Axenfeld-Rieger综合征的口腔颌面部临床特点及相关成对同源结构域转录因子2基因突变的致病机制研究进展

Axenfeld-Rieger综合征(ARS)是一类罕见的常染色体显性遗传病,通常具有眼部和口腔颌面部发育缺陷。成对同源结构域转录因子2 (PITX2)是目前已明确的ARS候选致病基因之一,在调控颅面和牙齿发育中扮演重要角色。目前已知的伴有PITX2突变的ARS患者,绝大多数均存在不同程度的口腔和或颌面部发育缺陷。常见的牙齿发育异常为恒牙先天缺失、畸形牙、釉质发育不全等,面部发育异常通常发生在面中部,包括上颌后缩、鼻梁宽平等。本文将对ARS患者的口腔相关临床特点,及相关PITX2突变的致病机制进行综述,为此类患者的临床和分子诊断,以及综合治疗提供更多线索和信息。

神经元素3与成对盒基因4促进胰腺十二指肠同源框蛋白1诱导间充质干细胞向胰腺分泌细胞分化

目的:探索神经元素3(neurogenin 3,NGN3)与成对盒基因4(paired box gene 4,PAX4)对胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreatic and duodenal homeobox factor1,PDX1)驱动间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向胰腺β细胞分化过程中的作用。方法:构建PDX1基因及NGN3与PAX4双基因表达腺病毒,重组腺病毒Adxsi-CMV-PDX1感染诱导MSCs1周后,再行重组腺病毒Adxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4感染诱导MSCs;分别检测PDX1、PAX4、NGN3、NK转录因子相关的2.2(NK transcription factor related,gene family 2,locus2,NKX2.2)、v-maf muscu-loaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B(MafB)、胰岛素(Insulin)、胰高血糖素(Glucagon)多种胰腺分泌细胞相关分子表达情况。结果:成功构建腺病毒Adxsi-CMV-PDX1与Adxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4;MSCs经Adxsi-CMV-PDX1与Adxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4分步诱导后,免疫细胞化学与间接荧光检测显示PDX1、NGN3与PAX4因子在细胞核内稳定表达;重组腺病毒稳定转染5 d后,细胞开始变圆并集聚成团,用双硫腙(dithizone,DTZ)染色细胞质呈亮红色;细胞经诱导1周后,用RT-PCR检测到神经源分化因子1(neurogenic differentiation 1,NruroD1)与NKX2.2表达,2周后可检测胰岛素/胰岛素原分子;间接荧光检测显示诱导后的细胞先后开始表达NKX2.2、MafB等转录因子与胰岛素/胰岛素原、胰高血糖等胰岛分泌细胞相关分子,但未能检测到v-maf musculoaponeurotic fibro-sarcoma oncogene homolog A(MafA)与C肽分子表达。结论:NGN3与PAX4对PDX1诱导间充质干细胞向胰腺分泌细胞分化具有促进作用。

成对框基因2蛋白在C57BL/6J小鼠脑发育进程中的表达

目的 研究正常C57BL/6J小鼠脑发育进程中的组织形态学变化以及成对框基因2(Pax2)蛋白在胚胎期和出生后脑组织中的表达规律。方法 取C57BL/6J小鼠胚胎期11.5 d、13.5 d、15.5 d的胎鼠头部和胚胎期17.5 d、出生后0 d、7 d、14 d和30 d小鼠的全脑组织进行石蜡包埋,连续矢状位切片后进行HE染色和免疫组织化学染色。结果 胚胎期11.5d可见小鼠完整的5个脑泡结构,15.5 d大脑皮质出现5层结构,小脑皮质外颗粒层明显可见。出生后各脑区按照时空顺序继续发育,到P30大脑皮质和小脑皮质均发育成熟出现典型的结构特征。Pax2蛋白在脑组织中的表达主要定位于细胞核和神经纤维上,在胚胎期的表达主要集中在脑桥延髓部位且呈弥漫性表达,E13.5达到高峰,出生后在脑桥延髓的表达逐渐减弱,但在小脑中的表达较胚胎期增强;E13.5时在小脑内开始少量表达,P7时达到高峰,P14后表达量逐渐降低;Pax2蛋白在外颗粒层中于E17.5时开始表达,出生后主要在内颗粒层和髓质中强烈表达,到P30时表达减弱,仅分布在内颗粒层中。结论 小鼠脑发育在一定的时空顺序下,经历了一个复杂的过程。Pax2蛋白在小鼠脑组织中的表达呈现出一定的时空变化规律,可能参与小鼠脑桥延髓早期区域化的建立和小脑的发育过程。

利用CRISPR/Cas9技术制备成对框基因2敲除小鼠

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/重组CRISPR相关核酸酶9(Cas9)技术双切口法制备成对框基因2(Pax2)敲除小鼠,为探讨Pax2基因在多个系统发育的作用提供动物模型。方法根据Pax2基因序列设计sgRNA,设计出的sgRNA和Cas9体外转录后显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,F0代小鼠出生后取其基因DNA测序鉴定基因型。共获得8只F0代小鼠,使敲除成功的F0代小鼠与野生C57BL/6J小鼠交配,获得F1代小鼠,后均采用基因成功敲除的小鼠与C57BL/6J小鼠进行交配,可获得稳定的Pax2基因敲除小鼠。结果成功获得可稳定繁殖的Pax2杂合子基因敲除小鼠,其Pax2基因缺失1628 bp;组织HE染色显示,敲除小鼠的肾小球数量明显减少;Western blotting结果显示,敲除小鼠的肾皮质Pax2蛋白表达较野生型小鼠减少。结论利用CRISPR/Cas9技术可成功构建Pax2杂合子基因敲除小鼠,为进一步研究Pax2基因的作用奠定基础。

成对区控制基因1异常甲基化表达在子宫颈癌诊断中的应用

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染已被公认为子宫颈癌形成病因学中的关键因素，然而流行病学统计表明。绝大多数HPv感染的妇女并不发展成子宫颈癌。说明子宫颈癌发生发展过程中可能还有其它协同因子在发挥重要作用。研究表明，高危型HPV感染、细胞癌基因的激活和抑癌基因的失活均参与了宫颈癌的发生和发展。近年来成对区控制基因1（Paired box，PAX1）的检测开始受到关注。国内学者应用MSR PCR等方法检测宫颈组织PAX1基因甲基化水平。发现PAX1基因在子宫颈鳞状细胞癌标本中有着异常甲基化。PAX1基因异常或过度甲基化显示了其作为宫颈癌筛查生物学指标的巨大潜力，将PAX1基因检测纳入当前的筛查方法，其筛查效果可能显著提高。

长期低剂量甲醛染毒对永生化人支气管上皮细胞16HBE部分癌症相关基因启动子区甲基化的影响

目的探讨低剂量甲醛长期染毒对永生化人支气管上皮细胞16HBE癌症相关基因启动子区甲基化水平的影响。方法 16HBE细胞每周染毒甲醛10μmol·L-1 24h,连续24周,分别于染毒3,6,9,12,15,18,21和24周提取RNA或DNA,应用DNA甲基化相关酶消化结合荧光定量PCR的方法观察24个癌症相关基因启动子区甲基化水平的变化;应用荧光定量PCR的方法观察染毒对亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)和成对盒基因(PAX5)基因表达的时间-效应关系。结果与正常对照组16HBE细胞相比,甲醛染毒细胞4个基因甲基化水平显著改变,2个基因甲基化程度升高,2个基因甲基化程度降低;而在阳性对照人非小细胞癌上皮细胞A549细胞中有9个基因甲基化水平发生显著变化,其中3个基因甲基化水平升高,6个基因甲基化水平降低;甲醛染毒16HBE细胞和A549细胞MTHFR基因均发生高甲基化改变,PAX5基因均出现低甲基化改变。与正常对照组相比,甲醛染毒24周的细胞中,MTHFR基因启动子区甲基化水平升高,非甲基化DNA含量降低58.2%,而PAX5基因启动子区甲基化水平降低,非甲基化DNA含量升高27.1%;随着甲醛染毒时间延长,MTHFR基因表达逐渐降低,而PAX5基因表达逐渐升高。结论低剂量甲醛长期染毒可以使MTHFR基因和PAX5基因启动子区甲基化水平异常,进而引起基因表达水平改变。

早发2型糖尿病和糖尿病前期患者Pax6基因突变/变异的筛查与临床特点研究

目的在早发、呈常染色体显性遗传的2型糖尿病及糖尿病前期人群中筛查成对盒6(Pax6)基因外显子及外显子-内含子拼接区的突变/变异,研究其临床特点。方法以早发2型糖尿病患者(n=96)、糖尿病前期患者(n=26)和非糖尿病对照者(对照组,n=100)为研究对象。应用PCR产物直接测序法对三组人群进行Pax6基因的突变/变异筛查,比较临床特点及突变/变异基因型频率。根据基因型进行再分组,分析临床表型特点。结果在早发2型糖尿病组发现exon 6同义突变Arg67Arg(aga→agg;A→G,99.0%和1.0%);在糖尿病前期组发现exon 7的同义突变Thr166Thr(act→acc;T→C,96.2%和3.8%);在非糖尿病对照组中未发现以上两种突变。早发2型糖尿病组空腹血糖(FPG)和餐后2 h血糖(2hPG)显著高于非糖尿病对照组(P<0.05);而早发糖尿病前期组的2hPG、空腹胰岛素(FINS)和餐后2 h胰岛素(2hINS)显著高于非糖尿病对照组(P<0.05)。与Arg67Arg-AA基因型携带者相比,AG基因型者的2hINS显著降低(P<0.05),空腹C肽(FCP)和餐后2 h C肽(2hCP)及FINS呈下降趋势,FPG及2hPG呈升高趋势。与Thr166Thr-TT基因型携带者相比,TC基因型者2hCP和2hINS显著降低(P<0.05)。结论 Pax6基因的Arg67Arg与Thr166Thr突变可能影响胰岛素基因的转录,导致胰岛素分泌减少所致的糖代谢异常,与早发2型糖尿病以及糖尿病前期的发生和进展有关。

一个单纯性先天缺牙家系的临床及基因突变分析

目的探讨多数牙先天缺失患者的人类成对盒基因(PAX9)和肌节同源盒基因(MSX1)突变位点,为该疾病的病因学研究提供依据。方法对于该例患者与部分正常家庭成员进行口内检查及家系调查,取研究模型测量其牙冠宽度,并与正常值比较。拍摄曲面断层片和头颅侧位片进行头影测量分析,对比颅面形态和错畸形类型及特点。从静脉血中提取DNA,根据PAX9和MSX1的全序列设计引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PAX9基因的外显子1、2、3、4及MSX1基因外显子1、2,而后通过对分段PCR纯化产物的测序,并结合系谱进行突变分析。结果患者伴有牙齿形态畸形,与中国人正常值相比较,牙冠宽度较小。头影测量分析结果提示先证者在骨面型及颌骨形态等方面无明显遗传倾向。基因筛查结果显示先证者及其母亲的PAX9外显子3第718位点上由G变为C,属错义突变,导致与之对应的第240位氨基酸由丙氨酸变为脯氨酸;MSX1未见突变。结论多数牙先天缺失可能与PAX9基因外显子3的第718位点上的错义突变有关。

NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体的构建与表达

目的:运用pADxsi系统构建带人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体。方法:采用基因克隆技术,将目的基因NGN3从pEGFP-N1-NGN3质粒上切下连到pShuttle-GFP-CMV上,替换GFP,得到pShuttle-CMV-NGN3;再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上切下连到系统pShuttle-CMV-NGN3上,得到pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4穿梭质粒;最后将CMV-NGN3/CMV-PAX4从pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架载体上,得到pADxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4病毒质粒,然后在293细胞中进行包装与扩增活性病毒,并进行病毒滴度测定。体外感染人脐带间充质干细胞。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)与免疫印迹(Western blotting)检测目的基因在细胞内的表达情况,免疫细胞化学与间接荧光法检测目的分子在细胞内的定位。结果:酶切鉴定和PCR证明重组人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确;RT-PCR与Western blotting结果显示目的基因在细胞持续稳定表达;间接荧光与免疫化学表明重组腺病毒可高效感染人脐带间充质干细胞,且目的基因特异性地定位于细胞核内。结论:应用重组技术成功构建人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体,且在间充质干细胞内持续而稳定表达。

一个先天缺牙家系的基因突变及病例对照研究

目的探讨非综合征型多数牙先天缺失患者的人类成对盒基因9(PAX9)、同源盒基因1(MSX1)、中轴抑制蛋白2(AXIN2)突变位点,为该疾病的病因学研究提供依据。方法对该例患者及其家庭成员进行全身系统检查、口腔专科检查(含拍摄曲面断层片)及家系调查;抽取外周静脉血,提取基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PAX9基因的外显子1、2、3、4,MSX1基因外显子1、2及AXIN2基因外显子2、3、4、5、6、7、8、9、10、11,通过对分段PCR纯化产物进行测序,并结合系谱图进行基因突变分析。同时,通过病例-对照实验(先天缺牙组50例,健康对照组100例)对突变位点AXIN2G1807C与先天缺牙的相关性进行分析。结果先证者的祖母和外祖父为兄妹关系。口内检查以及曲面断层片发现先证者为无牙牙合,仅见左侧下颌升支处有一阻生牙影像,其余家庭成员牙齿数目发育正常。均未合并其他组织器官的先天发育异常。先证者及部分表型正常者分别发现3个已知突变位点,分别为AXIN2外显子6第1 365位A变为G(rs9915936),外显子7第1 807位G变为C(rs145353986)以及外显子8第2 062位C变为T(p.Leu688Leu)。PAX9、MSX1未见异常。病例组和对照组间AXIN2G1807C的基因频率和基因型频率差异无统计学意义。结论 AXIN2c.2062C>T突变可能是导致中国人群非综合征型多数牙缺失的危险因素之一。AXIN2c.1807G>C与此类疾病之间不存在明显的相关性。

青年人中的成年发病型糖尿病9型诊疗研究进展

青年人中的成年发病型糖尿病(maturity onset diabetes of the young, MODY)是一组罕见的单基因糖尿病,具有发病年龄小、常染色体显性遗传模式的糖尿病家族史和胰岛素非依赖性等典型特征。基因检测对于MODY亚型的诊断至关重要。MODY9是由PAX4基因突变引起的MODY亚型。PAX4基因编码成对盒4蛋白(Paired box 4, PAX4),在胰腺发育过程中对胰岛β细胞的分化和在胰腺成熟后对胰岛β细胞的存活和增殖至关重要。PAX4突变导致胰岛β细胞功能障碍。目前已发现PAX4多个突变位点,这些突变可导致不同的临床表型。除了典型的MODY临床表现外,MODY9还表现出酮症或酮症酸中毒倾向。MODY9可以通过饮食控制、口服降糖药或胰岛素进行治疗。本综述对MODY9在病因、临床表现、诊断、治疗等方面的研究进展进行总结。同时对PAX4与糖尿病相关的变异位点汇总,探讨PAX4基因突变与糖尿病的关系。

PDXl与PAX4双基因表达腺病毒载体的构建与表达

运用pADxsi系统制备可表达人PDX1与PAX4双基因的重组5型腺病毒。从pEGFP-N1-PDX1质粒上酶切下目的基因PDX1并酶连到腺病毒穿梭质粒pShuttle-EGFP-CMV上,替换EGFP而得到pShuttle-CMV-PDX1;再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上酶切下连到pShuttle-CMV-PDX1的多克隆酶切位点而得到穿梭质粒pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4;双酶切pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4将CMV-PDX1/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架质粒上,得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒质粒,然后在293细胞中进行包装并扩增重组腺病毒,并进行病毒滴度测定;体外感染人间充质干细胞。依据酶切、测序和PCR的结果均证明重组人PDX1与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确;而RTPCR与WB结果也显示目的基因在细胞中稳定表达。应用重组技术成功构建人PDX1与PAX4双基因表达5型腺病毒载体,转录因子PDX1与PAX4在间充质干细胞内稳定表达且定位于细胞核内。

Pdx1激活Ngn3和Pax6诱导iPS细胞向胰岛β细胞分化的实验研究

目的:探讨胰十二指肠同源盒基因-1(Pdx1)在诱导多潜能干细胞(i PSCs)分化为胰岛β细胞中的作用及其机制。方法:体外培养人皮肤成纤维细胞来源的i PSCs,将该i PSCs定向诱导分化20 d;RT-PCR检测胰岛素相关基因的表达情况;比较诱导前后几个重要转录因子的表达情况;Ch IP检测胰岛β细胞发育过程中最重要的转录因子Pdx1结合启动子区域的具体位点。结果:体外成功培养人皮肤来源的i PSCs;胰岛素相关基因Maf A、insulin、Glut2、Nkx6.1、Glucokinase和Tcf1均呈现不同程度的表达增强,并在第20 d时表达基本达到高峰;实验组转录因子Pdx1、Ngn3与Pax6表达较对照组明显增强;Pdx1通过结合Insulin-P、Ngn3-P、Pax6-P区域激活下游基因Ngn3和Pax6。结论:Pdx1激活下游基因Ngn3和Pax6可能是其促进i PSCs定向诱导分化为胰岛β细胞的机制之一。

携带成对盒4基因突变早发糖尿病1例报道并文献复习

目的探讨成对盒4(paired box 4,PAX4)基因突变致早发糖尿病临床特征,进一步提高对该疾病的认识。方法回顾1例携带PAX4基因突变早发糖尿病患者临床资料,并进行文献复习。结果患者,女,25岁,因“乏力、口渴、多饮、多尿40余天,恶心、纳差4 d”入院,诊断“糖尿病酮症酸中毒”,胰岛素自身抗体检测阴性,住院期间应用多种降糖药物治疗,疗效欠佳,胰岛分泌功能衰竭;基因检测PAX4基因外显子5上第192位密码子(CGT)G>A杂合变异,为R192H型。结论对于疑似单基因糖尿病患者,基因测序分析具有重要意义,尤其在诊断和分型方面,准确的基因诊断有助于患者得到更专业的治疗。

MODY 9的研究,认识现状及处理

成对盒基因4（PAX4）是主要在胚胎时期胰腺早期发育阶段，调控胰岛β细胞及其功能发育的重要的调节因子。卵子受精是新生命的开始。临床上为了更好地描述妊娠全过程，将妊娠妇女末次月经日定为妊娠第一天，胎儿娩出Et为妊娠结束，约为40周（280天），对于孕妇常用“月经龄”描述，将妊娠全过程分为妊娠早期（按月经龄12周末以前），第13～17周末为中期妊娠，第28周及以后为晚期妊娠。

利用分子传播网络分析昆明市HIV-1 CRF01_AE毒株流行特点

目的 通过构建昆明市HIV-1 CRF01_AE毒株的分子传播网络,分析其流行特征并观察动态流行趋势,从而为当地制定疫情防控干预措施提供科学依据。方法 选择2015―2021年云南省传染病医院接受治疗的253例昆明市HIV-1 CRF01_AE新发感染患者作为研究对象。运用反转录巢式聚合酶链式反应成功扩增其基因序列,序列比对后导入HyPhy 2.2.4软件进行成对基因距离的计算。运用GraphPad-Prism 8.0软件确定最佳基因距离阈值,使用Cytoscope 3.7.2软件实现网络可视化。运用Network-Analyzer和MCODE(Molecular Complex Detection)工具进行网络特征分析。结果 在0.018最佳基因距离阈值下,253个研究对象中有118个(46.64%)进入网络分析,共形成了38个分子簇,其组成大小从2到17个节点不等。网络集群主要以异性传播(51.78%)和同性传播(37.94%)为主,年龄段主要分布于20~40岁(77.47%)。网络所有节点的总链接数为226,单个节点最高链接数为10。MCODE确定了3种重要的分子簇,3个分子簇分别定义为B、C、D型,B型由17个节点和19链接数组成,为同性传播集群呈低增长状态。C和D型均由5个节点和10链接数组成,为异性传播集群且呈静止状态。结论 昆明市HIV-1 CRF01_AE毒株分子传播网络中的分子簇具有一定特殊性和聚集性。同性传播和异性传播人群已经成为昆明市HIV-1 CRF01_AE毒株感染的两大风险群体,同时两个群体还有发生交叉传播的现象。传播网络中有一个同性传播组成的集群规模较大,其传播风险和活跃度较高,需加强对其监测,并制定针对性的干预措施对集群中的“核心人群”进行防控。

腮腺癌组织PAX2和PAX8表达联合预测其根治术后复发、转移的价值

目的探讨腮腺癌组织成对盒基因2(PAX2)和成对盒基因8(PAX8)表达联合预测其根治术后复发、转移的价值。方法以行腮腺颈联合根治术治疗的腮腺癌患者46例为研究对象。采用免疫组织化学法检测其手术切除腮腺癌组织及癌旁组织中PAX2和PAX8蛋白表达水平。结果腮腺癌组织PAX2和PAX8蛋白阳性表达率分别为76.09%和69.57%,均高于癌旁组织的26.09%和28.26%(P<0.05)。腮腺癌根治术治疗患者随访3年的局部复发率为41.30%,淋巴结转移率为34.78%。且PAX2蛋白阳性表达患者的复发率和转移率均高于其阴性表达患者,PAX8蛋白阳性表达患者的复发率和转移率亦均高于其阴性表达患者(P<0.05)。Logistic回归分析结果显示,腮腺癌组织PAX2和PAX8表达水平与其根治术后复发、转移均密切相关(P<0.05)。腮腺癌组织PAX2和PAX8表达水平预测其术后复发、转移的价值良好,其中以PAX2阳性和PAX8阳性预测其术后复发、转移的价值最优。结论腮腺癌组织PAX2和PAX8表达水平与其根治术后复发、转移等预后情况的密切相关且联合预测其预后的价值良好,联合检测腮腺癌组织PAX2和PAX8蛋白表达可作为腮腺癌根治术预后评估的参考指标。