简易灌注装置同时提取成年小鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞

目的简化Langendorff灌注装置,并且同时提取成年小鼠心肌细胞(AMCM)和心脏成纤维细胞(AMCF)用于实验。方法采用简易灌注装置进行成年小鼠主动脉逆行灌注,同时提取AMCM和AMCF。对其进行形态学观察,并分别通过L-苯肾上腺素(PE)和转化生长因子(TGF)-β1刺激诱导AMCM肥厚和AMCF向肌成纤维细胞分化,以评估其生物学功能。结果复钙后耐钙杆状AMCM占比(62.65±3.12)%,并且可以在体外培养超过1周,与对照组相比,PE刺激后AMCMβ-肌球蛋白重链、心钠肽蛋白表达水平显著升高(P<0.05),杆状AMCM长宽比显著缩小(P<0.05)。AMCF纯度较高,在体外可以传代3~4次,与对照组相比,TGF-β1刺激后AMCF Collagen I、Collagen III、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平显著升高(P<0.05)和荧光强度显著增强(P<0.05)。结论简易灌注装置可以简单、稳定、高效地同时提取满足实验需求、具备生物学功能的AMCM和AMCF。

成年大鼠心肌细胞的分离和培养

目的:建立获得较高比例的活性成年大鼠心肌细胞的分离和培养方法。方法:Langendorff灌流,胶原酶消化分离钙耐受成年大鼠心肌细胞,加血清培养。光镜观察,结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。结果:分离的活性心肌细胞比率约70%～80%,杆状、横纹清晰。加血清贴壁培养的细胞逐渐发生形态学改变。结论:通过本方法可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离培养。

培养成年大鼠心肌细胞存活的形态标志

目的：通过探寻增加培养成年大鼠心肌细胞存活率以及防止再分化的方法,揭示培养成年大鼠心肌细胞存活的形态标志。方法：采用Langendorff系统灌流心脏,胶原酶消化法分离成年大鼠心肌细胞,分3组进行细胞培养：①基础培养液＋凋亡抑制剂;②基础培养液＋5%胎牛血清;③基础培养液＋5%胎牛血清＋凋亡抑制剂。结果：①培养前3天杆状心肌细胞比例逐渐降低,无血清培养组比血清培养组降低程度大。培养前3天凋亡率逐渐升高,无血清培养组比血清培养组凋亡率高,加入凋亡抑制剂对凋亡率无影响。②有血清培养2~3天的成年大鼠心肌细胞闰盘部位伸出伪足,促使细胞贴壁生长;当培养至第6天时,细胞侧面也伸展出贴壁的伪足,细胞丧失杆状形态,横纹消失。而无血清培养的细胞无伪足生成,随着培养时间增加,细胞末端变圆钝,横纹变模糊。凋亡抑制剂对伪足形成率无影响。③培养存活的成年大鼠心肌细胞骨架重排,发生再分化。④血清培养组细胞胞内核间距离随着培养时间的增加而减小,无血清培养组则保持不变。结论：成年大鼠心肌细胞培养至第2~3天时,闰盘部位形成伪足是细胞存活的形态标志,加入血清是伪足形成的必要条件。

成年小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定

目的：探讨成年小鼠心肌细胞分离培养的方法，评价心肌细胞的存活状况。方法：应用改良Langendorff方法进行成年小鼠心脏灌流，分离并培养心肌细胞，评价杆状心肌细胞的比例变化。台盼蓝染色判定心肌细胞活力，应用毒胡萝卜素（thapsigargin）治疗心肌细胞24h后，WST方法测定细胞生存率。结果：在每个成年小鼠心脏分离了40-60万的心肌细胞，台盼蓝染色结果68％为存活心肌细胞。心肌细胞培养1h、24h及48h后，杆状心肌细胞的比例分别为70％、50％及30％。心肌细胞生存率随着毒胡萝卜素浓度的增加逐渐减低，其中1、5及10μmol／L毒胡萝卜素的生存率明显低于对照组（P〈0、05，P〈0．01）。结论：应用改良Langendorff方法及严格控制心脏灌流培养的条件，可以成功地分离培养成年小鼠心肌细胞，有助于进行细胞分子水平的研究。

成年大鼠心肌细胞的分离和培养技术

目的建立稳定的成年大鼠心肌细胞分离和培养方法,以便进行成年大鼠心肌细胞收缩功能的研究.方法将成年大鼠心脏挂于Langendorff装置上灌流,胶原酶消化分离成年大鼠心肌,无血清悬浮培养心肌细胞.光镜观察,结合形态学和收缩功能评价心肌细胞.结果新分离的心肌细胞的收获量为(4～6)×106个,杆状和圆形,其中长杆状细胞大于75%,横纹清晰,收缩幅度(12.00±2.68)%.无血清培养24h后,细胞保持完整的形态结构,长杆状心肌细胞占总数的70%以上,收缩幅度(11.78±1.59)%,与刚培养时的细胞相比,无显著差别(P＞0.05).结论通过本方法可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离培养.

血管紧张素Ⅱ诱导培养的成年大鼠心肌细胞凋亡及其细胞机制

研究血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎⅡ，ＡｎｇⅡ）诱导培养的成年大鼠心肌细胞（Ａｄｕｌｔｒａｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｍｙ－ｏｃｙｔｅｓ，ＡＲＶＭ）凋亡。酶灌流消化法分离培养ＡＲＶＭ，不同处理后，光镜观察形态改变，琼脂糖凝胶电泳定性分析ＤＮＡ降解程度。结果发现培养的ＡＲＶＭ经１０μｍｏｌ／ＬＡｎｇⅡ处理４８ｈ后，大部分细胞变圆，胞浆浓缩；电泳显示核酸断裂片段“梯形”结构，上述改变在７２ｈ更为明显。上述作用可被氯沙坦、维拉帕米和ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ所取消。结果表明，ＡｎｇⅡ诱导培养的ＡＲＶＭ凋亡由ＡＴ１受体介导。

成年大鼠心肌细胞的分离与培养

目的研究成年大鼠心肌细胞的分离与培养方法。方法成年SD大鼠麻醉后，迅速开胸取心连接于Langendorff装置上进行逆行灌注，用0．06％-0．1％Ⅱ型胶原酶灌注消化分离心肌细胞，采用自然沉降法纯化心肌细胞，用改良M199培养基进行细胞培养。结果本方法可获得60％～85％具有活性的成年大鼠心室肌细胞，每只SD大鼠心脏的细胞产量可达1×10^7个。结论该方法简单、有效，同时具有一定的可控性。

不同培养基对成年大鼠心肌细胞形态、存活率、收缩功能的影响

目的研究不同培养基对成年大鼠心肌细胞形态、存活率和收缩功能的影响。方法本实验采用Langendorff装置行恒流灌流分离成年大鼠心肌细胞,分别用无血清M199、DMEM高糖、DMEM低糖三种培养基培养,比较培养24h和48h的细胞存活率(即杆状率)、形态和单个细胞收缩功能的变化。结果培养24h后,M199培养基中细胞存活率校正值(培养细胞杆状率/刚培养细胞杆状率)明显高于其他两种培养基(P<0.05),细胞平均长度(Length)、细胞缩短率(细胞收缩幅度/细胞原始长度)、达到峰值收缩时间(TTP)、50%舒张时间(R50)、90%舒张时间(R90)亦最接近新鲜分离心肌细胞;培养48h后,M199培养基中细胞Length、TTP、R50、R90各指标均明显优于其他两种培养基(P<0.05)。结论三种培养基培养成年大鼠心肌细胞M199对维持细胞的存活状态、形态和功能的效果最好。

胶原支架上体外三维培养成年大鼠心肌细胞

背景:前期研究中已经在Atelocollagen胶原支架培养出了具有收缩功能的乳鼠心肌细胞。目的:在Atelocollagen胶原支架上三维培养成年大鼠心肌细胞。方法:将成年SD大鼠心肌细胞经消化培养并纯化后,种植到Atelocollagen胶原支架上进行三维培养。应用倒置显微镜动态观察心肌细胞在Atelocollagen胶原支架上的生长状况;对三维培养的心肌细胞块进行冰冻切片,分别进行肌钙蛋白免疫组织化学和免疫荧光显色,对支架上生长的细胞进行鉴定。结果与结论:成年SD大鼠心肌细胞接种12h开始贴附支架生长,24h与支架汇合、紧密黏附,但心肌细胞并不产生自律性搏动,细胞之间夹杂少量崩解的细胞碎片;48h换液后支架网孔中崩解的细胞被换掉,剩下大部分细胞贴附在支架壁边缘生长。苏木精-伊红染色显示培养48h细胞与支架形成复合体。形态学鉴定证明支架网孔中生长的主要是心肌细胞。免疫组织化学和免疫荧光显色均显示在支架内生长的大部分是心肌细胞,并且紧贴支架,生长良好。

成年大鼠心肌细胞分离培养及兴奋-收缩耦联表征

目的比较两种细胞分离液分离成年大鼠心肌细胞,进一步表征成年大鼠心室肌细胞兴奋-收缩耦联。方法 Langendorff装置进行主动脉逆流灌流,分别用两种细胞分离液分离成年大鼠心肌细胞,无血清培养并进行腺病毒感染。显微镜下观察单个心肌细胞的形态学特点,荧光显微镜下检测病毒感染。采用IonOptix仪器检测心肌细胞肌节收缩-舒张指标以及心肌细胞钙离子摄入-排出指标。结果两种分离液均可获得70%横纹清晰的长杆状心肌细胞,培养可存活7 d以上。腺病毒感染48 h,绿色荧光蛋白持续表达7 d以上。分离液一获得的心肌细胞不能很好地随电场刺激产生收缩,分离液二获得的细胞可用于检测兴奋-收缩耦联特性,心肌细胞肌节缩短分数为11.61%±2.15%,舒张时间为(0.177±0.031)s,钙瞬变幅度为30.79%±9.74%,钙瞬变衰减时间为(0.300±0.074)s。结论两种分离液均可用于分离和培养成年大鼠心肌细胞,并用于腺病毒转染等长时程研究。分离液二更适用于检测成年大鼠心肌细胞的兴奋-收缩耦联特性。

成年大鼠心肌细胞分离方法的改良

背景:目前多采用酶解法分离成年大鼠心肌细胞,但在灌流装置、灌流液体和灌流方法等方面的差异较大,且多以单个细胞的急性分离为目的,仅适于进行电生理研究。目的:建立稳定的改良成年SD大鼠心肌细胞分离方法,使之适于进行原代培养和研究。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/09在华中科技大学同济医学院附属同济医院分子心脏病中心完成。材料:8～10周龄雄性SD大鼠30只,由同济医学院实验动物中心提供,Ⅱ型胶原酶、蛋白酶和不含脂肪酸的牛血清白蛋白分别为美国Worthington公司、美国Sigma公司和德国Merck公司产品。方法:SD大鼠麻醉后,快速取出心脏,采用改良的Langendorff灌流装置行主动脉逆行灌注,无钙Krebs-Henseleit缓冲液(KH液)非循环灌流4min,0.6g/LWorthington2型胶原酶联合0.03g/L蛋白酶消化约15min,剪下心室组织于消化液和10g/L牛血清白蛋白的混合液中,剪碎后于37℃振摇孵育10min,200μm尼龙网过滤,500g离心1min,梯度复钙,自然沉降。主要观察指标:心肌细胞的形态、活力和产量。结果:复钙后的杆状存活心肌细胞得率为(73±5.6)%(n=30),其中90%以上的杆状心肌无明显搏动,横纹清晰。每只大鼠心脏的平均存活心肌细胞产量为(4.2±0.4)×106。结论:经过改良的Langendorff逆行主动脉灌流酶解法分离成年大鼠心肌细胞,可稳定获得高比例的存活心肌细胞并用于原代培养和细胞/分子生物学研究。

大鼠成体心肌细胞的分离和培养

目的: 探索稳定的大鼠成体心肌细胞的分离和培养方法. 方法: 应用主动脉逆行生物酶(5 g/L胰蛋白酶及1 g/L胶原酶)灌流法分离大鼠成体心肌细胞,免疫荧光染色法鉴定分离的心肌细胞,比较有无血清培养对心肌细胞的影响. 结果: 心肌细胞的存活率为95%以上;存活细胞呈杆状,形态完整,长宽比约为4～6∶ 1;无血清培养心肌细胞只能存活1 wk,形态不发生改变;而加血清培养心肌细胞可存活2 wk以上,但超微结构发生了改变,且不同血清浓度对成纤维细胞生长具有不同的作用. 结论: 主动脉逆行生物酶(胶原酶和蛋白酶)灌流法是比较理想的心肌细胞分离方法;血清对成体心肌细胞的培养起着重要作用.

新生大鼠心肌细胞分离、纯化及培养方法的改进

目的应用酶消化法消化心室肌组织,培养心肌细胞,探索获得高存活率和高纯度心肌细胞的培养条件,为生理学和药理学研究提供细胞模型。方法胰蛋白酶和胶原酶Ⅰ联合消化新生大鼠心室肌组织,控制消化时间和消化温度;用差速贴壁法和化学抑制法纯化心肌细胞进行体外培养。荧光显微镜观察心肌细胞形态学变化;流式细胞仪检测肌钙蛋白Ⅰ的表达;Fluo-3/AM进行细胞质内游离钙离子染色。结果培养的心肌细胞4 h后开始贴壁生长,24 h后有少数单个细胞出现自发性节律性搏动,之后连接成片,细胞簇同步收缩,细胞形态、结构完整;肌钙蛋白Ⅰ阳性率为91%;所有心肌细胞细胞质内钙离子染色阳性,荧光强度随细胞搏动呈强弱周期性变化。结论应用酶消化法可简单快捷地获得大量活力好、纯度高的心肌细胞,为心血管相关研究提供良好的实验模型。

乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定

目的探讨和建立适用于乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。方法乳小鼠心脏剪成组织块,用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶联合消化法分离细胞,再通过差速贴壁分离法分别收集、培养乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞。光学显微镜下分别观察成纤维细胞和心肌细胞的基本形态特征的变化,并对2种细胞行苏木素-伊红(HE)染色,用第2代心肌成纤维细胞行波形蛋白免疫荧光鉴定,而原代心肌细胞行α-横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白和心肌肌球蛋白重链免疫荧光鉴定。结果差速贴壁分离法心肌成纤维细胞原代培养90 min基本贴壁,贴壁较早,培养第3～5代细胞生长良好,72 h心肌成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定纯度高达97%;而心肌细胞贴壁较晚,24 h贴壁后部分心肌细胞出现自发性搏动现象,48 h后细胞逐渐展开,72 h后逐渐形成细胞簇并出现同步搏动,心肌肌球蛋白重链、心肌横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白免疫荧光鉴定心肌细胞纯度分别为95%、93%、95%。结论差速贴壁分离法结合免疫荧光鉴定可分离乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞,此方法成熟、稳定、有效,为研究心脏疾病的基础与临床研究提供了理想的实验模型。

新生大鼠心室成纤维细胞条件培养液的促心肌细胞肥大作用

利用新生大鼠心室成纤维细胞条件培养液孵育心肌细胞 ,证实成纤维细胞条件培养液能明显增大心肌细胞的表面积 ,增加心肌细胞的蛋白含量和 [3H] 亮氨酸 ( [3H] Leu)的掺入 ,上述作用以第 3天的条件培养液作用最强 ,具有剂量依赖性。ETA 受体拮抗剂BQ12 3能部分阻断成纤维细胞条件培养液促进心肌细胞肥大的作用 ,而AT1受体拮抗剂CV11974和α 肾上腺素受体拮抗剂regitin却无此效果。结果提示 :成纤维细胞条件培养液中含有促使心肌细胞肥大的物质 ,这些物质可能是内皮素 (ET 1)等。百日咳毒素 (PTX)和staurosporine也能部分阻断成纤维细胞条件培养液促进心肌细胞肥大作用 。

槲皮素对模拟微重力条件下体外培养大鼠心肌细胞骨架的影响

采用细胞免疫双荧光染色观察离体培养的大鼠心肌细胞微丝和微管分布 ,探讨模拟微重力条件下槲皮素对心肌细胞骨架分布的影响。结果表明 :模拟微重力条件下心肌细胞微丝、微管在近胞核区的分布增多 ;模拟微重力处理的同时加入槲皮素 ,则使近胞核处微丝、微管分布明显减少 ,微丝束的粗细与对照组无异。提示模拟微重力可显著影响心肌细胞微丝、微管的分布 ,槲皮素可对抗该效应而发挥其心肌细胞保护作用 [动物学报49(1) :98～ 10 3 ,2 0 0 3]。

原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定

目的建立原代乳小鼠心肌细胞的培养方法,评价心肌细胞的存活状况并鉴定心肌细胞纯度。方法应用胰酶联合胶原酶共同消化3d内C57乳小鼠心脏,台盼蓝染色判断心肌细胞存活率,α-actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度。结果利用3d内乳鼠心脏可成功培养原代小鼠心肌细胞,台盼蓝染色显示细胞存活率大于95%,α-actin免疫荧光染色显示心肌细胞纯度达95%以上。结论严格控制实验条件,可成功培养高存活率和高纯度的小鼠心肌细胞。

低压恒流灌流分离成年大鼠心肌细胞

目的:探寻合适的初始灌流压力与定量确定酶消化终止点,以提高恒流灌注分离成年大鼠心肌细胞的产量与质量。方法:采用Langendorff装置,行主动脉插管逆向灌流,0.08%胶原酶I消化大鼠心脏,监测灌流压力的变化。结果:调节灌流流速以15 kPa初始压力恒流灌流时(n=4),灌流压力明显升高(压力峰值>25 kPa),造成左心室在松弛状态下明显扩张,使分离的心肌细胞存活率降低,且收缩功能显著降低。以10 kPa初始压力行恒流灌流时,酶消化引起的压力升高均低于18.75 kPa,左心室扩张不明显;当酶消化过程中压力降至10 kPa(n=3)或5kPa(n=4)时终止消化,心肌细胞分别呈消化不足或过度的形态,且心肌细胞存活率均低于10%,恢复正常细胞外液钙离子浓度后,大部分心肌细胞死亡。当酶消化时灌流压降至7.5 kPa时终止消化(n=15),分离即刻心肌细胞存活率为82.6%±4.8%,复钙后心肌细胞存活率为30.4%±4.5%,复钙后4 h的存活率仍为24.8%±5.4%。细胞形态完好,边缘锐利、横纹清晰,无明显博动,收缩功能正常。结论:为获得存活率较高的成年大鼠心肌细胞,宜采用低压恒流灌流分离方法,即初始灌流压力保持在10 kPa,胶原酶I消化的终止压力为7.5 kPa。

新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改进

探讨更为简单的SD大鼠心肌细胞原代培养的方法,使分离的心肌细胞达到理想的存活率和纯度,为临床应用建立心肌细胞模型.取出生24 h内SD大鼠的左心室,剪碎、消化、分离和纯化,进行培养,0.1 g/L胰酶消化,可以分离到形态完整、贴壁生长的心肌细胞.进一步通过离心、差速贴壁和化学试剂抑制非心肌细胞生长,纯化得到95%以上的心肌细胞.成功建立了心肌细胞体外培养模型,获得了高纯度的心肌细胞.