旋毛虫成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1的克隆与表达

目的 克隆和表达旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫编码 3 1kDa抗原的结构基因 (TspE1)。 方法 大鼠感染旋毛虫后第 17天收集成囊前期幼虫 ,提取虫体的总RNA。通过RT PCR特异性扩增目的基因 ,构建重组质粒pUC18 Ts HN3 ,将重组质粒 pUC18 Ts HN3中的目的基因亚克隆入原核表达载体pGEMEX 1,构建重组子 pGEMEX 1 Ts HN3 ,经IPTG诱导 ,在E .coliJM 10 9(DE3 )中表达。对表达产物进行SDS PAGE分析和Westernblotting鉴定。 结果 SDS PAGE显示目的基因在大肠杆菌中获得高效表达 ,重组蛋白的分子量为 3 1kDa ,以诱导 4h时表达量最多。薄层凝胶光密度扫描分析结果显示 ,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的 2 6%。Westernblotting证实 ,融合蛋白条带能被感染旋毛虫的大鼠血清及旋毛虫病患者血清识别。 结论 旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1克隆和原核表达成功。

肉类中旋毛虫成囊前期幼虫检验方法及其影响因素

目的观察人工消化法(artificial digestion method)和贝氏法(Baermann's technique)检验肉类中旋毛虫成囊前期幼虫(pre-encapsulated larvae,PEL)的效果及其影响因素。方法将45只小鼠随机分为3组(每组15只),分别经口感染20、10、5条旋毛虫肌幼虫,感染后18d剖杀,将3组小鼠肌肉剪碎后,分别应用国际旋毛虫病委员会(International Commis-sion on Trichinellosis,ICT)推荐的消化法(简称ICT-消化法)、国家标准-猪旋毛虫病诊断技术(GB/T186452-2000)中规定的消化法(简称国标-消化法)及贝氏法进行PEL的检验。结果ICT-消化法、国标-消化法与贝氏法对感染20条旋毛虫幼虫的小鼠肌肉中PEL的检出率均为100%(15/15)(χ220=0.000,P>0.05);感染10条幼虫小鼠肌肉,3种方法的PEL检出率分别为93.33%(14/15),93.33%(14/15)及100%(15/15)(χ120=1.645,P>0.05);感染5条幼虫的小鼠肌肉,3种方法的PEL检出率分别为63.33%(19/30),90%(27/30)及100%(30/30)(χ52=18.866,P<0.05)。感染旋毛虫后18d的小鼠肌肉分别消化1h、2h、3h、4h与5h,PEL死亡率分别为8.49%(53/624)、29.77%(181/608)、58.46(449/768)、67.83%(407/600)、84.70%(515/608),PEL的死亡率随消化时间的延长而升高(χ2=920.772,P<0.05)。结论对肉类中旋毛虫成囊前期幼虫检疫时,贝氏法明显优于消化法。

旋毛虫成囊前期幼虫抗原的分析与诊断价值的研究

目的研究旋毛虫成囊前期幼虫抗原（pre－encystedlarvaantigens，PELA）的组分和诊断价值。方法应用免疫印迹对比分析PELA和成囊幼虫抗原（ELA）的组分和它们对人及大民旋毛虫病诊断的敏感性和特异性。结果PELA有3条抗原带（分子量分别为：15、17和129kD）与ELA明显不同；对于感染旋毛虫的大鼠，PELA的首次血清阳性反应出现在感染后第10天，而ELA则在感染后第14天，大鼠抗PELA血清抗体出现较早（P＜0．01）；对22份旋毛虫病人血清，PELA的阳性率为100％，ELA为72．7％，差异具有显著性（P＜0．05）；除1例鞭虫病人外，其它寄生虫病入及健康人血清，两种抗原均呈阴性反应，两种抗原的特异性无显著性差异（P＞0．05）。结论PELA比ELA对早期旋毛虫病的诊断著有更大的价值。

旋毛虫成囊前期幼虫编码31kDa抗原基因的分子克隆及序列分析

目的 克隆旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原基因 (TspE1)片段 ,并测定其基因序列 ,以了解该基因序列与已报道虫株的差异。方法 根据TspE1基因已知序列设计合成一对引物 ,采用RT -PCR技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因 ,PCR产物经纯化后用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切 ,定向克隆入pC18质粒 ,转化大肠杆菌JM10 9;重组质粒用BamHⅠ +HindⅢ酶切及PCR扩增鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定 ,应用DNASIS软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果 RT -PCR扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因 (约 870bp) ,EcoRⅠ酶切鉴定正确 ;筛选出 7个阳性克隆 ,对目的基因的测序结果显示有 5种类型 ,但都与GenBank中的TspE1基因序列及由其推测的氨基酸序列有较高同源性 ,尤其是Ts HN3核苷酸及氨基酸序列同源性分别达 99 6 %和 98 9% ;TspE1基因中可能存在 7个抗原表位。 结论 应用RT -PCR技术扩增出旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原结构基因 ,证实TspE1基因在成囊前期幼虫已有表达 ;

旋毛虫不同隔离种成囊前期幼虫49ku ES抗原基因的克隆与序列分析

根据Gen Bank中已发表的序列(M64242)为参考设计引物,用RT-PCR方法从6个旋毛虫隔离种的成囊前期幼虫中扩增出了49 ku ES抗原基因,将目的基因定向克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌TG1。用PCR、限制性内切酶EcoR I和BamHI进行单、双酶切鉴定,阳性质粒测序。成功克隆了6个旋毛虫隔离种成囊前期幼虫49 ku ES抗原基因,序列分析结果显示:49 kuES抗原基因的大小为948 bp,基因的保守性很强,序列同源性比较高,不同隔离种之间的差异很小。

人工消化法与镜检法检验旋毛虫成囊前期幼虫的效果比较

〔目的〕观察镜检法与人工消化法对旋毛虫成囊前期幼虫的检查效果。〔方法〕将10只雌性昆明小鼠随机分为2组,每组5只。1组,每鼠经口感染50条旋毛虫肌幼虫,感染18d剖杀;2组,每鼠经口感染50条旋毛虫肌幼虫,感染20d剖杀。镜检法、人工消化法检查膈肌中的幼虫。〔结果〕镜检法检查,1组、2组膈肌幼虫检出率均为100%;人工消化法检查,1组、2组膈肌幼虫检出率均为100%。1组膈肌幼虫每克虫荷均数,人工消化法显著高于镜检法(t=4.66,P<0.01);2组膈肌幼虫每克虫荷均数,人工消化法高于镜检法(t=3.59,P<0.05)。〔结论〕旋毛虫成囊前期幼虫检测,人工消化法优于镜检法。

旋毛虫成囊前期幼虫收集方法的研究

为了分析旋毛虫成囊前期幼虫（ＰＥＬ）抗原以寻找更有效的旋毛虫病诊断方法，本实验国内首次对ＰＥＬ的收集方法进行了研究。在贝氏法原理的基础上，分别采用了１６０目、２００目、２４０目和２８０目４种分样筛以及布袋收集ＰＥＬ，并观测了ＰＥＬ的数量和纯度。结果表明：在４种分样筛和各种收集时间中，用２４０目分样筛收集３ｈ为比较理想的实验条件，在此条件下能够得到大量纯度较高的ＰＥＬ虫体；另外，用棉布袋比用分样筛的收集效果更好。在收集２．５ｈ时用２４０目分样筛得到的虫体数量比用棉布袋多（ｐ＜０．０５），但纯度较低；在收集３ｈ以后，用这两种方法得到的虫体数量相近（Ｐ＞０．０５）。

旋毛虫成囊前期幼虫感染性观察

目的观察旋毛虫成囊前期幼虫的感染性。方法将80只雄性昆明小鼠随机分成8组,每只感染300条旋毛虫肌幼虫,感染后14～21d每天剖杀1组,将小鼠膈肌(即含9～16日龄的成囊前期幼虫)分别再喂饲10只小鼠:同时将贝氏法收集的9～16日龄的幼虫用灌胃法感染10只小鼠(每只300条)。感染后42 d将2种方法感染的小鼠剖杀,分别剪碎肌肉,人工消化后收集并计数旋毛虫肌幼虫。光学显微镜下观察不同日龄幼虫的形态并测量其长度。结果旋毛虫9～12日龄幼虫2种方法感染的小鼠均未检获肌幼虫;13～16日龄幼虫膈肌喂饲法小鼠的感染率均为100%,幼虫灌胃法对小鼠的感染率分别为30%、30%、40%和40%。幼虫日龄与喂饲法在感染小鼠后42d收集的肌幼虫数呈相关性(r=0.939,P<0.05)。旋毛虫9～16日龄幼虫长度随幼虫日龄的延长而增大,9日龄幼多呈腊肠状,未见虫体活幼;12日龄幼虫多呈卷曲状,可见缓慢蠕动;15日龄幼虫呈明显的卷曲状,幼虫周围已形成明显的囊包,可见虫体明显活动。结论旋毛虫感染后18d的成囊前期幼虫(13日龄)对新宿主具有感染性,幼虫的感染性与长度随着日龄的延长而增大。

人工消化法对旋毛虫成囊前期幼虫感染性的影响

[目的]观察人工消化法对旋毛虫成囊前期幼虫感染性的影响。[方法]将感染300条肌幼虫的小鼠19 d后剖杀,应用人工消化法分别消化30、60、90 min,收集成囊前期幼虫;15只雌性昆明小鼠随机分为消化30、60、90 min组,每组5只。收集的成囊前期幼虫分别感染3组小鼠,每鼠经口感染300条旋毛虫肌幼虫,感染36 d剖杀,膈肌压片镜检囊包、鼠体肌肉人工消化收集幼虫。[结果]膈肌压片镜检囊包、鼠体肌肉人工消化收集幼虫,检出率均为100%。消化30、60、90 min组,每克膈肌虫荷均数差异有非常显著性(消化90 min组与消化30 min组q=5.59,消化90 min组与消化60 min组q=5.18,P<0.01);消化30、60、90 min组,每克鼠体肌肉虫荷均数差异均无显著性(消化90 min组与消化30 min组q=2.89,消化90 min组与消化60 min组q=2.76,P>0.05)。[结论]发育阶段和人工消化法的消化时间对成囊前期幼虫的感染性有较大影响。

旋毛虫成囊前期幼虫的感染性及影响因素的实验观察

[目的]观察旋毛虫成囊前期幼虫的感染性及影响因素。[方法]80只小鼠随机均分为8组,每组10只,其中虫种组4组(15~18 d组)、灌胃感染组4组(15~18 d组)。虫种组4组小鼠,每鼠经口感染300条旋毛虫肌幼虫,感染后15~18 d每天剖杀1组,剪取每只小鼠的部分腹肌(5 mm×5 mm)制作染色标本,然后将小鼠的剩余肌肉剪碎,人工消化收集成囊前期幼虫;感染灌胃组(15~18 d)组的每只阴性小鼠,每鼠经口感染300条旋毛虫成囊前期幼虫,感染36 d剖杀,膈肌压片镜检囊包,鼠体肌肉人工消化收集幼虫。[结果]感染17 d染色标本显示囊包雏形形成。小鼠感染36 d后,17 d组、18 d组,膈肌检出囊包;鼠体肌肉人工消化检出幼虫。[结论]旋毛虫感染小鼠后第17 d开始具有感染性,旋毛虫的感染性与幼虫及囊包的发育有密切关系。

旋毛虫成囊前期幼虫排泄分泌抗原的研究进展

在旋毛虫感染过程中,成囊前期幼虫(PEL)是旋毛虫侵入宿主肌肉的侵入期。旋毛虫PEL比成囊期幼虫(EL)在宿主体内约早2周出现。成囊前期幼虫抗原(PELA)对旋毛虫病的早期免疫学诊断具有较高的敏感性。而旋毛虫排泄分泌抗原具双重免疫功能,即有良好的抗原性和免疫原性。因此,本文就旋毛虫成囊前期幼虫ES抗原研究进展做一综述。

旋毛虫成囊前期幼虫的收集

目的探索旋毛虫成囊前期幼虫的收集时间与方法。方法20只成年大鼠，每只大鼠经口感染3000条旋毛虫脱囊幼虫，分别于第14、15、16、17、18、19、20天将大鼠处死，用人工胃蛋白酶消化肌肉收集旋毛虫。结果感染后第14、15、16天膈肌均未见旋毛虫，第17、18、19、20天膈肌有旋毛虫的侵入并逐渐增多；第14、15、16天均未收集到旋毛虫，第17、18、19、20天平均每只大鼠分别收集5000、8000、10000、30000条旋毛虫。结论旋毛虫在感染后第20天是旋毛虫成囊前期幼虫收集的最佳时期，人工胃蛋白酶消化肌肉可以收集成囊前期幼虫。

旋毛虫成囊前期幼虫抗原保护性免疫的研究

目的比较旋毛虫成囊前期幼虫虫体抗原、排泄分泌抗原和表面抗原对小鼠产生的免疫保护作用。方法分别用旋毛虫成囊前期幼虫虫体抗原、排泄分泌抗原、表面抗原免疫小鼠,同时设佐剂组和阴性对照组,间隔7d免疫1次,共3次。末次免疫后7d,每只小鼠用200条旋毛虫感染期幼虫经口进行攻击感染。感染后7d和30d分别检查各组小鼠肠道成虫数和肌幼虫数;用ELISA测血清中抗旋毛虫肌幼虫IgG抗体。结果虫体抗原、排泄分泌抗原、表面抗原和佐剂组的成虫减虫率分别为84.89%、89.73%、85.65%、2.57%;肌幼虫减虫率分别为71.71%、80.98%、73.66%、5.60%。排泄分泌抗原组、表面抗原组的成虫减虫率(P均<0.05)及肌幼虫减虫率(P均<0.01)均高于虫体抗原组。各免疫组小鼠血清IgG抗体滴度明显升高,虫体抗原组、排泄分泌抗原组和表面抗原组的几何平均倒数滴度分别为2798.89、3474.51、2984.83,分别为阴性对照组(459.32)的6.09、7.56、6.50倍。结论旋毛虫成囊前期幼虫虫体抗原、排泄分泌抗原和表面抗原均能诱导宿主产生较强的抗攻击感染保护力。成囊前期幼虫的排泄分泌抗原显示出更强的免疫原性。

镜检法与染色法对旋毛虫成囊前幼虫的检查效果比较

〔目的〕观察镜检法与染色法对旋毛虫成囊前幼虫的检查效果。〔方法〕30只雌性昆明小鼠随机分为6组,每组5只。1组:每鼠经口感染20条旋毛虫肌幼虫,感染13 d剖杀;2组:每鼠经口感染20条旋毛虫肌幼虫,感染14 d剖杀;3组:每鼠经口感染20条旋毛虫肌幼虫,感染18 d剖杀;4组:每鼠经口感染100条旋毛虫肌幼虫,感染13 d剖杀;5组:每鼠经口感染100条旋毛虫肌幼虫,感染14 d剖杀;6组:每鼠经口感染100条旋毛虫肌幼虫,感染18 d剖杀。镜检法、染色法检查膈肌、腹肌中的幼虫。〔结果〕镜检法检查:1组、2组、4组、5组均未检出幼虫;3组膈肌、腹肌幼虫检出率分别为60%、40%;6组膈肌、腹肌幼虫检出率均为100%。染色法检查:1组未检出幼虫;2组、3组、4组、5组、6组小鼠膈肌幼虫检出率分别为60%、100%、80%、100%、100%;腹肌检出率分别为40%、100%、80%、80%、100%。3组染色法膈肌幼虫每克虫荷均数高于腹肌(膈与腹染色q3=3.42,P<0.05);6组染色法膈肌幼虫每克虫荷均数显著高于腹肌(膈与腹染色q6=7.63,P<0.01);3组、6组膈肌幼虫每克虫荷均数,染色法均显著高于镜检法(膈镜检与染色q3=5.24,q6=8.90,P<0.01);6组腹肌幼虫每克虫荷均数,染色法高于镜检法(腹镜检与染色q6=4.17,P<0.05)。〔结论〕旋毛虫感染早期的成囊前幼虫病原学检查结果,与感染数量、检查方法和取材部位均有关。感染较重的宿主,其寄生幼虫在肌细胞中出现时间,早于感染较轻的宿主;染色法优于镜检法;膈肌检出率高于腹肌。

镜检法与贝氏法对肉类中旋毛虫成囊前幼虫的检验效果

目的观察镜检法(trichinelloscopy)与贝氏法(Baermann’s technique)对肉类中旋毛虫成囊前幼虫(pre-encap-sulated larvae,PEL)检验的效果。方法将80只昆明小鼠随机分为8组(每组10只),每只感染旋毛虫肌幼虫300条,感染后14～21d每天剖杀1组,应用贝氏法检查小鼠肌肉中的PEL(9～16日龄),用镜检法检查膈肌中的PEL,用ELISA检测鼠血清抗旋毛虫抗体。另取12只小鼠,用于观察消化法对旋毛虫感染后17～19d(12～14日龄)PEL存活率的影响。结果小鼠感染旋毛虫后14和15d镜检法幼虫检出率分别为50.0%和89.0%,感染后16～21d检出率均为100%。感染后14～21d贝氏法的检出率均为100%;ELISA检测血清抗体阳性率为11.1%～40.0%。感染后14d贝氏法的PEL检出率与镜检法比较差异有统计学意义(χ2=5.333,P<0.05);观察期间ELISA检测的抗体阳性率均显著低于镜检法和贝氏法的幼虫检出率(χ2=18.9,P<0.05)。感染后17～19d,小鼠肌肉消化4h的幼虫存活率均明显低于消化1h的存活率(χ127=117.56,χ128=37.48,χ219=96.73,P均<0.05)。结论旋毛虫感染后17～19d的成囊前幼虫不能完全抵抗胃蛋白酶的消化作用;对肉类中旋毛虫成囊前幼虫的检疫效果,贝氏法优于镜检法。

旋毛虫河南株TspE1基因克隆及多态性分析

目的:构建旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码相对分子质量为31 000的蛋白抗原结构基因(TspE1)的重组质粒(pUC18－TspE1),测定TspE1基因序列,分析旋毛虫河南株的基因多态性。方法:根据TspE1基因已知序列设计合成一对引物,采用RT-PCR技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因,PCR产物经纯化后用BamHI、HindⅢ进行双酶切,定向克隆人 pUC18质粒,转化大肠杆菌JM109;重组质粒用 BamHI+HindⅢ 酶切及 PCR扩增鉴定。用 Sanger双脱氧链终止法进行 DNA序列测定,应用 DNASIS软件进行同源性比较。结果:RT－PCR扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因(871 bp),EcoR I 酶切鉴定正确;筛选出 7个阳性克隆,对目的基因的测序结果显示旋毛虫河南株TspE1基因有5种类型,但都与GenBank中的TspE1基因序列及由其推测的氨基酸序列不完全相同。结论:应用RT－PCR技术扩增出旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码相对分子质量为31 000的抗原结构基因．证实TspE1基因在成囊前期幼虫已有表达,结果还提示旋毛虫河南株可能存在有基因多态性。

妊娠对小鼠旋毛虫感染免疫应答的影响

目的研究妊娠对小鼠旋毛虫感染免疫应答的影响。方法6只孕鼠分别经口感染300条旋毛虫肌幼虫,ELISA检测感染后不同时间血清抗体水平。感染后6周剖杀,消化全身肌肉计算每克肌肉虫荷(lpg)。测定孕鼠感染后1～4周血清介导的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)对成囊前期幼虫(PEL)的杀伤作用。观察孕鼠感染旋毛虫后第6、8和12天的肠道虫荷及雌虫体外生殖力指数。对6只处女鼠肌肉注射孕酮,观察其感染旋毛虫后6周的血清抗体水平与肌肉虫荷。结果孕鼠感染旋毛虫后2周的血清抗体水平(A492=0.113)显著高于未孕鼠(A492=0.078)(F=21.390,P<0.05)。孕鼠感染后6周的每克肌肉虫荷(1251±450)明显低于未孕鼠(2310±1123)(t=2.419,P<0.05)。孕鼠感染后2周血清介导的ADCC导致成囊前期幼虫的死亡率(42.6%)显著高于未孕鼠(26.9%)(F=1.195,P<0.05)。孕鼠感染后第6、8和12天的肠道虫荷与未孕鼠相比差异均无统计学意义(Z6=-1.185,Z8=-0.149,Z12=-0.0289,P>0.05),感染后第6和8天孕鼠与未孕鼠的雌虫生殖力指数间的差异亦无统计学意义(Z6=-0.149,Z8=-1.043,P>0.05)。孕酮注射处女鼠感染旋毛虫后6周的血清抗体水平(A492=0.299)显著高于对照组(A492=0.191)(t=2.955,P<0.05),但其每克肌肉虫荷(1457±551)与对照组(1235±439)相比差异无统计学意义(t=0.726,P>0.05)。结论妊娠在小鼠抗旋毛虫感染的免疫应答中具有协同作用,其机制可能与孕鼠感染旋毛虫后早期血清抗体水平升高及其介导的ADCC对成囊前期幼虫的杀伤作用增强等有关。