帕金森病食蟹猴模型回肠结构与功能相关蛋白变化的研究

目的探究帕金森病食蟹猴模型研究其肠道结构与功能的变化,为帕金森病患者出现便秘等肠道症状的机制及其干预提供科学依据。方法选取6只雄性食蟹猴,其中3只使用颈内动脉注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶的方式进行造模并出现帕金森病运动症状的食蟹猴,根据Kurlan评分>10分且持续3个月未出现消退迹象为帕金森病组,另外3只未经干预的食蟹猴为对照组。收集2组脑组织与回肠组织,用免疫组织化学染色法酪氨酸羟化酶(TH)分析脑内黑质区多巴胺能神经元数量以及肠道外周TH变化,用苏木精-伊红染色分析肠道的结构,并用闭锁小带蛋白1(ZO-1)评估肠道屏障功能,肠道起搏细胞标志物原癌基因(c-kit)、蛋白基因产物9.5(PGP 9.5)评估肠道蠕动功能。结果帕金森病组左、右两侧黑质多巴胺能神经元数目明显低于对照组[(133.13±108.63)个vs(957.21±225.56)个,t=5.705,P=0.005;(155.74±62.48)个vs(917.52±161.14)个,t=7.611,P=0.002],对照组回肠肌间神经丛TH吸光度值明显高于帕金森病组(0.79±0.01vs0.73±0.01,t=5.149,P=0.007),帕金森病组绒毛密度低于对照组,且排布不规律、结构散乱、细胞脱落,对照组回肠黏膜ZO-1吸光度值(0.28±0.01vs0.22±0.02,P=0.006),肌间神经丛c-kit吸光度值(0.21±0.01vs0.18±0.01,P=0.007)明显高于帕金森病组,对照组与帕金森病组肌间神经丛PGP9.5表达比较,差异无统计学意义,(0.31±0.08vs0.38±0.06,P=0.322)。结论帕金森病组肠道屏障完整性的破坏,包括绒毛受损、肠道通透性增加以及蠕动性降低,与蠕动性功能相关的肌间神经元无关。

食蟹猴纹状体内注射α-突触核蛋白预制原纤维对嗅球病理改变的影响

目的探讨α-突触核蛋白预制原纤维(α-Syn PFF)纹状体注射后能否生成病理性α-突触核蛋白(α-Syn),并从纹状体传播至嗅球,从而引起嗅球中神经元损伤。方法3只健康雌性食蟹猴双侧纹状体注射α-Syn PFF作为实验组,以脑立体定向注射手术,将300μgα-Syn PFF(7 g/L)注射到双侧纹状体的6个位点,即每侧纹状体壳核头部注射60μg,体部注射60μg,尾部注射30μg。另2只健康雌性食蟹猴相同部位注射同等剂量磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照组。注射2年后,实验猴行安乐死,取出嗅球经固定和切片,然后经尼氏染色检测组织病理改变,免疫组织化学染色检测磷酸化α-Syn(pS129)、酪氨酸羟化酶(TH)、双皮质素(DCX)的表达情况。结果实验组与对照组比较,嗅球中存在pS129阳性聚集体;实验组TH和DCX阳性神经元数量较对照组均显著减少[TH:(27.00±11.22)个vs.(65.80±36.54)个;DCX:(67.60±17.23)个vs.(88.30±19.89)个]。结论食蟹猴纹状体注射α-Syn PFF产生的病理性α-Syn可从纹状体传播至嗅球造成嗅球神经元损伤,诱导嗅球中多巴胺能神经元丢失,并抑制新生神经元生成。

隐丹参酮诱导猴骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的体外培养猴骨髓间质干细胞(MSCs)并定向诱导分化为神经元样细胞。方法体外分离培养猴MSCs,流式细胞仪检测其表面标志,用含隐丹参酮的无血清L-DMEM诱导MSCs分化为神经元样细胞,免疫细胞化学检测单克隆抗体特异性神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果体外培养的猴MSCs表达CD29、CD44、CD105、CD166,并且具有正常的二倍体核型,不随传代而发生改变。bFGF预诱导24h后,隐丹参酮可以将MSCs诱导为神经元样细胞,免疫细胞化学显示NSE、NF表达阳性,阳性率分别为68.3%±3.5%、70.3%±1.5%,而GFAP表达阴性。结论隐丹参酮可以在体外将猴MSCs诱导分化为神经元样细胞。

食蟹猴脑出血骨髓间充质干细胞移植活体示踪观察

目的将超顺磁性氧化铁(superparamagnetic Iron Oxide,SPIO)标记人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSC)并植入脑出血食蟹猴脑内,利用MRI技术活体示踪移植的hBMSC。方法将自体股动脉血注入食蟹猴右侧基底节区,制备脑出血模型。收集志愿者骨髓,分离培养hBMSC至第3代。脑出血模型制备后第7天,将5×106个SPIO标记的hBMSC通过立体定向手术移植入血肿对侧基底节区。移植后1d、2周、4周、6周、8周采用MRI检查示踪hBMSC。食蟹猴处死后脑组织切片行苏木精-伊红及普鲁士蓝染色。结果SPIO标记hBMSC的效率大于96%,经SPIO标记的hBMSC移植后T2加权像可发现移植区呈明显的低信号区。苏木精-伊红、普鲁士蓝染色可发现移植细胞及新生血管分布于移植区周围,与MRI信号减低区一致。结论SPIO可有效地标记hBMSC,MRI可以活体示踪食蟹猴脑出血脑内移植的经SPIO标记的hBMSC。部分hBMSC可分化为血管,并促进宿主新生血管的形成。

全人源抗人肿瘤坏死因子α单克隆抗体注射液对食蟹猴的长期毒性试验

目的评价全人源抗人肿瘤坏死因子α单克隆抗体(抗-h TNF-αFHMA)注射液对食蟹猴的长期毒性。方法将40只食蟹猴随机分成5组,分别为阴性对照组、阿达木单抗10 mg·kg^(- 1)对照组和抗-h TNF-αFHMA 2,10和50 mg·kg^(- 1)组,经皮下注射每周给药1次,连续给药5次,停药后恢复期4周。实验期间进行临床观察、体质量、体温、心电图、血细胞计数、凝血功能、血液生化、尿液、眼科、免疫指标、脏器及组织病理观察,同时进行血药浓度检测,分析毒代动力学参数。结果实验期间各组食蟹猴的观察、体质量、体温、心电图参数、眼科检查、血细胞计数、凝血功能、血生化、尿液分析、淋巴细胞亚群、细胞因子、血清免疫球蛋白和血清补体等指标均未见与给药相关的具有毒理意义的改变;抗-h TNF-αFHMA和阿达木单抗均可引起食蟹猴体内产生抗药抗体,且具有中和活性。抗-h TNF-αFHMA在体内基本呈线性动力学特征。相同剂量下与阿达木单抗呈现相似的免疫原性和代谢动力学特征。结论抗-h TNF-αFHMA未观察到不良反应的剂量为50 mg·kg^(- 1),相当于临床拟用剂量(0.67 mg·kg^(- 1))的75倍,表明抗-h TNF-αFHMA临床应用安全性较好。

猴EAE致敏前后脑脊液IgG指数和IgG合成率的变化

目的：研究体液免疫在多发性硬化（ＭＳ）病程不同阶段中的作用。方法：采用Ｂｅｋｍａｎｎ免疫仪和ＭｏｎａｒｃｈＰｌｕｓ生化仪，对１０只食蟹猴中ＩｇＧ指数和ＩｇＧ合成率，进行实验性变态反应性脑脊髓炎（ＥＡＥ）致敏前和致敏后不同阶段的自身对照检测。结果：致敏前正常食蟹猴脑脊液（ＣＳＦ）ＩｇＧ指数为０．３±０．１，ＩｇＧ合成率为－４．６±３．３；致敏后１、２、３、４、５周ＩｇＧ指数分别为０．４±０．２、０．７±０．５、０．７±０．４、０．７±０．３、０．６±０．２；而ＩｇＧ合成率分别为－１．３±４．１、２７．１±４０．０、２６．６±３９１、２６．２±３８．２、２４．５±４３．９。致敏后１周与致敏前的ＩｇＧ指数和ＩｇＧ合成率的差异无显著性意义，而致敏后２、３、４、５周与致敏前的差异均有显著性意义，但致敏后２、３、４、５周之间差异无显著性意义。结论：提示体液免疫在ＭＳ和ＥＡＥ中起重要作用，并且持续相当长的时间。

艾滋病病毒感染猴的循环免疫复合物的变化

[目的]观察猴免疫缺陷病毒(SIV)感染猕猴后循环免疫复合物(CIC)的动态变化。[方法]使用SIVmac251感染30只实验猴,并在感染SIV后不同时间点取样,采用补体致敏的酵母菌凝集试验,检测血清CIC水平的变化,并同时检测了68只正常猴的血清作为对照。[结果]30只SIV感染猴在接种后第4周开始检出CIC(总阳性率为30％),第8周迅速升高并达到高峰46.7％,在第16周降低至33.3％并逐渐下降;从第20周开始,感染猴的CIC浓度维持一较低的滴度和阳性率,接近于正常猴(约10％)。[结论]CIC在SIV急性感染期间出现并升高,但其后伴随着循环中病毒的减少,CIC也逐渐下降。CIC的形成可能无益于控制病毒复制和引导抗病毒免疫,并可能参与了SIV感染后的发病过程。

瞬目反射在猴实验性变态反应性脑脊髓炎中的应用研究

目的:探讨瞬目反射在评价猴实验性变态反应性脑脊髓炎(experimentalallergicencephalomyelitis,EAE)中的价值。方法:1997年制作的EAE猴8只,于放养4年后对该批猴行瞬目反射检查,并与脑干听觉诱发电位(BAEP)检测法进行比较。结果:8只EAE猴(16侧神经)瞬目反射检测发现脑干损害9侧,三叉神经损害2侧,面神经损害1侧;瞬目反射单独检测发现脑干病变的阳性率为56%。8只EAE猴BAEP单独检测发现脑干病变的阳性率为50%。瞬目反射和BAEP两者联合检测脑干损害的阳性率为81%。结论:瞬目反射揭示放养4年后的EAE猴存在脑干、面神经及三叉神经损害;瞬目反射与BAEP两者联合检测发现脑干损害阳性率高于单独检测,提示在评价EAE猴脑干功能时,采用两者联合检测可提高异常率。

液相色谱-串联质谱法测定猴血浆对乙酰氨基酚浓度及其药代动力学研究

目的 建立一种检测猴血浆中对乙酰氨基酚浓度的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法,并将其用于该药在猴血浆中的药代动力学（药动学）研究.方法 分别给予6只猴单剂量鼻腔灌胃给药（20 mg/kg）后,在不同时间点取血,甲醇沉淀血浆蛋白.色谱柱（Phenmenex,Synergi,50.0 mm×3.0 mm,4.0 μm）,流动相A：2 mmol/L乙酸铵混于0.1%甲酸-水溶液中;流动相B：2 mmol/L乙酸铵混于95%乙腈-水溶液中,进行色谱分离,D4-对乙酰氨基酚为内标,采用电喷雾离子源正离子多反应监测测定对乙酰氨基酚血浆浓度,计算药动学参数.结果 LC-MS/MS法在50～50 000 ng/mL时具有良好的线性关系[相关系数为0.999 7];最低定量限为50 ng/mL.给药1 h后,雌雄猴的平均最大血药浓度值分别为6 700、8 900 ng/mL;血药浓度-时间曲线下面积值分别为12.1、18.8 h/（μg·mL）;平均半衰期为1.3 h.结论 建立的测定方法准确灵敏、快速简单、结果可靠,可用于对乙酰氨基酚在猴体内的药动学研究.

CT血管造影与彩色多普勒超声对食蟹猴肾动脉直径的比较研究

目的 :比较CTA与彩色多普勒超声对食蟹猴肾动脉影像学评估的差异性和优势。方法 :收集符合纳入条件的食蟹猴9只,分别行CTA与彩色多普勒超声。比较2组图像,并测量肾动脉直径。结果:CTA与彩色多普勒超声均可清晰显示肾动脉及其分支,测量的左肾动脉直径分别为(2.83±0.49)、(2.35±0.40)mm,差异无统计学意义(P=0.053);右侧肾动脉直径分别为(2.85±0.56)、(2.37±0.29)mm,差异无统计学意义(P=0.052)。结论 :CTA与彩色多普勒超声均可用于食蟹猴肾动脉直径的测量,两者结果无差异,具有可比性,但各有优势和不足。

白细胞介素2、6、10在猴实验性变态反应性脑脊髓炎发病中的作用

目的 了解血和脑脊液白细胞介素 (IL) 2、IL 6、IL 10在猴实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)发病机制和病情转归中的作用 ,并进一步阐明多发性硬化 (MS)发病的免疫学机制。方法 用猴脑制成脑白质匀浆乳化剂 ,先制作猴EAE模型 10只 ;随机选另 1只猴 ,用完全福氏佐剂 (CFA)0 4ml皮下注射作对照组。然后对EAE进行临床病情分级和病程分期 ,并在不同时期收集血和脑脊液的上清液 ,用酶增敏免疫分析法测定IL 2、IL 6、IL 10的浓度 ,用配对t检验进行统计学处理。结果猴EAE发病前后血中IL 2、IL 6、IL 10有轻度变化 ,IL 2、IL 6发病后较发病前升高 ,但差异无显著意义。而猴EAE急性期第 1、3周脑脊液IL 2 (分别为 5 0± 0 8和 5 3± 1 2 )较发病前 (0 7± 0 3)明显升高 ,P值分别为 0 0 45 ,0 0 41,恢复期或慢性期IL 6、IL 10明显升高 ,P值各为 0 0 0 43,0 0 0 6 5 ,差异有显著意义。结论 IL 2正向调节免疫 ,使EAE猴的病情加重 ;IL 6、IL 10负向调节免疫 ,使EAE猴的病情减轻。此结果对今后研究EAE或MS的免疫学机制可能有重要指导作用。

建立食蟹猴肾移植模型的手术技巧

目的探讨建立食蟹猴肾移植动物模型的手术技巧。方法26只食蟹猴配为13对，互为供、受者。全身麻醉下切取食蟹猴的双肾，将左肾作为供肾（仅1只采用右肾）。供肾动、静脉分别与受者的腹主动脉和下腔静脉吻合；供肾输尿管分别与受者膀胱（12只）或输尿管（13只，输尿管内放置支架管）进行吻合。吻合均在肉眼直视下进行，并应用显微器械进行操作。结果手术时间为（180．9±25．3）min，移植肾热缺血时间为（1．5±0．4）min，冷缺血时间为（71．4±10．5）min，动脉吻合时间为（29．5±6．3）min，静脉吻合时间为（25．7±5．7）min，输尿管一膀胱吻合时间为（19．8±5．7）min，输尿管一输尿管吻合时间为（15．1±3．2）min。血管吻合成功率为96．2％（25／26），1只因供肾（右肾）静脉过短，术中吻合口撕裂出血而死亡。存活的25只受者中，8只（32％）发生尿漏，其中6只为输尿管－膀胱吻合者，2只为输尿管－输尿管吻合者。存活受者未发生切口感染和血管并发症。结论完善的术前准备、气管内插管全身麻醉、无创血管吻合技术和输尿管内支架管的放置是食蟹猴肾移植手术成功的关键。

猴实验性变态反应性脑脊髓炎脑脊液细胞学与病情及病程的关系

目的研究猴实验性变态反应性脑脊髓炎（ＥＡＥ）的脑脊液细胞学与临床病情及病程的相关性。方法将１１只食蟹猴分为对照组（１只）和ＥＡＥ组（１０只）。用新鲜食蟹猴脑的白质，制成脑白质匀浆乳化液，在猴多部位皮下注射，制成ＥＡＥ模型。每周抽取０．５ｍｌ脑脊液，用微量细胞玻片离心沉淀法收集脑脊液细胞，迈格姬染色法染色，用带有测微仪的显微镜进行细胞计数和分类。结果猴ＥＡＥ的脑脊液细胞数与病情呈明显正相关（Ｐ≤０．０１）。结论动态监测猴ＥＡＥ脑脊液细胞学可反映病情变化；

7，8-二羟基黄酮对食蟹猴纹状体作用的99Tcm—TRODAT-1 SPECT／CT显像评估

目的应用99Tcm－TRODAT－1 SPECT/CT显像评估7, 8－二羟基黄酮（7，8－DHF）对正常食蟹猴纹状体（ST）的作用。 方法选取健康雌性食蟹猴6只笼养，3只为正常饲养的对照组，3只为除正常饲养外还给予口服7，8－DHF进行干预的实验组。注射显像剂99Tcm－TRODAT－1后分别于不同时间行SPECT/CT显像，取SPECT/CT图像中ST显示最清晰的连续横断层面勾画ROI，并选小脑（CB）作为参考本底，分别计算注射后1、3、4、5 h的ST/CB放射性摄取比值。统计学处理采用配对t检验。 结果实验组和对照组ST/CB比值均随时间延长不断升高，对照组注射后1、3、4、5 h的ST/CB比值分别为1.43±0.04、1.82±0.06、2.04±0.12、2.42±0.23，实验组分别为1.35±0.08、2.40±0.09、2.74±0.13、3.25±0.15。2组注射后1 h的ST/CB比值差异无统计学意义（t＝2.57, P〉0.05），3、4、5 h时的ST/CB比值差异均有统计学意义（t值：2.77、2.87和2.92，均P〈0.05）。 结论99Tcm－TRODAT－1 SPECT/CT显像可用于评估7, 8－DHF对食蟹猴ST中DAT的激活作用。

shRNA靶向抑制NF-κB基因治疗食蟹猴子宫内膜异位症的研究

目的 观察靶向NF-κB基因的短发夹状RNA（shRNA）在治疗食蟹猴子宫内膜异位症的效果,分析NF-κB基因在食蟹猴子宫内膜异位症发生发展中的作用.方法 构建食蟹猴子宫内膜异位症模型,同时合成高特异性的靶向NF-κB基因的shRNA腺病毒及其阴性对照空载shRNA腺病毒.将建模成功的食蟹猴分成实验组、阴性对照组及单纯建模组,将NF-κBshRNA腺病毒在腹腔镜下直接注入实验组食蟹猴子宫内膜异位病灶内,阴性对照组在病灶内注射空载shRNA腺病毒,单纯建模组病灶内注射生理盐水.注射腺病毒后4周,腹腔镜下观察病灶变化,取各组子宫内膜异位病灶进行CD34免疫组化染色检测微血管密度,并采用蛋白印迹法（western blot）检测NF-κB及增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达.结果 成功构建了食蟹猴子宫内膜异位症模型.实验组食蟹猴异位病灶较前萎缩,其微血管密度（0.002 0±0.000 3）较阴性对照组（0.021 9±0.002 6）、单纯建模组（0.024 5±0.003 3）明显减小,分别比较,差异有统计学意义（P＜0.01）.实验组食蟹猴NF-κB蛋白的表达水平（0.338±0.174）较阴性对照组（0.678±0.021）、单纯建模组（0.645±0.098）明显下降,分别比较,差异有统计学意义（P＜0.01）.实验组食蟹猴PCNA蛋白的表达水平（0.37±0.17）低于阴性对照组（0.57±0.26）、单纯建模组（0.57±0.28）,分别比较,差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 NF-κB shRNA通过靶向抑制NF-κB基因的表达后,能够抑制食蟹猴子宫内膜异位症的进展,抑制子宫内膜异位病灶的血管生成能力,减弱异位子宫内膜细胞的增殖能力.

氯胺酮对食蟹猴大脑血管病理及NADPH氧化酶表达的影响

目的探讨氯胺酮连续给药对食蟹猴大脑动脉(动脉环交通支)形态及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(NADPH)氧化酶表达的影响。方法随机将12只雄性食蟹猴分为生理盐水组(4只)和氯胺酮组(8只,1 mg/kg),6个月后处死动物,采用HE染色法观察大脑动脉的形态变化,比色法测定H2O2的水平,Western blot法和免疫组织化学染色检测血管中NADPH氧化酶的表达水平。结果连续注射氯胺酮6个月后,NADPH氧化酶表达增加,血清和血管组织内活性氧(ROS)水平明显升高,大脑动脉形成血栓及炎症反应。结论氯胺酮诱导食蟹猴脑血管疾病的发生与NADPH氧化酶表达增加具有相关性。

老年2型糖尿病食蟹猴阿尔茨海默病相关核心生物标记物变化

目的探讨老年2型糖尿病（T2DM）食蟹猴的血浆、脑脊液及脑组织中阿尔茨海默病（AD）相关核心生物标记物的变化。方法从经过国际认证的含有2000余只食蟹猴代谢性指标数据库中选取年龄超过18岁的老年食蟹猴，按随机数字表法选取14只空腹血糖（FPG）≥7．0mmol／L者作为糖尿病组（DM组），其中雌性9只、雄性5只，体重（5．8±2．3）kg。同时从FPG〈5．6mmol／L者中随机选取19只作为正常对照组（NC组），雌性12只、雄性7只，体重（5．4±2．0）kg。检测血糖、血脂及血浆、脑脊液中AD相关核心生物标记物[p淀粉样蛋白（AB）。AS。总tau蛋白（tau）、磷酸化tau蛋白（p-tau）]等，并进行AD相关脑组织免疫组织化学染色。正态、偏态分布数据分别采用两独立样本t检验或非参数检验（Mann—WhitneyU检验），两组FPG与各AD相关核心生物标记物间的关系采用线性回归法。结果DM组血浆中的Aβ42、tau、p-tau水平均低于Nc组，分别为12（10，14）比18（14，27）pmol／L、43（12，96）比126（97，228）ng／L和11（10，12）比13（10，26）ng／L（U=52、14、64，均P〈0．05）。DM组血浆中的Aβ40虽低于NC组，但差异无统计学意义。DM组Aβ40、P-tau与FPG呈线性关系（r2=O．30、0．29，P〈0．05）。DM组脑脊液中的A阻、A阻浓度低于Nc组，分别为455（441，545）比565（525，699）pmol／L和73（64，105）比105（90，126）pmol／L，U=16、24，均P〈0．05。tan、p-tau虽低于NC组，但差异无统计学意义（均P〉0．05）。脑组织病理免疫组化结果显示DM组颞叶皮层p-tau的表达比Nc组显著增多。结论T2DM可能潜在加速AD的病理生理过程，自发性T2DM老年食蟹猴可作为AD基础和转化研究的预测模型。