神经元素3与成对盒基因4促进胰腺十二指肠同源框蛋白1诱导间充质干细胞向胰腺分泌细胞分化

目的:探索神经元素3(neurogenin 3,NGN3)与成对盒基因4(paired box gene 4,PAX4)对胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreatic and duodenal homeobox factor1,PDX1)驱动间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向胰腺β细胞分化过程中的作用。方法:构建PDX1基因及NGN3与PAX4双基因表达腺病毒,重组腺病毒Adxsi-CMV-PDX1感染诱导MSCs1周后,再行重组腺病毒Adxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4感染诱导MSCs;分别检测PDX1、PAX4、NGN3、NK转录因子相关的2.2(NK transcription factor related,gene family 2,locus2,NKX2.2)、v-maf muscu-loaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B(MafB)、胰岛素(Insulin)、胰高血糖素(Glucagon)多种胰腺分泌细胞相关分子表达情况。结果:成功构建腺病毒Adxsi-CMV-PDX1与Adxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4;MSCs经Adxsi-CMV-PDX1与Adxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4分步诱导后,免疫细胞化学与间接荧光检测显示PDX1、NGN3与PAX4因子在细胞核内稳定表达;重组腺病毒稳定转染5 d后,细胞开始变圆并集聚成团,用双硫腙(dithizone,DTZ)染色细胞质呈亮红色;细胞经诱导1周后,用RT-PCR检测到神经源分化因子1(neurogenic differentiation 1,NruroD1)与NKX2.2表达,2周后可检测胰岛素/胰岛素原分子;间接荧光检测显示诱导后的细胞先后开始表达NKX2.2、MafB等转录因子与胰岛素/胰岛素原、胰高血糖等胰岛分泌细胞相关分子,但未能检测到v-maf musculoaponeurotic fibro-sarcoma oncogene homolog A(MafA)与C肽分子表达。结论:NGN3与PAX4对PDX1诱导间充质干细胞向胰腺分泌细胞分化具有促进作用。

携带成对盒4基因突变早发糖尿病1例报道并文献复习

目的探讨成对盒4(paired box 4,PAX4)基因突变致早发糖尿病临床特征,进一步提高对该疾病的认识。方法回顾1例携带PAX4基因突变早发糖尿病患者临床资料,并进行文献复习。结果患者,女,25岁,因“乏力、口渴、多饮、多尿40余天,恶心、纳差4 d”入院,诊断“糖尿病酮症酸中毒”,胰岛素自身抗体检测阴性,住院期间应用多种降糖药物治疗,疗效欠佳,胰岛分泌功能衰竭;基因检测PAX4基因外显子5上第192位密码子(CGT)G>A杂合变异,为R192H型。结论对于疑似单基因糖尿病患者,基因测序分析具有重要意义,尤其在诊断和分型方面,准确的基因诊断有助于患者得到更专业的治疗。

NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体的构建与表达

目的:运用pADxsi系统构建带人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体。方法:采用基因克隆技术,将目的基因NGN3从pEGFP-N1-NGN3质粒上切下连到pShuttle-GFP-CMV上,替换GFP,得到pShuttle-CMV-NGN3;再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上切下连到系统pShuttle-CMV-NGN3上,得到pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4穿梭质粒;最后将CMV-NGN3/CMV-PAX4从pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架载体上,得到pADxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4病毒质粒,然后在293细胞中进行包装与扩增活性病毒,并进行病毒滴度测定。体外感染人脐带间充质干细胞。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)与免疫印迹(Western blotting)检测目的基因在细胞内的表达情况,免疫细胞化学与间接荧光法检测目的分子在细胞内的定位。结果:酶切鉴定和PCR证明重组人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确;RT-PCR与Western blotting结果显示目的基因在细胞持续稳定表达;间接荧光与免疫化学表明重组腺病毒可高效感染人脐带间充质干细胞,且目的基因特异性地定位于细胞核内。结论:应用重组技术成功构建人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体,且在间充质干细胞内持续而稳定表达。

PDXl与PAX4双基因表达腺病毒载体的构建与表达

运用pADxsi系统制备可表达人PDX1与PAX4双基因的重组5型腺病毒。从pEGFP-N1-PDX1质粒上酶切下目的基因PDX1并酶连到腺病毒穿梭质粒pShuttle-EGFP-CMV上,替换EGFP而得到pShuttle-CMV-PDX1;再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上酶切下连到pShuttle-CMV-PDX1的多克隆酶切位点而得到穿梭质粒pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4;双酶切pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4将CMV-PDX1/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架质粒上,得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒质粒,然后在293细胞中进行包装并扩增重组腺病毒,并进行病毒滴度测定;体外感染人间充质干细胞。依据酶切、测序和PCR的结果均证明重组人PDX1与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确;而RTPCR与WB结果也显示目的基因在细胞中稳定表达。应用重组技术成功构建人PDX1与PAX4双基因表达5型腺病毒载体,转录因子PDX1与PAX4在间充质干细胞内稳定表达且定位于细胞核内。

青年人中的成年发病型糖尿病9型诊疗研究进展

青年人中的成年发病型糖尿病(maturity onset diabetes of the young, MODY)是一组罕见的单基因糖尿病,具有发病年龄小、常染色体显性遗传模式的糖尿病家族史和胰岛素非依赖性等典型特征。基因检测对于MODY亚型的诊断至关重要。MODY9是由PAX4基因突变引起的MODY亚型。PAX4基因编码成对盒4蛋白(Paired box 4, PAX4),在胰腺发育过程中对胰岛β细胞的分化和在胰腺成熟后对胰岛β细胞的存活和增殖至关重要。PAX4突变导致胰岛β细胞功能障碍。目前已发现PAX4多个突变位点,这些突变可导致不同的临床表型。除了典型的MODY临床表现外,MODY9还表现出酮症或酮症酸中毒倾向。MODY9可以通过饮食控制、口服降糖药或胰岛素进行治疗。本综述对MODY9在病因、临床表现、诊断、治疗等方面的研究进展进行总结。同时对PAX4与糖尿病相关的变异位点汇总,探讨PAX4基因突变与糖尿病的关系。