高效液相色谱法测定血红蛋白氧载体中残留的戊二醛

建立了一种测定血红蛋白氧载体中戊二醛残余含量的高效液相色谱方法。用10kDa超滤膜通过离心3000r/min×20min将游离戊二醛从待测样品中分离;在pH1.0时,在含有70%乙腈的体系中用2,4-二硝基苯肼在30min内将戊二醛衍生成2,4-二硝基苯腙(n(2,4-二硝基苯肼):n(戊二醛)=60:1),以70%乙腈为流动相,避免了衍生产物生成沉淀。用高效液相色谱法分离测定衍生物,可在20min内完成分离,同时对衍生步骤进行了优化。本方法具有较高的灵敏度和良好的线性关系,检出限为1.0ng,在0.1～10mg/L范围内其线性相关系数为0.9999,重复测定6次的相对标准偏差小于3.0%,回收率为95.26%。

不同浓度戊二醛对红细胞血红蛋白释放的影响

为研究不同浓度戊二醛对红细胞细胞膜脆性及血红蛋白(Hb)释放的影响,用0.25、0.125、0.01、0.075、0.05、0.025mL/L的戊二醛溶液处理等体积的红细胞悬液,对照组用等体积的生理盐水处理,然后测定红细胞膜的渗透脆性,并利用血红蛋白释放试验(HRT)比较不同浓度戊二醛处理红细胞后血红蛋白释放的差异。结果表明,随着戊二醛浓度逐渐增高,红细胞渗透脆性变化不明显,但血红蛋白的释放逐渐减少。说明戊二醛可明显减弱红细胞血红蛋白释放。

戊二醛聚合猪血红蛋白免疫学特性分析

目的阐明加弗氏佐剂条件下,戊二醛聚合猪血红蛋白(glutaradehyde polymerized porcine he-moglobin,pPolyHb)对不同种类动物的免疫原性,初步探讨pPolyHb与人、牛血红蛋白的抗原决定簇的异同。方法在加弗氏佐剂的条件下,pPolyHb多次皮下免疫小鼠、大鼠和兔子,间接ELISA法检测抗血清IgG滴度;免疫印迹法分别检测小鼠、大鼠和兔子抗pPolyHb抗体与猪、牛、人、小鼠、大鼠、兔子、pPolyHb和戊二醛聚合牛血红蛋白之间的交叉反应。结果在加弗氏佐剂的条件下,pPolyHb能够刺激动物产生较高滴度的IgG,不同种类的动物产生IgG滴度不同;小鼠、大鼠和兔子抗pPolyHb抗体与不同来源的血红蛋白之间的交叉反应有明显的差异。结论在有弗氏佐剂的条件下,pPolyHb有较强的免疫原性。但是,对不同种类动物免疫刺激的强弱不同;对不同种类的动物,pPolyHb刺激抗体产生的抗原决定簇可能大部分相同,但也有部分不同,由此产生的抗体也不同;pPolyHb与人和牛血红蛋白均有一些相似的抗原决定簇,但也有一些相互独立的抗原决定簇。

猪血红蛋白及戊二醛聚合猪血红蛋白氧载体的研究

目的阐明猪血红蛋白的主要理化特性,并了解戊二醛聚合反应对猪血红蛋白主要性能的影响。方法猪血经多步纯化获取高纯度猪血红蛋白,以戊二醛为交联剂制备聚合猪血红蛋白样品。鉴定猪血红蛋白的纯度、聚合体分子量分布、携氧性能及自氧化等指标。结果猪血红蛋白在生理pH条件下的P50为23.6 mmHg,Hill系数为2.86。聚合猪血红蛋白为分子量大小不均一的混合体,聚合体P50和Hill系数均减小,自氧化趋势增大。结论猪血红蛋白具有较高氧亲和力,与人血红蛋白相似,明显高于牛血红蛋白。猪血红蛋白的丰富来源、特殊的氧亲和力和较好的化学稳定性等特点使其可成为一种血红蛋白类氧载体产品制备的有用材料。

戊二醛为交联剂制备聚合碳氧血红蛋白的实验研究

目的探讨常温、无需隔氧环境下的血红蛋白类氧载体(HBOC)制备条件及其产物聚合碳氧血红蛋白(poly-COHb)的质量。方法以人脐带血血红蛋白为原料,戊二醛为交联剂,实验组选择血红蛋白浓度、戊二醛与COHb摩尔比、反应时间和反应温度做四因素三水平正交试验(n=3),确定最佳匹配条件并制备3批poly-COHb;对照组在低温、全程隔氧条件下制备3批聚合血红蛋白(poly-Hb)。比较2组交联制品的超大分子含量、聚合度、平均分子量、高铁血红蛋白(MetHb)及P_(50)。结果按本四因素正交试验求出的poly-COHb最佳匹配条件:[Hb]70 g/L,戊二醛与COHb摩尔比为11∶1,反应时间60 min,反应温度25℃;poly-COHb与poly-Hb比较:超大分子含量(%)为0.67±0.51 vs 0.60±0.01(P>0.05),聚合度(%)与平均分子量(kD)分别为84.25±0.99 vs 54.16±5.12,235.27±13.50 vs 97.62±6.57(P<0.05),MetHb占比(%)为2.40±0.66 vs 2.47±0.46(P>0.05),P_(50)(mmHg)为6.37±0.30 vs 14.20±1.09(P<0.05)。结论在常温、无需隔氧条件下以戊二醛为交联剂制备的poly-COHb与poly-Hb相比,聚合度、平均分子量提高,大大减小制备难度。

血红蛋白在戊二醛膜修饰金电极上的直接电化学行为及其与氨茶碱的相互作用

用直接滴涂法将血红蛋白(Hb)固定到戊二醛(GA)膜修饰的金电极表面,通过循环伏安法研究了Hb在GA膜修饰金电极上的直接电化学行为.在0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH 6.00)中,扫描速度为100mV/s时,该修饰电极的峰电位差ΔE=44 mV,氧化还原峰电流之比Ip,a/Ip,c=1.17,说明Hb在GA膜修饰电极上的氧化还原过程是可逆过程;随着缓冲溶液pH值的增大,其峰电位不变,而峰电流呈增大(pH=4.00～6.00)或减小(pH=6.00～8.00)的趋势.通过GA膜对Hb的吸附固定,不仅保持了Hb的生物活性,而且实现了Hb与电极之间的直接电子转移.利用此修饰电极,研究了Hb与药物氨茶碱之间的相互作用,求得Hb和氨茶碱的结合数为2.

开环棉籽糖分子内交联血红蛋白及其戊二醛的二次交联

用高碘酸钠氧化制备开环棉籽糖 ( O-Raffinose) ,将其作为交联剂对脱氧态无基质血红蛋白 ( Stroma-free hemoglobin SFHb)进行修饰 .十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺不连续电泳 ( SDS-PAGE)结果显示 ,开环棉籽糖交联血红蛋白 ( O-Ra-Hb)与 SFHb相比抗解聚性有明显提高 ;琼脂糖 ( Sepharose)凝胶层析结果显示 ,SFHb和 O-Ra-Hb出峰时间和峰形大小基本相同 ,说明交联反应主要发生在分子内的亚基间 ,基本没有分子间交联产物 .用戊二醛 ( GDA)在优化条件下对 O-Ra-Hb进行分子间二次交联 ,SDS-PAGE结果显示 ,二次交联产物稳定性比 O-Ra-Hb有了进一步提高 ;Sepharose凝胶层析结果表明 ,产物中分子量为 65 0 0 0的未聚合的 O-Ra-Hb组分为 2 2 .6% ,分子量为 1 3 0 0 0 0～ 60 0 0 0 0的组分为 76.9% ,分子量为 60 0 0 0 0以上的组分仅为 0 .5 % 。

壳聚糖固定化血红蛋白氧载体的制备和性能研究

以固定化血红蛋白为核心的氧载体研究 ,有望为航空航天、水下作业以及好氧生物发酵工业等领域提供有效的供氧体系 .以猪血红蛋白 (p Hb)和壳聚糖微粒为氧载体制备的基本原料 ,采用戊二醛活化法将 p Hb共价固定在壳聚糖微粒上 ,构成 p Hb氧载体 .研究了活化条件与载体表面醛基形成量及蛋白固定量之间的相互关系 ,对固定化反应条件进行了优化 .在 5%戊二醛浓度下活化反应 8h,获得 p Hb最大固定量约 80 0 mg/ g,即每克截体固定 80 0 mg p Hb.从 p Hb氧载体的氧释放曲线可知 ,氧释放效率可达 40 %左右 .该氧载体的结合稳定性较好 .

血红蛋白交联条件优化及其携氧性能

纯化牛血获得的高纯度血红蛋白,在不同条件下进行戊二醛交联反应得到聚合牛血红蛋白,应用SDS-PAGE对其分子量分布进行分析比较。利用葡萄糖-葡萄糖氧化酶系统和黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统,研究氧化应激状态下过氧化氢和超氧化物对血红蛋白携氧性能的影响。结果表明,戊二醛交联血红蛋白反应的最佳条件为:溶液总体系5 m L、血红蛋白质量浓度82 g/L、磷酸钾缓冲液(p H=7.4)的浓度为0.1 mol/L、0.47 mol/L的赖氨酸0.2 m L、0.25 mol/L的冷戊二醛1.2 m L及在4℃下150 r/min摇荡24 h;葡萄糖-葡萄糖氧化酶和黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶的存在会使血红蛋白被氧化,体系中存在抗氧化剂超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT),会有效减弱血红蛋白氧化程度,提高其携氧性能。

戊二醛聚合对猪、牛和人血红蛋白免疫学特性的影响

猪、牛、人血红蛋白或其相应的戊二醛聚合体分别经皮下或腹腔多次免疫小鼠,ELISA检测抗血清IgG滴度;免疫印迹法分别检测小鼠抗猪、牛、人血红蛋白或其相应的戊二醛聚合体IgG与猪、牛、人血红蛋白或其相应的戊二醛聚合体之间的交叉反应,探讨戊二醛聚合对不同种类血红蛋白免疫学特性的影响。结果表明:猪、牛、人血红蛋白的免疫原性均很弱,其相应的戊二醛聚合体免疫原性明显增强;猪、牛、人血红蛋白具有明显的抗原性差异;戊二醛聚合对这三类血红蛋白免疫学性质的影响完全不同,戊二醛聚合猪血红蛋白没有产生新的抗原决定簇,戊二醛聚合牛血红蛋白某些抗原决定簇被封闭,戊二醛聚合人血红蛋白形成了某些新的抗原决定簇。

血红蛋白最佳聚合工艺匹配条件的研究

目的 探讨以戊二醛为交联剂的血红蛋白类氧载体（HBOCs）的聚合工艺匹配条件的优化研究,进一步降低终产品的平均分子质量和超大分子含量,提高聚合血红蛋白的有效转化率.方法 在前期对人胎盘血红蛋白与戊二醛交联的单因素影响水平的研究基础上,选取戊二醛的加样速度、血红蛋白的质量浓度和戊二醛与血红蛋白的摩尔比3个因素做正交试验以优化血红蛋白聚合工艺的匹配条件.结果 戊二醛与血红蛋白的摩尔比对聚合血红蛋白分子质量分布的影响最大,其次是血红蛋白的质量浓度,最后为戊二醛的加样速度.对平均分子质量的影响分析,不同的戊二醛与血红蛋白摩尔比条件下的平均分子质量间的差异均具有统计学意义（P＜0.05）,而不同的血红蛋白质量浓度和戊二醛的加样速度条件下的平均分子质量间的差异均无统计学意义（P＞0.05）;对有效转化率的影响分析,不同的戊二醛与血红蛋白摩尔比和不同的血红蛋白质量浓度条件下的有效转化率间的差异均具有统计学意义（P＜0.05）,不同的戊二醛加样速度条件下的有效转化率间的差异均无统计学意义（P＞0.05）;对超大分子含量的影响分析,不同的戊二醛与血红蛋白摩尔比条件下的超大分子含量间的差异均具有统计学意义（P＜0.05）,不同血红蛋白的质量浓度和戊二醛的加样速度条件下超大分子含量间的差异均无统计学意义（P＞0.05）.结论 通过以上实验分析,优化确定了血红蛋白聚合工艺的最佳匹配条件.

人胎盘血红蛋白聚合工艺的优化研究

从影响血红蛋白与戊二醛聚合的相关因素戊二醛加样方式、血红蛋白浓度、戊二醛与血红蛋白摩尔比、反应时间和温度出发，以固定变量的方法逐个研究各因素对聚合产物分子量分布的影响，以达到降低制品平均分子量、提高有效转化率的目的。结果表明：原工艺平均分子量为（350．20±35．45）kD，有效转化率（分子量90～600kD）为53．27％±4．95％；而改进后工艺平均分子量为（158．60±8．70）kD，有效转化率为69．50％±3．70％。此外，改进后工艺应用于中试（扩大30倍）规模的验证性试验，有效转化率和平均分子量均可达到上述小试结果。

HSRP1携氧液对兔控制性重度失血性贫血早期灌注的疗效观察

目的观察戊二醛聚合牛血红蛋白注射液(glutaraldehyde polymerizes bovine hemoglobin injection,代号:HSRP1)在兔重度失血性贫血早期灌注的疗效。方法建立兔控制性重度失血性贫血模型,将制模成功的12只兔分为HSRP1组和乳酸钠林格注射液(sodium lactate ringer's injection,LR)组,每组6只,雌雄各半。HSPR1组和LR组分别用HSRP1和LR进行治疗。观察两组实验兔的存活率,并测量失血前后、灌注后24 h内各个时间点的血流动力学、静脉血气、血浆血红蛋白,以及碱剩余、乳酸和碳酸氢根等指标。结果HSRP1组实验兔存活率与LR组差异具有统计学意义(P<0.05);放血后,各组实验兔的平均动脉压显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),但在灌注后HSPR1组实验兔的平均动脉压与LR组差异无统计学意义;HSRP1组实验兔在灌注第二阶段,血液乳酸浓度和碱剩余在各时间点与LR组差异均存在统计学意义(P<0.05),在灌注后2 h时,呼吸频率与LR组差异均存在统计学意义(P<0.05),在灌注后4 h时心率与LR组相比,差异存在统计学意义(P<0.05);HSRP1组实验兔的血浆静脉氧分压、静脉氧饱和度和血浆血红蛋白在实验的各个时间点与LR组差异,均无统计学意义。结论HSPR1可用于兔重度失血性贫血,通过对缺氧组织供氧,纠正无氧代谢,提高实验兔的存活率。HSPR1作为一种新型携氧液,早期可纠正重度失血性贫血患者的氧供平衡。