新成人腹泻轮状病毒J19株的全基因组克隆和VP4、VP6和VP7基因序列分析

为了进一步了解新成人腹泻轮状病毒J19株的基因和蛋白特征,利用一种改良的非依赖核酸序列的单引物扩增方法扩增J19株的11个基因,克隆到pMD18-T载体中并进行测序。在此基础上,将主要抗原蛋白VP4、VP6和VP7的蛋白序列与其它轮状病毒的相关蛋白序列进行比较分析并对VP6蛋白序列做遗传进化分析。结果获得J19株11个基因的全长基因序列。基因序列分析表明J19株的第3、6和第9基因分别长2 512bp、1 287bp和820bp,它们分别预测编码抗原蛋白VP4(823aa)、VP6(396aa)和VP7(258aa)。组成J19株的VP4、VP6和VP7蛋白序列对B组轮状病毒的CAL株、IDIR株以及ADRV株的相关蛋白序列的一致性分别是27.6%、38.5%和22.3%。对分组抗原蛋白VP6的遗传进化分析表明,J19株在进化树上的位置靠近外群蛋白分支以及A、B和C组轮状病毒分支的根部,而且它比较偏向于B组轮状病毒的分支。J19株的VP4、VP6和VP7蛋白序列与其它轮状病毒的相应蛋白序列存在显著差异。VP6蛋白序列的遗传进化分析表明J19株可能是一个新组轮状病毒的代表性毒株;同时,它也可能是一个与B组轮状病毒的起源和进化密切相关的毒株之一。关于新成人腹泻轮状病毒J19株11个基因的克隆及VP4、VP6和VP7基因的序列分析,这是第一次报道。

新成人腹泻轮状病毒J19株VP2、VP3的编码基因序列分析

利用一种改良的非依赖核酸序列的单引物扩增方法,从新成人腹泻轮状病毒J19株的核酸中扩增基因,克隆至pMD18-T中并进行测序和基因序列分析。J19株的VP2、VP3的编码基因为基因2、4,分别长2 969bp、2 204bp,它们分别编码973个氨基酸和719个氨基酸。J19株的VP2蛋白序列对B组人轮状病毒IDIR株的一致性为47.2%;J19株的VP3蛋白序列对C组人轮状病毒Cowden株一致性为25.1%。对J19株VP2的遗传进化分析表明,J19株在进化树上的位置靠近外群蛋白以及A、B和C组轮状病毒分枝的根部,并且它比较偏向于B组轮状病毒的分枝。这与VP6的遗传进化分析结果相一致。根据上述结果推测J19株可能是一个与B组轮状病毒的起源和进化密切相关的毒株之一;同时,这表明VP2在研究轮状病毒的遗传进化上具有重要价值。关于新成人腹泻轮状病毒J19株VP2、VP3的编码基因的序列分析,这是首次报道。

成人腹泻轮状病毒的血清流行病学

本文用对流电泳技术进行成人腹泻轮状病毒(ADRV)血清流行病学调查,发现我国大陆、香港及澳大利亚正常人群中,抗ADRV抗体阳性率都在20％以下,而发生过腹泻流行的地区,阳性率高达40％以上。在动物中,抗体反应谱广泛(猪、鸡、鸭、家鼠、大鼠、豚鼠、小鼠)。以猪(36.13％)和家鼠(46.66％)为最高,讨论了成人腹泻轮状病毒动物来源的可能性。

成人腹泻轮状病毒J19株依赖RNA的RNA聚合酶基因序列分析

目的进一步了解新的成人腹泻轮状病毒J19株依赖RNA的RNA聚合酶基因特征。方法利用一种改良的非依赖核酸序列的单引物扩增方法扩增新的成人腹泻轮状病毒J19株的VP1基因,克隆至pMD18-T中并进行测序。利用DNAStar和PHYLIP软件包进行序列之间的比较分析并绘制系统发生树。结果J19株的VP1基因为基因1,全长3538个核苷酸,编码1167个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明J19株的VP1蛋白序列对B组轮状病毒IDIR株的一致性为55．7％,对A组轮状病毒SA11株和C组轮状病毒Bristol株的一致性分别为20．4％、19．2％。对J19株的VP1蛋白序列的遗传进化分析表明,J19株在系统发生树上的位置是靠近外群蛋白并靠近A、B和C组轮状病毒分支的根部,而且它比较偏向于B组轮状病毒的分支。结论J19株的VP1蛋白序列与其他轮状病毒的VP1蛋白序列存在显著差异。J19株可能是一个与B组轮状病毒的起源和进化密切相关的毒株之一。

成人腹泻轮状病毒抗体在人体内维持时间的研究

目的 观察成人腹泻轮状病毒 (ADRV)抗体在人体内维持时间。方法 采用特异性的ADRV ELISA阻断试验检测ADRV抗体 ,对河南义马地区 1992、1987、1983年患成人腹泻的病人恢复 1年、6年、10年后的血清进行ADRV抗体的检测。结果 2 6 0例ADRV病人恢复 1年、6年、10年后其血清中ADRV抗体阳性率分别为 2 2 .7% (34 15 0 )、36 .3 % (2 9 80 )、2 3 .3% (7 30 ) ;对 92例ADRV抗体阳性者进行了抗体维持时间的观察 ,ADRV抗体在人体内可维持 1～ 6年。结论 成人腹泻轮状病毒感染人后一旦产生了抗体 ,可维持

新的成人腹泻轮状病毒J19株NSP4和NSP5基因克隆和序列分析

目的克隆新的成人腹泻轮状病毒J19株NSP4和NSP5基因,并分析其基因序列。方法利用一种改进的非依赖核酸序列的单引物扩增方法扩增J19株NSP4和NSP5基因,克隆到 pMD18-T载体中并进行测序。在此基础上,将J19株NSP4和NSP5的蛋白序列与其他轮状病毒蛋白序列进行比较分析和种系进化分析。结果J19株NSP4和NSP5基因为基因10和11,全长为739 bp 和649 bp,它们分别编码213个和176个氨基酸。与J19株NSP4和NSP5蛋白序列一致性较高的分别是B组成人腹泻轮状病毒Bang373株(20．3％)和B组猪轮状病毒db101株(29．5％)。对J19株的 NSP4和NSP5的遗传进化分析表明,J19株在进化树上的位置都靠近A、B和C组轮状病毒分支的根部,而且它比较偏向B组轮状病毒的分支。结论J19株的NSP4和NSP5与其他轮状病毒的相应蛋白序列存在显著差异。J19株NSP4和NSP5的蛋白序列比较和遗传进化分析表明新的成人腹泻轮状病毒与成人腹泻轮状病毒可能有共同起源;但是新的成人腹泻轮状病毒与成人腹泻轮状病毒存在显著差异。

一种改良方法克隆新的成人腹泻轮状病毒J19株的大片段基因

目的扩增、克隆新的成人腹泻轮状病毒J19株的大片段基因。方法以新成人腹泻轮状病毒J19株的病毒核酸为材料,利用非依赖核酸序列的单引物扩增方法,扩增新的成人腹泻轮状病毒J19株的第5-11基因;根据第5-11基因序列设计7对抑制性引物,通过在PCR扩增体系中添加小片段基因的抑制性引物来提高大片段基因的PCR产量。结果当在PCR反应体系中添加2对抑制性引物时,大于2kd的大片段基因的PCR产量得到显著提高。将扩增的基因片段克隆至pMD18- T后进行测序,最后得到J19株第2、3、4基因的全长eDNA克隆。结论这种改良的非依赖核酸序列的单引物扩增方法可以用于对轮状病毒大片段基因的扩增和克隆。