成体兔转基因成纤维细胞的克隆分离及其核移植研究

哺乳动物体细胞核移植及其与转基因技术的结合为转基因动物的研究提供了新的思路和方法.然而,单个转基因细胞克隆的分离培养一直比较困难,很大程度上限制了转基因动物的研制.将pRNAT-U6.1/Neo质粒转染成体兔成纤维细胞,通过24孔细胞培养板分离培养法获得来源于单个转基因成纤维细胞克隆.由于单个成纤维细胞克隆在新鲜DMEM培养液中生长比较困难或缓慢,采用由DMEM/F12制备的条件性培养液进行筛选.以转基因成纤维细胞为供体细胞进行核移植,囊胚率为23.5%,与来源于成体兔正常成纤维细胞相比较差异不显著.并且利用PCR或多重PCR方法鉴定筛选的转基因细胞克隆及其核移植胚胎中整合的NeoR基因和常染色体β-actinDNA.为转基因哺乳动物细胞的分离培养和核移植胚胎的鉴定提供可靠的方法,缩短了转基因动物的研制周期,降低生产成本,同时为进一步通过核移植技术获得转基因克隆兔提供了条件.

电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的初步研究

目的采用电穿孔方法，介导质粒载体pEGFP-cl转入兔成体成纤维细胞，探讨建立电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的基本条件。方法电穿孔介导质粒载体pEGFP—cl转入7．10代兔耳成体成纤维细胞系GG，研究不同电压、电容、DNA剂量，孵育温度的条件下，观察细胞存活数，流式细胞仪测试GFP的含量。结果以PBS作为电击基础液、细胞浓度2×10^6个／ml，电压250V、电容700μF，DNA用量30μg时，兔耳成纤维细胞的转染率和存活率最佳。且电击前冰浴10min，电转染后37℃孵育10min有利于提高细胞的转染率和存活率。结论在合适电压、电容、DNA剂量条件下，电转染提供了外源基因转染兔耳成体成纤维细胞适用性；电转染前的一定时间冰浴和电转染后一定温度孵育可使电转染效率得到改善。