葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在肿瘤中作用的研究进展

肿瘤的发生是一个复杂的动态过程,能量及代谢的改变是肿瘤的基本特征之一。代谢的重新编程满足了肿瘤细胞快速增殖的能量及生物合成需求。以葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)为限速酶的磷酸戊糖途径(PPP)是葡萄糖代谢的重要分支之一,并在肿瘤的核苷酸、脂质等生物的合成及维持氧化还原的动态平衡中起着至关重要的作用,但对G6PD在肿瘤中作用的总结和认识还有待进一步加强。本文通过总结肿瘤中G6PD主要参与的代谢改变及与G6PD表达、活性相关的信号通路的研究成果,发现靶向G6PD不仅可以抑制肿瘤细胞的快速发展,还能增强肿瘤对其他化疗药物及放疗的敏感性。

L-鼠李树胶糖激酶在D-阿洛酮糖合成中的应用

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-psicose-3-epimerase,DPE)可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的可逆反应,但D-阿洛酮糖的产率较低。L-鼠李树胶糖激酶(L-rhamnulose kinase,RhaB)具有磷酸化酮糖类物质的活性,将其与DPE偶联,可以打破DPE的可逆平衡,从而提高D-阿洛酮糖的产率。在反应体系中引入多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK),可实现ATP的再生,降低反应的成本。本实验在大肠杆菌Rosetta(DE3)中分别过表达DPE、RhaB和PPK,优化其反应条件,计算产物得率。结果表明,RhaB的相对分子质量约为5.3×104,最适pH和温度为8.0和35℃。将DPE和RhaB偶联,最适条件如下:pH 8.5,温度35℃,最适金属离子Mg2+,DPE和RhaB酶量比(质量比)1∶2,产物得率为70%。将DPE、RhaB和PPK偶联,ATP浓度降为D-果糖的1/5,D-阿洛酮糖得率为50%。本研究为工业化生产D-阿洛酮糖提供理论依据。

CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒的构建和表达

目的:构建结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,M.tb)CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒,并且在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法:以M.tb H37Rv株DNA作为模板,PCR法扩增ESAT6和PPE68基因,利用基因拼接技术中的Gene-SOEing法扩增ESAT6-PPE68融合基因,克隆至原核表达质粒pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68。再分别以H37Rv株DNA和重组质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68为模板扩增CFP10和ESAT6-PPE68基因,Gene-SOEing法获取目的基因CFP10-ESAT6-PPE68,克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-ESAT6-PPE68,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果:CFP10-ESAT6-PPE68酶切片段大小与理论值符合,基因测序结果显示融合基因CFP10-ESAT6-PPE68的序列与Genbank中序列一致,并在大肠杆菌中成功诱导表达了目的蛋白,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,相对分子量约为77 kD。结论:成功构建了M.tb CFP10-ESAT6-PPE68融合基因的原核表达质粒,并诱导表达出了融合蛋白,为该融合蛋白在结核病血清诊断学中的应用奠定了实验基础。

DNA/RNA分子中的3′,5′-磷酸二酯键之刍议

3′,5′-磷酸二酯键是生物学、生物化学及有机化学等相关学科中一个重要名词和考点,然而对其释义及内涵的理解在国内外各教材、文献及网络平台上却不同,长期以来是一个争论热点。现利用基团和化学键的基本概念、酯化反应机理及影响因素、磷酸的结构等知识,结合3′,5′-磷酸二酯键的形成机制即核苷酸从头合成途径和核酸合成的相关过程,对3′,5′-磷酸二酯键进行系统剖析和探讨,明确其本质及内涵,体现教学要注重多学科知识的交融和思维的培养。

结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,采用PCR法分别扩增CFP10和PPE68基因,基因拼接法扩增CFP10-PPE68融合基因,克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-PPE68,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-PPE68经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量为68 630,表达量为菌体总蛋白的41.8%,主要以可溶性形式存在,且可与PPE68 rBCG免疫兔血清发生特异性反应。结论成功构建了结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了融合蛋白,为其在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础。

蓝桉叶片桉叶素生物合成机理研究

为探明蓝桉(Eucalyptus globulus Labill.)叶片桉叶素合成过程中关键酶活性与桉叶素含量的关系,以不同发育阶段的蓝桉叶片为研究对象,测定桉叶素相对含量和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、异戊烯基焦磷酸异构酶(IPPI)、香叶基焦磷酸合酶(GPPS)、桉叶素合酶(CinS)活性,并对其进行方差分析、相关性分析、通径分析.结果表明,随着蓝桉叶片成熟度增加,桉叶素相对含量逐渐增加,HMGR、DXS、GPPS、IPPI的酶活性逐渐下降.在一个完整的年生长周期内,桉叶素相对含量在7月份显著高于其余月份,HMGR、DXS、GPPS、CinS活性在5、6月份显著高于其余月份.桉叶素相对含量与DXS、CinS活性显著正相关,与HMGR、IPPI、GPPS酶活性极显著负相关.研究结果表明,在5、6月份增强蓝桉幼嫩叶片的DXS和CinS活性,可以有效提高桉叶素积累,进而提高蓝桉桉叶油的产量和品质.

重组CFP10-PPE68融合蛋白检测结核分枝杆菌感染的初步应用

目的以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)RD1区特异性培养滤液蛋白10(culture filtrate pro-tein10,CFP10)与戊糖-5-磷酸-3-差异构象酶68(pentose-5-phosphate-3-epimerase68,PPE68)的融合蛋白CFP10-PPE68作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB抗体的间接ELISA法。方法采用亲和层析法纯化重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白;分别以3种蛋白作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB特异性抗体的间接ELISA法;采用方阵滴定法对建立的间接ELISA法的条件进行优化;并以临床诊断为金标准,对间接ELISA法的特异性、敏感性和准确性进行验证。结果纯化的重组CFP10-PPE68融合蛋白纯度约为70%。分别以重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白作为包被抗原的最佳包被浓度分别为2、4、4μg/ml,血清最佳稀释度均为1∶1 000,酶标二抗最佳稀释度均为1∶5 000。3种蛋白对肺外结核的诊断效果均优于肺结核,且重组CFP10-PPE68融合蛋白检测肺外结核的特异性、敏感性及准确性均最佳;3种蛋白诊断结核病的特异性较高,而敏感性相对较低。结论以重组CFP10-PPE68融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA法诊断MTB感染具有较高的敏感性和特异性,特别是对难以诊断的肺外结核病的诊断有一定的参考价值。

东北雷公藤DXR HMGR基因克隆及生物信息学分析

目的:克隆东北雷公藤萜类物质生物合成关键酶基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)基因和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)基因全长,并对其进行生物信息学分析。方法:根据东北雷公藤转录组数据,设计特异性引物,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术克隆东北雷公藤DXR、HMGR基因编码区的全长序列,并进行一系列生物信息学分析。结果:成功克隆东北雷公藤DXR、HMGR基因各1条,分别命名为TrDXR和TrHMGR,两者分别长1410、1770 bp,编码469个和589个氨基酸。TrDXR为亲水性蛋白,亚细胞定位在叶绿体,无跨膜结构,转运肽定位于叶绿体,含有2个结合功能域和2个活性位点基序;TrHMGR为疏水性蛋白,亚细胞定位在内质网,有跨膜结构,无转运肽,含有4个结合功能域。TrDXR和TrHMGR与不同物种同源序列的相似性高,保守性强。结论:克隆获得TrDXR、TrHMGR基因cDNA全长,并对其生物功能进行了初步预测,为基因功能鉴定及东北雷公藤萜类物质分子形成机制研究奠定基础。

苹果GMP、GME和GGP基因的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMP)、GDP-甘露糖-3′,5′-表异构酶(GDP-mannose-3′,5′-epimerase,GME)和GDP-1-半乳糖磷酸酶(GDP-L-galactose-1-phosphate phosphorylase,GGP)的基因序列并分析其表达特性,探讨GMP、GME和GGP基因在抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)合成过程中的作用。【方法】以‘嘎啦’苹果幼果为材料,分别运用RT-PCR和PCR法克隆GMP、GME和GGP基因的cDNA和gDNA全长序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR,分析以上基因在苹果不同组织(幼叶、成熟叶、衰老叶、花、幼果、成熟果和根)中的表达情况。【结果】RT-PCR法克隆及序列分析显示,GMP基因的cDNA全长为1 280bp,编码361个氨基酸,gDNA序列中含有3个内含子;GME基因的cDNA全长为1 323bp,编码376个氨基酸,gDNA序列中含有5个内含子;GGP基因的cDNA全长为1 677bp,编码446个氨基酸,gDNA序列中含有6个内含子。基因表达的实时荧光定量PCR分析表明,GMP、GME和GGP在苹果不同组织中均有表达,在叶片中的表达量高于其他组织,且表达量随着叶片的生长逐渐升高;在花、幼果和成熟果中,GMP、GME和GGP的表达量差异不明显。【结论】克隆获得了苹果的GMP、GME和GGP基因,其在苹果不同组织的生长过程中有不同的表达特性,但GME的表达水平远远低于GMP和GGP,这在一定程度上表明,在苹果AsA的生物合成过程中,GMP、GGP较GME有更重要的作用。

洛伐他丁和膦胺霉素对烟草HMGR和DXR活性的影响

HMGR和DXR分别是萜类生物合成途径——MVA和MEP途径的2个关键酶。本研究对烟草施用HMGR和DXR的专一抑制剂洛伐他汀(MEV)和膦胺霉素(FSM),测定烟草Nt HMGR、Nt DXR、FPPS和GGPPS基因转录水平、HMGR和DXR酶活性变化。结果表明,抑制剂处理后烟草内源基因Nt HMGR和Nt DXR表达量在24h受到明显抑制;HMGR和DXR活性均在一定时间内受到抑制。MEV和FSM能有效抑制烟草中HMGR和DXR的活性。

活性氧在密旋链霉菌Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累中的作用

作者前期研究成果显示密旋链霉菌Act12可以上调丹参酮生物合成途径上的关键酶基因的表达大幅提高丹参毛状根中丹参酮含量。该实验则进一步研究了活性氧在Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累的作用。在继代培养21 d的丹参毛状根中添加Act12不同的诱导子及诱导子组合,分别测定不同收获期毛状根的生物量,毛状根中活性氧积累量,丹参酮类成分的积累量和关键酶基因表达量。Act12诱导后丹参毛状根中活性氧含量上升,HMGR和DXR基因表达上调,最高分别达到对照的32.4,4.8倍,毛状根中丹参酮积累增加,最高达到对照的10.2倍;加入活性氧抑制剂CAT和SOD后,丹参毛状根中的活性氧含量较Act12处理显著下降,HMGR和DXR基因表达也明显下降,毛状根中丹参酮含量较Act12处理下降了74.6%。活性氧介导了Act12诱导丹参酮积累,Act12很可能是通过ROS信号通路激活了MVA和MEP途径,从而提高了丹参酮在毛状根中的含量。