2004，35（6-7）：514．518]

为了将头孢菌素C转化成-7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，克隆了来源于变异三角酵母的D-氨基酸氧化酶(DAAO)基因和来源于假单孢菌的戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)酰基转移酶基因，并在重组大肠杆菌中表达。对DAAO重组菌BL21(DE3)/pET-DAAO而言，通过分批补料培养可获得250U／ml的高DAAO活性。信号肽序列缺失的GL-7-ACA酰基转移酶基因也成功地在重组大肠杆菌BL21(DE3)／pET-ACY中得到表达，

过氧化氢在生成戊二酰-7-氨基头孢烷酸过程中的影响

头孢菌素C(CPC)在D-氨基酸氧化酶为催化剂的情况下,与O2反应生成α-ketoadipyl-7-ACA,再与过氧化氢反应生成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Gl-7-ACA)。在此反应中生成的α-ketoadipyl-7-ACA是造成目标产物收率低的关键因素之一。通过加入适量的双氧水可以使剩余的α-ketoadipyl-7-ACA转化为Gl-7-ACA,从而使裂解的收率提高5%。

过氧化氢对D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢烯酸反应的影响

在D-氨基酸氧化酶D1AAO转化头孢菌素C(CPC)为戊二酰基-7-氨基头孢烯酸(Gl-7-ACA)的反应中,所生成的过氧化氢同时与CPC和Gl-7-ACA发生的氧化副反应是造成目标产物收率损失的关键因素之一。通过联用溶氧电极和过氧化氢电极,测定了DAAO转化CPC为Gl-7-ACA的反应体系内溶氧浓度与相应的过氧化氢浓度的变化曲线,测知反应体系中过氧化氢浓度积累最高可达5mmol·L-1。模拟该反应条件下过氧化氢的氧化反应可知,在过氧化氢浓度较低时,溶液的酸性可加速该氧化反应。在中性条件下,过氧化氢浓度为5mmol·L-1时,反应1h后,CPC的氧化损失为2%,Gl-7-ACA的氧化损失为3%。通过改进氧气分布器、搅拌转速和并调控氧气流量以控制溶液中溶解氧的浓度,来适度地降低物系中过氧化氢积累浓度,使反应收率提高了2.2%。

两步酶法制备去乙酰基7-氨基头孢烯酸

以生产头孢菌素C(CPC)过程中的副产物去乙酰头孢菌素C(DCPC)为原料,用固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)和固定化戊二酰基酰化酶(GA),连续两步进行酶裂解,制备了去乙酰基7-氨基头孢烯酸(D-7-ACA),总收率72%。滴加浓度为1 mol/L的过氧化氢可使去乙酰基戊二酰基7-ACA(D-G l-7-ACA)的收率提高6%。提高氧气流速和改善搅拌形式可以加快DAAO酶反应速度,使中间产物残留减少3%。高纯度的去乙酰头孢菌素C钠盐(DCPCNa)可以提高该两步酶法反应的收率和产品质量,延长酶的使用寿命。

7-氨基-3-(1-吡啶甲基)头孢霉烷酸的制备

分别以7-ACA和GCLE为原料合成了头孢他啶关键中间体7-氨基-3-(1-吡啶甲基)头孢霉烷酸,讨论了两者的生产技术和成本。

毛细管电泳分析7-氨基头孢霉烷酸生产过程

建立了高效毛细管电泳分析法检测7-氨基头孢霉烷酸生产过程。采用未涂层石英毛细管柱,缓冲液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0),运行电压30kV,检测波长254nm。7-氨基头孢霉烷酸、头孢菌素C和戊二酰基-7-氨基头孢霉烷酸的线性范围(mg/ml)分别为0.05～3(r=0.998)、0.1～3.5(r=0.992)和0.1～5(r=0.996),迁移时间和峰面积的RSD分别为0.5%、1.0%、0.6%和2.2%、3.0%、2.4%。

酶形式差异的三酶系统一步法转化头孢菌素C制备7-氨基头孢烷酸

【目的】对酶形式差异的三酶系统一步法裂解头孢菌素C(CPC)制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)进行研究。【方法】对重组大肠杆菌分别进行摇瓶和发酵罐高密度表达,获得最高酶活后使用两个形式差异的三酶系统一步法转化CPC制备7-ACA。【结果】相较于摇瓶发酵,发酵罐发酵获得的酶活更高,发酵罐上对重组大肠杆菌的高密度表达发现,补料流加总量为400mL的甘油混合液(15%甘油+7.5%鱼蛋白胨,W/V),发酵72h后菌浓度达到32.79g/L、最高的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GA)和过氧化氢酶(CAT)活力分别为7 099.85U/L和15 776.20U/L。利用一个三酶系统包括固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)、游离GA和CAT,一步法催化CPC获得的7-ACA生成率为87.28%;而另一个三酶系统包括固定化DAAO、冻融细胞GA和CAT一步法催化CPC获得的7-ACA生成率为87.10%。【结论】两种酶形式差异的三酶系统一步法制备7-ACA的得率大致相等。GA对α?酮己二酰-7-氨基头孢烷酸(AKA-7-ACA)的特异性和水解能力较差,限制了该工艺运用。

一种高效氧化3-羟甲基-7β-苯乙酰胺-3-头孢-4-羧酸二苯甲基酯的方法

以7-氨基头孢烷酸(7-ACA)为原料,经水解、氨基和羧基保护,制得3-羟甲基-7β-苯乙酰胺-3-头孢-4-羧酸二苯甲酯(Ⅰ),产率48%;并在乙腈中用2-碘酰基苯甲酸实现羟基选择性氧化,产物3-甲酰基-7β-苯乙酰胺-3-头孢-4-羧酸二苯甲酯(Ⅱ),收率达94%。

GL-7-ACA酰化酶的固定化工艺条件优化

采用单因素和Box-Behnken实验对LX-1000EP树脂固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的工艺条件进行优化。首先通过单因素设计研究载体用量、缓冲液pH值、时间、温度四个因素对固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶活力的影响,在此基础上,利用响应面试验设计对LX-1000EP树脂固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的条件进行优化。载体用量、缓冲液pH值、时间、温度对固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶都有影响,固定化最佳工艺条件为:载体用量3.3 g、pH值7.9、时间40 h、温度25℃,在此条件下固定化酶活力达到(69.5±0.8)U/g,酶活回收率达到42.41%。将响应面法应用于固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶条件的优化是可行的。

产GL-7ACA酰化酶基因工程菌的高活性表达

实现了戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(GL-7ACA)酰化酶的组成型表达,并通过替换重组质粒启动子的RBS序列,在摇瓶培养条件下,使新构建的重组质粒pGEMKT-HPRfACY在大肠杆菌JM105中表达GL-7ACA酰化酶酶活达到0.44U/mL,是替换前的2倍.使用廉价的玉米浆作为培养基中氮源主要来源,使JM105/pGEMKT-HPRfACY菌株酶活提高到2.98U/mL.采用补料批式培养,利用流加营养物控制发酵中后期的pH值,在pH为7.5的条件下,酶活峰值达到6.37U/mL.该体系无需诱导,工艺操作过程简单,成本低廉.

大肠杆菌头孢菌素C乙酰酯酶的敲除对头孢菌素C酰化酶应用的影响

7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是合成头孢菌素类抗生素的重要中间体,工业上通常采用头孢菌素C酰化酶一步水解头孢菌素C制备,但在该反应产物中存在一个主要杂质3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA),该杂质的产生是由大肠杆菌中内源基因aes编码的头孢菌素C乙酰酯酶水解头孢菌素C或7-ACA引起的。为了防止D-7-ACA的形成,获得高品质7-ACA,减少下游精制成本,采用大肠杆菌双质粒pTargetF/pCas敲除系统,设计相应的gRNA以及同源修复供体DNA,对大肠杆菌BL21(DE3)中的aes进行敲除,从而获得了Aes缺陷型菌株BL21(DE3)△aes。将携带头孢菌素C酰化酶(CPCacy)表达质粒pET30-CPCacy的重组工程菌BL21(DE3)/pET30-CPCacy和BL21(DE3)△aes/pET30-CPCacy所诱导表达的孢菌素C酰化酶细胞破碎上清液进行7-ACA的生产对比试验,结果表明,敲除菌BL21(DE3)△aes/pET30-CPCacy对头孢菌素C的转化率为98.8%而原始菌为98.5%,同时7-ACA的产率为80.7%而原始菌株为80.2%,杂质D-7-ACA的产率仅为0.1%,为原始菌的25%,这些工作为进一步生产高品质的7-ACA奠定了基础。