固定化D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰基-7-氨基头孢霉烷酸

部分纯化的变异三角酵母D-氨基酸氧化酶(DAO)在碱性条件下变性过氧化氢酶,再与大孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯高聚物共价交联。与游离酶相比,固定化酶的最适反应温度升高,最适pH范围变宽,对温度和pH的稳定性都有明显的提高。固定化DAO在搅拌反应器中催化头孢霉素C(CPC)转化为戊二酰基-7-氨基头孢霉烷酸(Gl-7-ACA)。以0.03g/mL的CPC为底物,在温度25℃、pH7.2条件下,产物的得率>93%,副产物得率<5%。经过110批反应后,固定化酶保持64%的初始活力。

三角酵母整细胞酶促转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢烷酸

研究了利用含D 氨基酸氧化酶 (D aminoacidoxidase ,DAOEC1.4.3 .3)的透性化三角酵母多倍体FA10(TrigonopsisvariabilisFA10 )细胞酶促转化头孢菌素C(cephalosporinC ,CPC)为戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (Glutaryl 7 ACA ,GL 7ACA)的反应过程和细胞中同时存在的过氧化氢酶 (Catalase ,CAT)通过水解H2 O2 而对转化反应产生的干扰作用及其对策。实验证明适量添加外源H2 O2 (6 % )或在反应体系中加入过氧化氢酶抑制剂NaN3(0 .13mg/mL)可使GL 7ACA生成率分别为 73 0 %和 70 1%。如果将透性化的FA10细胞在 pH10 .5～ 11 0 ,2 0℃条件下保温 30min ,CAT被不可逆性完全钝化 ,以无过氧化氢酶的FA10细胞进行CPC的酶促转化反应 ,GL 7ACA的生成率可达 84%。

毛细管电泳分析7-氨基头孢霉烷酸生产过程

建立了高效毛细管电泳分析法检测7-氨基头孢霉烷酸生产过程。采用未涂层石英毛细管柱,缓冲液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0),运行电压30kV,检测波长254nm。7-氨基头孢霉烷酸、头孢菌素C和戊二酰基-7-氨基头孢霉烷酸的线性范围(mg/ml)分别为0.05～3(r=0.998)、0.1～3.5(r=0.992)和0.1～5(r=0.996),迁移时间和峰面积的RSD分别为0.5%、1.0%、0.6%和2.2%、3.0%、2.4%。

过氧化氢在生成戊二酰-7-氨基头孢烷酸过程中的影响

头孢菌素C(CPC)在D-氨基酸氧化酶为催化剂的情况下,与O2反应生成α-ketoadipyl-7-ACA,再与过氧化氢反应生成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Gl-7-ACA)。在此反应中生成的α-ketoadipyl-7-ACA是造成目标产物收率低的关键因素之一。通过加入适量的双氧水可以使剩余的α-ketoadipyl-7-ACA转化为Gl-7-ACA,从而使裂解的收率提高5%。

D-氨基酸氧化酶和戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰基转移酶基因在大肠杆菌中的克隆和共表达 Luo H等[Enzyme Microb Technol，2004，35（6-7）：514．518]

为了将头孢菌素C转化成-7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，克隆了来源于变异三角酵母的D-氨基酸氧化酶(DAAO)基因和来源于假单孢菌的戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)酰基转移酶基因，并在重组大肠杆菌中表达。对DAAO重组菌BL21(DE3)/pET-DAAO而言，通过分批补料培养可获得250U／ml的高DAAO活性。信号肽序列缺失的GL-7-ACA酰基转移酶基因也成功地在重组大肠杆菌BL21(DE3)／pET-ACY中得到表达，

过氧化氢对D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢烯酸反应的影响

在D-氨基酸氧化酶D1AAO转化头孢菌素C(CPC)为戊二酰基-7-氨基头孢烯酸(Gl-7-ACA)的反应中,所生成的过氧化氢同时与CPC和Gl-7-ACA发生的氧化副反应是造成目标产物收率损失的关键因素之一。通过联用溶氧电极和过氧化氢电极,测定了DAAO转化CPC为Gl-7-ACA的反应体系内溶氧浓度与相应的过氧化氢浓度的变化曲线,测知反应体系中过氧化氢浓度积累最高可达5mmol·L-1。模拟该反应条件下过氧化氢的氧化反应可知,在过氧化氢浓度较低时,溶液的酸性可加速该氧化反应。在中性条件下,过氧化氢浓度为5mmol·L-1时,反应1h后,CPC的氧化损失为2%,Gl-7-ACA的氧化损失为3%。通过改进氧气分布器、搅拌转速和并调控氧气流量以控制溶液中溶解氧的浓度,来适度地降低物系中过氧化氢积累浓度,使反应收率提高了2.2%。

高效液相色谱法测定去乙酰基-7-氨基头孢烷酸的含量

建立了一种高效液相色谱法测定去乙酰基-7-氨基头孢烷酸含量的方法,采用迪马公司的C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),以0.01mol/L醋酸钠(pH=4.25)为流动相,流速为1.0mL/min,检测波长为254nm,柱温为25℃,样品池温度为4℃,线性范围为60～300μg/mL,r=0.9999,平均回收率为99.36%。

两步酶法制备去乙酰基7-氨基头孢烯酸

以生产头孢菌素C(CPC)过程中的副产物去乙酰头孢菌素C(DCPC)为原料,用固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)和固定化戊二酰基酰化酶(GA),连续两步进行酶裂解,制备了去乙酰基7-氨基头孢烯酸(D-7-ACA),总收率72%。滴加浓度为1 mol/L的过氧化氢可使去乙酰基戊二酰基7-ACA(D-G l-7-ACA)的收率提高6%。提高氧气流速和改善搅拌形式可以加快DAAO酶反应速度,使中间产物残留减少3%。高纯度的去乙酰头孢菌素C钠盐(DCPCNa)可以提高该两步酶法反应的收率和产品质量,延长酶的使用寿命。

7-氨基-3-(1-吡啶甲基)头孢霉烷酸的制备

分别以7-ACA和GCLE为原料合成了头孢他啶关键中间体7-氨基-3-(1-吡啶甲基)头孢霉烷酸,讨论了两者的生产技术和成本。

7-氨基头孢烷酸生产中三甲基一氯硅烷的回收

7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是生产头孢类抗生素的重要中间体,在其生产过程中使用三甲基一氯硅烷和二甲基二氯硅烷进行羧基保护,反应后可以生成六甲基二硅氧烷(MM)等一系列产物,经回收六甲基二硅氧烷并使用氯化氢法合成三甲基一氯硅烷,达到三甲基一氯硅烷回收再利用的目的,回收率可达60%以上。合成的三甲基一氯硅烷应用于7-ACA生产,对7-ACA的收率和质量均无影响,能够完全满足7-ACA的生产需要。

7-氨基头孢霉烷酸工艺研制

实验在头孢锌盐硅烷化过程中,加入了促溶剂N,N—二甲基甲酰胺,使反应周期缩短,两相反应更加充分,脱色过程采用混合炭法,增强了脱色效果,降低了7-ACA色级,从而使7-ACA质量得到了较大幅度的提高。

发酵法制造7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸技术概述

从棒状链霉菌分离出扩环酶基因 ,从顶头孢中分离出扩环酶 /羟化酶基因和酰化酶基因 ,以质粒PSEL ECT为基础构建插入了这些酶基因的新的质粒 ,将重组质粒转入产生青霉素的产黄青霉中。在适当条件下培养转化菌株 ,产生取代的酰基 7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸 ,用适当的酶脱去侧链获得 7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸。

酶形式差异的三酶系统一步法转化头孢菌素C制备7-氨基头孢烷酸

【目的】对酶形式差异的三酶系统一步法裂解头孢菌素C(CPC)制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)进行研究。【方法】对重组大肠杆菌分别进行摇瓶和发酵罐高密度表达,获得最高酶活后使用两个形式差异的三酶系统一步法转化CPC制备7-ACA。【结果】相较于摇瓶发酵,发酵罐发酵获得的酶活更高,发酵罐上对重组大肠杆菌的高密度表达发现,补料流加总量为400mL的甘油混合液(15%甘油+7.5%鱼蛋白胨,W/V),发酵72h后菌浓度达到32.79g/L、最高的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GA)和过氧化氢酶(CAT)活力分别为7 099.85U/L和15 776.20U/L。利用一个三酶系统包括固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)、游离GA和CAT,一步法催化CPC获得的7-ACA生成率为87.28%;而另一个三酶系统包括固定化DAAO、冻融细胞GA和CAT一步法催化CPC获得的7-ACA生成率为87.10%。【结论】两种酶形式差异的三酶系统一步法制备7-ACA的得率大致相等。GA对α?酮己二酰-7-氨基头孢烷酸(AKA-7-ACA)的特异性和水解能力较差,限制了该工艺运用。

一种高效氧化3-羟甲基-7β-苯乙酰胺-3-头孢-4-羧酸二苯甲基酯的方法

以7-氨基头孢烷酸(7-ACA)为原料,经水解、氨基和羧基保护,制得3-羟甲基-7β-苯乙酰胺-3-头孢-4-羧酸二苯甲酯(Ⅰ),产率48%;并在乙腈中用2-碘酰基苯甲酸实现羟基选择性氧化,产物3-甲酰基-7β-苯乙酰胺-3-头孢-4-羧酸二苯甲酯(Ⅱ),收率达94%。

三相法提取猪肝酯酶及其在制备D -7-ACA中的应用

酯酶广泛存在于动物、植物和微生物中,具有作用范围广、底物特异性高等特点。该酶能够催化许多含有酯、酰胺、硫酯或乙酰基的化合物的水解与合成,在生物催化领域具有重要的用途。对来源于猪肝中的酯酶采用三相分离的方法进行了提取,并利用猪肝酯酶的水解特性,研究了其催化7-氨基头孢烷酸(7-ACA)脱乙酰基制备去乙酰基-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)的过程。主要研究结果:确立了三相法分离提取猪肝酯酶的方法,考察了有机溶剂种类、有机溶剂用量、硫酸铵浓度以及体系的pH和提取温度等条件对三相法分离提取猪肝酯酶的影响。实验结果表明在硫酸铵质量分数为45%、异丁醇与水相之比为1∶1、pH7.0、温度为30℃的条件下,酶活回收率为54.84%,纯化倍数为6.32倍。以猪肝酯酶为催化剂,研究了猪肝酯酶催化7-ACA脱乙酰基制备D-7-ACA,在pH7.5、温度35℃、底物浓度2%、酶添加量30 U/mL的反应条件下,7-ACA转化率达到94.33%。

头孢菌素C酰基转移酶在顶头孢霉中的表达

以假单胞菌的头孢菌素C(CPC)酰基转移酶为基础,根据顶头孢霉密码子偏爱性及RNΑ二级结构预测分析,设计并合成了全长2349bp的CPC酰基转移酶基因ecs,并将其在大肠杆菌中表达。结果证明,表达蛋白能将CPC转化为7-ΑCΑ。将ecs表达质粒转化CPC产生菌顶头孢霉,通过PCR、Southern blotting以及Western blotting等方法验证,表明ecs基因已成功整合到顶头孢霉染色体上并得到表达,重组菌的发酵也显示部分CPC直接转化成了7-ΑCΑ。

利用膜分散微反应器高效溶解D-7-ACA的研究

合成头孢呋辛的关键中间体3-去氨甲酰基头孢呋辛(DCC)由3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)溶液与酰氯试剂缩合得到,其中利用高浓度NaOH溶液将D-7-ACA溶解在水和甲醇中是第一步。而D-7-ACA中的β-内酰胺环在强碱性条件下容易发生开环反应,造成收率不高。传统反应釜不能精确控制体系的pH、混合效果差,因此溶解得到的D-7-ACA溶解浓度低。采用一种膜分散微反应器,实现了高效溶解D-7-ACA,并研究了D-7-ACA在不同初始浓度、不同温度和pH条件下的降解动力学。接着详细探讨了pH、温度和循环流速等因素对膜分散微反应器溶解D-7-ACA的影响。结果显示,利用膜分散微反应器在最优条件下得到的D-7-ACA溶解浓度为76.50 mg/ml,DCC收率为91.90%,相比传统搅拌法分别提高了5.91%和5.61%。

7-氨基-3-去乙酰基头孢烷酸的密度泛函研究

为了确定STO-3G、3-21G、6-31G 三个基组是否适用于7-氨基-3-去乙酰基头孢烷酸(简称7-ADCA),以及计算其热力学函数,本文用密度泛函理论的B3LYP 方法分别在STO-3G、3-21G、6-31G 水平上对7-ADCA 进行红外光谱计算、能量计算和结构优化。将得到的三组红外光谱波数与实验值进行比较分析,发现3-21G 和6-31G 基组得到的数据比较可靠。得到的能量参数用于计算7-ADCA 的一些热力学函数,例如标准生成热、生成吉布斯自由能和标准熵,并对结果进行校正。比较三个基组优化出的7-ADCA 的结构,发现3-21G 和6-31G 基组得到的结果相近,而与STO-G 相比有一些出入。这些分析结果有助于7-ADCA 合成头孢药物的研究。

GL-7-ACA酰化酶的固定化工艺条件优化

采用单因素和Box-Behnken实验对LX-1000EP树脂固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的工艺条件进行优化。首先通过单因素设计研究载体用量、缓冲液pH值、时间、温度四个因素对固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶活力的影响,在此基础上,利用响应面试验设计对LX-1000EP树脂固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的条件进行优化。载体用量、缓冲液pH值、时间、温度对固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶都有影响,固定化最佳工艺条件为:载体用量3.3 g、pH值7.9、时间40 h、温度25℃,在此条件下固定化酶活力达到(69.5±0.8)U/g,酶活回收率达到42.41%。将响应面法应用于固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶条件的优化是可行的。