全柱成像等电聚焦毛细管电泳法对双特异性Fc融合蛋白的电荷异质性分析

建立全柱成像等电聚焦毛细管电泳(WCID-CIEF)分析双特异性Fc融合蛋白电荷异质性方法。方法 通过非还原毛细管电泳法观察酶处理前后峰型的变化,初步确认了该Fc融合蛋白电荷异质性唾液酸相关;结合唾液酸酶酶切和方法优化手段,建立了此融合蛋白的WCID-CIEF分析平台;通过液相质谱法(LC-MS)鉴定了唾液酸相关N-糖构型;通过液相荧光法(LC-FLR)测定了唾液酸的含量。结果 经唾液酸酶酶切和方法优化后,此方法在2.5~7.5 mgmL-1浓度范围内线性良好,R2=0.998,回收率在96.3%~104.6%之间,准确性、专属性和耐用性均满足要求。结论 结合酶处理和方法优化手段,WCID-CIEF可较好地分析融合蛋白的电荷异质性,提供了一种简单、有效的融合蛋白质控手段,并可应用于产品放行及稳定性监测。

成像毛细管等点聚焦电泳法对单克隆抗体制品的电荷异质性分析

目的:采用成像毛细管等点聚焦电泳法分析单克隆抗体制品的电荷异质性。方法:应用优化的成像毛细管等点聚焦电泳技术,对2种单克隆抗体制品酶切处理前后进行电荷异质性分析。结果:羧肽酶B处理前后的抗体1成像毛细管等点聚焦电泳结果比较证明其电荷异质性主要由C末端赖氨酸不均一性引起;羧肽酶B处理和/或N-糖苷酶处理前后的抗体2成像毛细管等点聚焦电泳结果比较证明其电荷异质性主要由C末端赖氨酸不均一性和N-糖的唾液酸修饰引起。结论:采用优化的成像毛细管等点聚焦电泳技术,可较好地分析单克隆抗体产品的电荷异质性;并且配合合适的酶切处理,可判断单克隆抗体产品主要电荷异质性的来源,为保证单克隆抗体产品技术药物生产工艺的稳定性及质量控制提供了有效手段。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术在重组蛋白疫苗电荷异质性分析中的应用

重组蛋白分子表征的稳定性是保证疫苗发挥免疫原性及抗原性的关键。重组蛋白疫苗与治疗性蛋白制品一样,因体外合成和纯化过程的复杂性而表现出异质性。其中,电荷异质性是重组蛋白质的关键质量属性之一。电荷异质性监测有助于推动生产工艺的优化,反映产品生产的一致性和稳定性等,对保证重组蛋白产品的安全和质量至关重要。开发可靠快速、灵敏稳健的电荷异质性分析方法一直是生物制药行业所追求的目标。经典的电荷异质性分析方法主要有离子交换色谱(IEC)、毛细管区带电泳(CZE)以及全柱成像毛细管等电聚焦电泳(WCID-CIEF)等,其中WCID-CIEF提供的等电点(pI)和峰形的生化指纹有助于对疫苗多蛋白成分的分析。基于以上该文将对WCID-CIEF的原理和特点及其在重组蛋白疫苗质量控制中的应用进行概述。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳测定艾塞那肽等电点

目的:采用新一代全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术(CIEF-WCID)测定艾塞那肽等电点。方法:采用互补性金属氧化物半导体成像技术对样品等电聚焦过程进行实时记录,根据适宜的marker计算得到艾塞那肽的等电点,并对方法的准确度与重复性进行考察。结果:测得艾塞那肽等电点为5.46,与凝胶电泳结果基本一致,相对标准偏差为0.11%。CIEF-WCID方法快速准确,相对误差小于2.5%,重复性良好。结论:CIEF-WCID作为一种新的技术手段可用于艾塞那肽等电点的分析,方法快速、准确、重复性好,可为多肽的质量控制提供一种可靠的分析方法。

基于双特异性抗体的全柱成像毛细管等电聚焦电泳方法开发策略

双特异性抗体是治疗性抗体领域的研究热点,抗体药物的质量控制也一直是生物制药企业和法规机构的关注重点。全柱成像毛细管等电聚焦电泳(Whole-Column Imaging Detection for Capillary Isoelectric Focusing,WCID-CIEF)是检测治疗性双特异性抗体等电点(Isoelectric point,p I)与电荷异质体的有效方法,但由于双特异性抗体分子本身的结构与理化性质复杂,通常需要针对特定分子进行方法开发或优化,以保证分析方法的专属性和良好的分离效果。本文基于双特异性抗体对全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法开发策略进行概述,包括添加剂、载体两性电解质种类与比例、占位剂、上样量、等电点标记物以及工作溶液稳定性等方面,以期为国内双特异性抗体研究与生产提供方法开发上的技术参考。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析蛋白质药物电荷异质性

评价了cIEF-WCID检测多肽与蛋白质药物等电点的应用效果。测定标准多肽的等电点,验证了cIEF-WCID具有高的准确度和良好的重复性(相对标准偏差<0.50%)。人血红蛋白的4种主要异构体实现了基线分离;甘赖胰岛素的重复测试均只检出单一特征峰(p I 5.95±0.01);比较重组人生长激素原液和成品,等电点特征峰比例差异明显,且成品有新特征峰出现;对比进口及国产贝伐单抗,发现厂家1、3与原研药基本一致,厂家1的主成分迁移规律与原研药高度一致,厂家2的重链C末端K缺失、N末端焦谷氨酸环化或脱酰胺修饰影响了电荷异质性;通过考察尿素浓度、电解质范围和聚焦时间,优化了检测重组人促卵泡素等电点条件:2 mol/L尿素,两性电解质pH 2.5~5.0与pH 3.0~10.0按1∶1混合,聚焦电压1 000 V(1 min)~1 800 V(4 min)~2 200 V(1 min)。cIEF-WCID可快速、准确测定具有电荷异质性的蛋白类药物等电点,分辨率和重复性好,尤其是可以跟踪聚焦过程中样本的迁移特征,特别适合蛋白类药物复杂电荷异质性的检测。

百日咳黏附素等电点全柱成像毛细管等电聚焦电泳检测方法的建立及验证

目的 建立百日咳黏附素(pertactin,PRN)等电点(isoelectric point,pI)全柱成像毛细管等电聚焦电泳(whole column imaging detection-capillary isoelectric focusing,WCID-CIEF)检测方法,并进行验证。方法 通过优化检测PRN抗原WCID-CIEF过程中的聚焦时间、样品终浓度等参数,建立测定PRN抗原的WCID-CIEF方法,并对方法进行专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性验证。结果 PRN抗原pI WCID-CIEF测定方法的最佳聚焦时间为1 500 V预聚焦1 min,3 000 V聚焦3 min;体系中PRN抗原最佳终浓度为300μg/mL。PRN抗原pI约为6.035,样品缓冲液在抗原各峰位置无干扰峰,方法的专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性均良好。结论 建立的WCID-CIEF方法适用于PRN抗原的pI检测及电荷异质性分析,可为PRN抗原的表征提供依据以及相关疫苗研发和生产过程中的质量控制提供参考。

重组腺相关病毒衣壳蛋白电荷异质性成像毛细管等电聚焦电泳检测方法的建立及验证

目的建立重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)衣壳蛋白电荷异质性的成像毛细管等电聚焦电泳(imaged capillary isoelectric focusing,iCIEF)检测方法,并进行方法验证,以期为rAAV产品的表征研究、质量控制及生产工艺稳定性的监控提供可靠的检测方法。方法将待测样品经变性处理后,采用紫外荧光检测模式进行iCIEF分析,进样时间设为55s,电压为1500V,聚焦时间为1min;随后将电压调整至3000V,并继续聚焦10min。激发波长设为280nm,发射荧光检测曝光时间设为80s。以rAAV5型空心颗粒(rAAV-E)为待测样品,验证方法的专属性、精密性、线性范围、准确性及定量限。采用建立的方法检测rAAV5型实心颗粒(rAAV-F)样品的电荷异质性。结果rAAV-E样品在pH6.9~7.1之间呈现2个明显主峰(Peak1和Peak2),空白对照未检测到病毒衣壳蛋白峰;6次重复检测rAAV-E样品2个主峰Peak1和Peak2的pI均值分别为6.91和7.04,RSD均为0.14%,峰面积百分比均值分别为35.6%和55.8%,RSD分别为1.1%和0.4%;3个时间点检测rAAV-E样品2个主峰Peak1和Peak2峰面积百分比的RSD分别为3.45%和3.38%,pl的RSD分别为0.10%和0.11%;rAAV-E浓度在(4.08~6.12)×10^(12)vp/mL范围内,与Peak1和Peak2的总峰面积均值呈良好的线性关系,线性回归方程为y=54888x-76556,R^(2)=0.976;80%、100%和120%预期浓度rAAV-E样品2个主峰总峰面积的回收率均在80%~120%范围内;Peak1的定量限为1.02×10^(12)vp/mL,Peak2定量限为0.76×10^(12)vp/mL。rAAV-F样品呈现Peak1和Peak2外,在酸性区域(pl<5.85)还观察到明显的额外峰,这是rAAV-F区别于rAAV-E的主要特征,也表明其具有复杂的电荷异质性分布。结论建立的iCIEF法具有良好的专属性、精密性及准确性,可用于rAAV衣壳蛋白电荷异质性的分析。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析尤瑞克林电荷异质性方法的建立与应用

目的 建立全柱成像毛细管等电聚焦电泳(image capillary isoelectric focusing,iCIEF)方法分析尤瑞克林(human urinary kininogenase,HUK)的电荷异质性。方法 取35μL 1%甲基纤维素、10μL 200 mmol·L^(-1)的亚氨基二乙酸、4μL两性电解质溶液、48 mg尿素、等电点(pI)为6.14和7.05的等电点标记物各0.5μL及水,配制为100μL供试品体系进行聚焦分析,聚焦条件为预聚焦电压1 500 V、持续时间1 min,聚焦电压3 000 V、持续时间6 min。结果 优化后的方法专属性良好、准确度验证中回收率在90%~110%之间;线性验证结果的r^(2)为0.995 7;重复性验证中的各异构体的pI的相对标准偏差(RSD)均小于0.2%,定量限为0.013 mg·mL^(-1);IDA及两性电解质等添加量的耐用性良好。采用该方法可以有效分离不同厂家的HUK电荷异构体。结论 建立的iCIEF方法具有良好的专属性、精密度、准确度和耐用性,能够很好地解决蛋白质类产品的电荷异质性评价的难题,对该类产品在电荷异质性角度的质量控制具有重要意义。

治疗性单克隆抗体SIBP-A电荷异构体全柱成像毛细管等电聚焦电泳测定方法的建立及验证

目的建立治疗性单克隆抗体(单抗)SIBP-A电荷异构体全柱成像毛细管等电聚焦电泳(imaging capillary isoelectric focusing electrophoresis, icIEF)的测定方法, 并进行验证。方法针对尿素浓度、两性电解质范围及浓度和聚焦时间对icIEF方法进行条件优化, 并应用优化条件对该单抗电荷异构体进行分析, 验证专属性、稳定性指示性、重复性、中间精密度、线性与范围、准确度、定量限及处理后样品的稳定性。结果优化后icIEF条件:3 mol/L尿素、1% MC胶、3%两性电解质载体Pharmalyte 3-10与Pharmalyte 8-10.5按1∶1混合, 电压1 kV、预聚焦1 min, 电压3 kV、聚焦分离6 min。专属性实验中, 空白组在样品出峰处无明显干扰峰, 对照组正常出峰且电荷异构体正常;稳定性指示性实验中, 可以检测出40 ℃放置7 d的样品正常出峰而且电荷异构体发生显著变化, 与对照样品明显不同;重复性实验中, 酸性峰、主峰及碱性峰相对百分含量的相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)分别为0.48%、0.00%和4.03%, 主峰等电点RSD为0.012%;中间精密度实验中, 酸性峰、主峰及碱性峰相对百分含量的RSD分别为0.89%、0.45%和6.14%, 主峰等电点RSD为0.072%;在蛋白终浓度0.50~1.50 mg/ml范围内具有良好的线性, 线性决定系数为0.996 8, 且回收率在95.03%~104.35%内;该方法的定量限为0.003 0 mg/ml;10 ℃条件下样品酸性峰、主峰、碱性峰相对百分含量的RSD分别为0.56%、0.00%和8.61%, 主峰等电点RSD为0.056%;室温条件下3 h酸性峰电荷异构体开始发生明显变化。结论研究建立的检测方法可以有效检测单抗SIBP-A的电荷异构体及等电点, 专属性、稳定性指示性、重复性、中间精密度、线性与范围、准确度、定量限和10 ℃条件下样品的稳定性均良好, 可用于该抗体的放行检测及稳定性检测。

重组人脑利钠肽等电点分析全柱成像毛细管等电聚焦电泳法的建立及验证

目的建立重组人脑利钠肽等电点(isoelectric point,pI)分析的全柱成像毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing-whole column imaging detection,CIEF-WCID)法,并进行验证。方法采用CIEF-WCID法对两性电解质、占位剂、蛋白浓度、聚焦时间等进行优化后,获得检测重组人脑利钠肽的最佳检测条件。对建立的方法进行重复性、样品间精密度和耐用性验证,并对连续生产的3批重组人脑利钠肽进行pI分析。结果选择HR AESlyte 8-10.5为两性电解质,25 mmol/L氢氧化钠为占位剂,以87.5μg/mL为样品检测终浓度,聚焦时间为8 min。同一样品连续进样6次,检测pI相对标准偏差(RSD)为0.1%;6份样品检测pI RSD为0.1%;在样品不同终浓度下,主峰pI RSD为0.1%,不同放置时间下,样品pI RSD为0.1%,但pI标记物不可随意更改。连续3批重组人脑利钠肽样品pI均可检出。结论建立的重组人脑利钠肽pI分析的CIEF-WCID法,重复性好、精密度高,可用于重组人脑利钠肽后续的质量控制。

成像毛细管等电聚焦电泳测定单抗等电点的若干影响因素

目的:评价尿素、聚焦时间、pI标记物3个因素对成像毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)测定抗HER2单抗、抗VEGF单抗主峰等电点结果的影响。方法:应用iCIEF技术,通过添加尿素(2 mol·L^(-1)),改变聚焦时间(6、8、10 min)和pI标记物的数量(2个/6个),对2种单抗制品主峰等电点进行测定。结果:抗HER2单抗使用6个pI标记物,添加终浓度2 mol·L^(-1)的尿素,聚焦时间6、8、10 min,主峰等电点分别为9.01±0.00、9.02±0.01、9.06±0.01;使用6个pI标记物,不添加尿素,聚焦时间6、8、10 min,主峰等电点分别为9.07±0.01、9.08±0.01、9.09±0.01;使用2个pI标记物,主峰等电点范围为9.00～9.14(含尿素)、9.04～9.17(不含尿素)。抗VEGF单抗使用6个pI标记物,添加终浓度2 mol·L^(-1)的尿素,聚焦时间6、8、10 min,主峰等电点分别为8.32±0.00、8.35±0.00、8.35±0.07;使用6个pI标记物,不添加尿素,聚焦时间6、8、10 min,主峰等电点分别为8.39±0.01、8.39±0.02、8.41±0.01;使用2个pI标记物,主峰等电点范围为8.26～8.48(含尿素)、8.34～8.49(不含尿素)。结论:使用iCIEF评价所选单抗等电点时,尿素、聚焦时间两因素对等电点的计算结果影响较小,pI标记物的选择对等电点的计算结果影响明显。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析重组蛋白质药物电荷异质性

目的 分析德谷胰岛素、苏金单抗、阿柏西普和重组人生长激素4种重组蛋白质药物的电荷异质性,为其质量检控提供可靠且快速的分析方法。方法 利用iCE3全柱成像毛细管等电聚焦电泳(imaged capillary isoelectric focusing,iCIEF)分析仪对待测重组蛋白质药物进行检测,将待测样品与载体两性电解质按一定比例混合,在1 500~3 000 V聚焦条件下进行检测。结果 德谷胰岛素等电聚焦电泳图为单峰,等电点平均值为5.25。苏金单抗共检测到4个等电点,其中等电点8.66为主峰,占总峰面积的67.78%。阿柏西普共检测到12个等电点,有6个等电点的峰面积占总峰面积>10%,RSD均<0.10%。重组人生长激素共有3个等电点,其中等电点5.45为主峰占总峰面积的87.60%。结论 利用iCIEF技术能够有效检测德谷胰岛素、苏金单抗、阿柏西普和重组人生长激素的电荷异质性。该方法对4种蛋白质药物的质量检控具有重要意义。

人生长激素Fc融合蛋白电荷异质性全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析方法的建立及验证

目的建立全柱成像毛细管等电聚焦电泳(image capillary isoelectric focusing,iCIEF)方法分析重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)Fc融合蛋白(Fc-rhGH)的电荷异质性,并对方法进行验证。方法通过对目标蛋白浓度、助溶剂(尿素)浓度、聚焦时间的优化建立Fc-rhGH的iCIEF分析方法。采用该方法与传统平板等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)同时分析目标蛋白,并比较分析结果;对建立的方法进行特异性、准确性、精密性、定量限(limit of quantitation,LOQ)、耐用性验证。结果优化后的方法为采用8 mol/L尿素、0.35%甲基纤维素(methyl cellulose,MC)、4%两性电解质、0.5%等电点标记物混合溶液为样品缓冲液,聚焦条件为:1500 V 1 min,3000 V 5.5 min。IEF不适用于分析Fc-rhGH原液的电荷异质性。采用优化的iCIEF进行分析,目标蛋白能明显区别于非相关蛋白,且空白试剂基线平稳;准确性验证回收率在90%~110%之间,线性范围为0.25~0.75 mg/mL(目标上样量的50%~150%);重复性验证中各异构体pI的RSD均小于0.3%,峰面积百分比RSD均小于5%;定量限为0.04 mg/mL;方法的样品保存时间耐用性、两性电解质pharmalyte 3-10耐用性和MC耐用性良好。采用该方法分析Fc-rhGH理化对照品的电荷异质性,可有效分离对照品的8个电荷异质体,pI范围在5.9~6.4。结论建立的iCIEF法具有良好的特异性、准确性、精密性、耐用性,比传统平板IEF更适合高效分析Fc-rhGH的电荷异质性,对Fc-rhGH及其他Fc融合蛋白的质量控制具有重要意义。

重组人肠道病毒71型病毒样颗粒等电点全柱成像毛细管等电聚焦电泳测定方法的建立及验证

目的建立重组人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)等电点(isoelectric point,pI)全柱成像毛细管等电聚焦电泳(whole column imaging detection-capillary isoelectric focusing,WCID-CIEF)测定方法,并进行验证。方法采用WCID-CIEF测定重组人EV71 VLPs的pI,对WCID-CIEF的聚焦时间和尿素浓度进行优化,并对方法的专属性、准确度、重复性和中间精密度进行验证。结果选择3000 V聚焦5 min作为WCIDCIEF的聚焦条件,样品处理时不添加尿素。空白缓冲液对重组人EV71 VLPs pI的测定无干扰;WCID-CIEF分别重复测定pI marker 5.85和pI marker 7.05样品6次的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为0.18%和0.06%;重复测定6次重组人EV71 VLPs pI的RSD为0.08%;不同实验人员在不同日期重复测定12次重组人EV71 VLPs pI的RSD为0.14%。结论WCID-CIEF测定重组人EV71 VLPs pI的专属性、准确度、重复性和中间精密度均良好,该方法快速、准确,可用于重组人EV71 VLPs的质量评价。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳法评价IL-15融和蛋白的电荷异质性

目的:建立全柱成像毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing-whole column imaging detection,c IEF-WCID)方法评价白细胞介素-15(IL-15)融和蛋白的电荷异质性。方法:通过比较5种不同的两性电解质,以及不同尿素浓度(0,3,6和8 mol·L-1)对实验结果的影响,优化建立了IL-15融和蛋白的全柱成像毛细管等电聚焦电泳方法。具体方法为采用3 mol·L-1尿素、0.35%甲基纤维素、4%两性电解质混合溶液作为样品缓冲液,聚焦电压为3 k V,预聚焦时间1 min,聚焦时间7 min。结果:利用新建方法测定了IL-15融和蛋白的等电点范围为6.00～6.71,分离检测到12个异构体,重复性实验中各异构体的峰面积百分比RSD为0.7%～7.4%,等电点RSD为0.0%～0.1%;稳定性实验中各异构体峰面积百分比的RSD为1.5%～10.5%,等电点RSD为0.0%～0.3%;3个不同批次IL-15融和蛋白的各异构体峰面积百分比和等电点基本一致。去N-糖基化及去唾液酸化实验结果表明,IL-15融和蛋白的电荷异构体主要是由N-糖基化不同产生,而酸性端异构体是由于唾液酸化程度不同产生的。结论:研究建立的全柱成像毛细管等电聚焦电泳方法可以有效分离IL-15融和蛋白的12种异构体,糖基化尤其是唾液酸化是引起电荷异质性的主要原因,新建方法对IL-15融和蛋白的质量控制有重要意义。

成像毛细管等电聚焦电泳分析单克隆抗体电荷异质性的方法学验证及系统适用性对照品的制备

目的:采用成像毛细管等电聚焦电泳(imaging capillary electrofocusing electrophoresis,iCIEF)分析单抗的电荷异质性,组织国内多家质控实验室对该方法进行验证;制备用于iCIEF法的系统适用性对照品。方法:邀请19个质控实验室,应用3种品牌(4种型号)的iCIEF设备进行方法学的预验证,确定该方法的关键试剂、仪器参数设置、数据分析要点等;依据ICH_Q2_R1指导原则、2015年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)通则9101制定方法学验证方案,邀请11个质控实验室参加验证;制备基于iCIEF法的系统适用性对照品并利用SEC-HPLC、IEC-HPLC、非还原CE-SDS进行稳定性评价。结果:预验证结果显示:等电点标记物(pI Marker)为关键试剂;不同品牌、型号的iCIEF检测设备参数设置无需统一;数据处理可采用自动积分、手动积分相结合的形式。验证结果:完成了该方法的特异性、准确度、精密度、线性及其范围、耐用性、定量下限的评价;制备了iCIEF法的系统适用性对照品,并进行了加速及长期稳定性评价,制定了相应的合格标准。结论:首次组织了iCIEF的方法学验证,为《中国药典》标准提高提供方法学验证依据,为该方法制备了系统适用性对照品。

重组白介素-15融合蛋白成像毛细管等电聚焦电泳谱图分析

目的通过对成像毛细管等电聚焦电泳谱图分析探讨重组白介素-15融合蛋白糖链类型和构成比例。方法通过建立相应的数学模型,分析重组白介素-15融合蛋白的等电聚焦电泳检测谱图、去唾液酸等电聚焦电泳检测谱图和去N糖链等电聚焦电泳检测谱图,并根据各峰面积和等电点的相互关系,用最小二乘法进行组成拟合分析,明确峰面积和等电点分布相互关系。结果确认间隔1个峰模型的合理性,并根据该模型获得一系列基础相关数据,包括该蛋白的表观m值25.53个基准(R);该蛋白的表观n值28.83R;唾液酸的表观m值0.86(0.855)R,表观n值0.12(0.119)R;N乙酰氨基葡萄糖(未区分与N乙酰半乳糖胺的不同)表观n值0.06(0.061)R;去N糖链后形成的羧基表观m值0.19(0.186)R。该蛋白质糖构成的相关信息,包括唾液酸化度为;摩尔比约1.83;蛋白原型占比约8.3%、含N糖链单修饰占比约19.8%、含N糖链双修饰约28.4%、含N糖链三修饰占比约23.7%;带唾液酸O糖链修饰占比19.8%;主要糖型为G0(海藻糖F)、G1(F)、G2(F)、G1A1(F)和G2A1(F)。结论糖链的结构复杂,但也有一定重复性和规律性,希望通过本实验的研究,可以快速勾勒出糖蛋白糖链轮廓,增进对糖蛋白认识和对蛋白相互作用的研究。

成像毛细管等电聚焦技术分析重组人促红素异质性

目的:应用成像毛细管等电聚焦分析重组人促红素(rhEPO)的异构体和等电点。方法:首先对成像毛细管等电聚焦电泳技术进行了条件优化,并用优化的方法分析了rhEPO候选国家理化标准品和来自不同生产企业的10批rhEPO产品。根据成像毛细管等电聚焦电泳分析结果和体内生物学活性结果进一步分析了rhEPO糖链异构体与体内比活性的相关性。结果:优化的成像毛细管等电聚焦电泳技术可获得蛋白特异性图谱,可较好地分析重组人促红素的异构体和等电点。通过统计分析表明,成像毛细管等电聚焦电泳分析rhEPO的第2、3和4峰含量和体内生物学比活性之间存在正相关,第1和第6峰含量和体内比活性之间存在负相关。结论:成像毛细管等电聚焦技术能够分析重组人促红素的异构体和等电点,相关性分析显示异构体的组成与体内比活性相关,异质性分析在重组人促红素的质量控制中具有重要意义。

两种毛细管电泳方法分析重组人促红素异构体含量的比较

目的全柱成像毛细管等电聚焦电泳(whole column imaging detection-capillary isoelectric focusing electrophoresis,WCID-CIEF)及毛细管区带电泳法(capillary zone electrophoresis,CZE)检测分析重组人促红素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)异构体含量。方法 5批rhEPO原液同时经WCID-CIEF法(采用4 mol/L尿素,0. 35%甲基纤维素,4%两性电解质混合溶液作为样品缓冲液,聚焦电压为3 k V,预聚焦时间1 min,聚焦时间7 min,成像波长280 nm)及CZE法(采用0. 01 mol/L NaCl、tricine、NaAC和7 mol/L Urea及2. 5 mmol/L腐胺混合溶液作为电泳缓冲液,pH 5. 55,进样压力3. 45 kPa,进样时间10 s,分离电压15. 4 kV,分离时间80 min,检测波长214 nm)检测分析异构体含量。结果 WCID-CIEF及CZE法测定5批rhEPO原液均有5~8条异构体条带,异构体含量差异无统计学意义(P> 0. 05),具有明显的相关性(r为0. 999),各峰面积占比相差总和小于3%。结论虽然WCIDCIEF谱图及CZE谱图的含义略有不同,但两种毛细管电泳方法的分析结果基本相同,均可满足rhEPO异构体的质量控质需求。