可溶性环氧化物水解酶抑制剂对暴露于HEMA的人牙髓干细胞细胞迁移及成牙分化的影响

目的:探讨在树脂单体甲基丙烯酸羟乙酯(2-hydroxyethyl methacrylate, HEMA)暴露环境下,可溶性环氧化物水解酶抑制剂(TPPU)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)迁移及成牙分化的影响。方法:分离提取hDPSCs,并利用茜素红染色和流式细胞仪鉴定其干性。以无添加药物的诱导培养基为对照组,以HEMA、HEMA+TPPU为实验组,利用CCK-8检测细胞活性;利用细胞划痕实验检测细胞迁移;利用碱性磷酸酶染色法进行染色,并检测碱性磷酸酶(ALP)活性;利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测成牙分化相关基因Runt相关转录因子2(Runx2)、牙本质基质蛋白-1(DMP-1)和牙本质涎磷蛋白(DSPP)的相对表达;利用茜素红染色检测矿化结节形成情况。结果:HEMA组细胞活性较对照组显著降低(P<0.05),HEMA+TPPU组较HEMA组增加(P<0.05)。HEMA组细胞迁移率较对照组显著降低(P<0.05),HEMA+TPPU组较HEMA组增加(P<0.05)。在成牙诱导分化过程中,用2 mmol/L的HEMA处理细胞后,ALP活性较对照组降低(P<0.05),相关成牙分化基因表达也显著降低(P<0.05)。而HEMA+TPPU组ALP活性较HEMA组显著升高(P<0.05),且基因Runx2、DMP-1、DSPP表达也显著增加(P<0.05)。此外茜素红染色结果也显示HEMA+TPPU组和对照组的相对钙含量均较HEMA组显著升高(P<0.05)。结论:HEMA可在一定程度上抑制hDPSCs的细胞迁移和成牙分化能力,而TPPU可部分逆转HEMA对细胞迁移和成牙分化能力的抑制作用。

METTL7A通过m6A甲基化调控牙髓干细胞的衰老和成骨/成牙分化

目的:探索甲基转移酶样7A(METTL7A)通过N6-甲基腺苷(m6A)甲基化对牙髓干细胞(DPSCs)衰老和成骨/成牙分化的影响。方法:利用慢病毒转染DPSCs获得METTL7A稳定敲低的DPSCs,利用逆转录病毒转染DPSCs获得METTL7A稳定过表达的DPSCs,实时荧光定量PCR和Western blot实验检测敲低及过表达效率。在此基础上,利用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色及定量检测METTL7A是否调控DPSCs的衰老,斑点杂交实验检测METTL7A是否调控DPSCs的m6A甲基化水平。METTL7A过表达组加入m6A甲基化抑制剂环亮氨酸(Cyc)后,利用SA-β-gal染色及定量检测和碱性磷酸酶(ALP)活性实验检测METTL7A通过m6A甲基化调控DPSCs的衰老和成骨/成牙分化。结果:利用慢病毒转染DPSCs,与对照组(Consh)相比,METTL7A基因和蛋白在METTL7A敲低组(METTL7Ash)的表达显著降低(P<0.01),METTL7Ash组的SA-β-gal染色及定量检测发现阳性细胞数量增加(P<0.05);利用逆转录病毒转染DPSCs,与对照组(Vector)相比,METTL7A在METTL7A过表达(HA-METTL7A)组的表达显著增加(P<0.01),HA-METTL7A组的SA-β-gal染色及定量检测显示阳性细胞数量减少(P<0.01)。此外,相比于Consh组,METTL7Ash组DPSCs的m6A甲基化修饰水平显著降低,而过表达METTL7A组DPSCs的m6A甲基化修饰水平明显升高。在此基础上,在METTL7A过表达组加入Cyc,SA-β-gal染色及其定量检测显著增加因METTL7A过表达而减少的阳性细胞数量(P<0.01),同时也显著抑制因METTL7A过表达促进的ALP活性(P<0.05)。结论:METTL7A可能通过调控m6A甲基化水平抑制DPSCs的衰老并促进其成骨/成牙分化。

Necdin对大鼠牙胚外胚间充质干细胞成牙分化和矿化的影响

目的探讨胚胎癌细胞来源分化神经元特异蛋白(neurally differentiated EC-cell-derived protein,Necdin)对大鼠牙胚外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)成牙分化和矿化的调控作用。方法利用免疫荧光染色检测Necdin在E13.5d、E19.5d大鼠牙胚中的表达分布情况。分离培养E19.5d大鼠牙胚EMSCs,流式细胞术鉴定细胞表型,构建Necdin沉默慢病毒感染EMSCs,分为阴性对照组(sh-NC)和沉默组(sh-Necdin)。流式细胞术检测EMSCs凋亡情况,CCK-8法检测EMSCs增殖能力,划痕实验检测EMSCs迁移能力,矿化诱导后通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色、RT-PCR和Western blot观察Necdin对EMSCs成牙分化和矿化的调控作用。结果免疫荧光显示Necdin在内、外釉上皮和上皮与间充质接触区域呈强阳性表达;牙胚组织来源的EMSCs沉默Necdin后,sh-Necdin组EMSCs凋亡率较sh-NC组增多(P<0.01),与sh-NC组相比,sh-Necdin组EMSCs的增殖能力更强(P<0.01),但迁移能力变弱(P<0.01);与sh-NC组相比,sh-Necdin组碱性磷酸酶染色更浅且矿化结节形成更少;sh-Necdin组EMSCs成牙分化和矿化相关的基因与蛋白表达量明显低于sh-NC组(P<0.05)。结论Necdin在大鼠牙胚未来成牙分化和矿化区域呈特异性表达,沉默Necdin促进EMSCs凋亡和增殖,但抑制EMSCs迁移以及成牙分化和矿化,Necdin可能在牙发育矿化过程中发挥重要作用。

Chir99021调控Wnt/β-catenin信号通路干预干细胞成骨/成牙分化的研究

目的:探讨Chir99021调控Wnt/β-catenin信号通路干预人牙髓干细胞成骨/成牙分化及其可能的机制。方法:分离纯化和培养人前磨牙牙髓干细胞(HDPSCs),免疫荧光检测牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和波形蛋白(Vimentin),CCK-8检测不同浓度Chir99021对HDPSCs细胞增殖作用的影响。将HDPSCs分为3组培养,第1组正常培养,为空白对照组;第2组成骨诱导液培养,为实验对照组;第3组成骨诱导液+Chir99021培养,为实验组。15 d后用茜素红染色对各组细胞进行钙沉积物检测;qPCR于5、10、15 d检测各组轴抑制蛋白2(axisinhibition protein2,Axin2)、β连环蛋白(β-catenin)及糖原合成激酶3(GSK-3β)水平;Western blot于5、10、15 d检测各组RUNT相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和Ⅰ型胶原的表达。结果:分离培养后的HDPSCs中DSP和Vimentin呈阳性表达;Chir99021浓度为2000 nmol/L时,细胞增殖情况最明显;茜红素染色显示实验组钙沉积物较其余两组显著增加;实验组中Axin2、β-catenin显著上升,GSK-3β显著下降(P<0.05);Runx2、ALP在实验组及实验对照组中有显著表达(P<0.05),OC在实验组中显著表达(P<0.05);DSPP、Ⅰ型胶原在实验组中显著表达(P<0.05)。结论:Chir99021通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进HDPSCs的增殖和成骨/成牙分化。

丹参注射液促进人脱落乳牙牙髓干细胞成骨/成牙分化的实验研究

目的探讨中药丹参对人脱落乳牙牙髓干细胞(SHEDs)成骨/成牙分化功能的影响。方法利用50mg/ml的丹参注射液作用于SHEDs细胞,利用成骨/成牙分化诱导培养基诱导SHEDs定向分化。通过检测ALP活性、茜素红染色、钙离子定量分析、成骨/成牙分化相关基因的表达研究SHEDs体外成骨/成牙分化能力。Western Blot检测AKT信号分子的表达。结果 50mg/ml的丹参注射液促进SHEDs细胞ALP活性,体外矿化能力及成骨/成牙分化相关基因骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达。50mg/ml的丹参注射液促进磷酸化AKT的表达。结论 50mg/ml的丹参注射液具有促进SHEDs细胞体外成骨/成牙分化的潜能,其作用可能与激活AKT信号通路相关。

肿瘤坏死因子诱导基因-6对牙髓干细胞成牙分化的影响

目的:探讨肿瘤坏死因子诱导基因-6(TSG-6)对牙髓干细胞(DPSC)成牙能力的作用。方法:收集30颗无龋坏和炎症的完整智齿,取出牙冠部牙髓,使用改良组织块法对DPSC进行分离、培养。通过慢病毒感染对DPSC中TSG-6的表达进行增强(Ad-TSG-6-DPSC)和敲低(TSG-6-RNAi DPSC)。细胞分为正常组和增强组,炎症组和敲低组。正常组和增强组分别采用DPSC和Ad-TSG-6 DPSC,加入矿化诱导液培养。炎症组和敲低组分别采用DPSC和TSG-6-RNAi DPSC,加入含终浓度50μg/L TNF-α的矿化诱导液培养。采用Western blot法检测TSG-6、骨形态发生蛋白(BMP)-4、Smad1/5、牙本质基质蛋白(DMP)-1和牙本质涎磷蛋白(DSPP)蛋白的表达。将各组细胞分别与水凝胶组合,注射于裸鼠皮下进行异位成骨实验。取皮下异位组织行HE和MASSON染色,采用免疫组化检测组织中骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)蛋白的表达。结果:与正常组比较,增强组细胞BMP-4、Smad1/5、DSPP、DMP-1蛋白表达水平降低(P<0.05)。与炎症组比较,敲低组细胞BMP-4、Smad1/5、DSPP、DMP-1蛋白表达水平升高(P<0.05)。正常组和增强组裸鼠有皮下异位组织形成,正常组形成的皮下异位组织富含胶原纤维,增强组形成的皮下异位组织细胞十分密集,且胶原纤维含量较少;与正常组比较,增强组皮下异位组织中OCN和OPN蛋白的表达降低(P<0.05)。结论:TSG-6是DPSC成牙分化过程中的下调蛋白,降低TSG-6的表达可能提高DPSC在炎症环境中的成牙分化能力。

MAPK信号通路在牙源性细胞成牙分化中的功能研究进展

牙齿组织生物性再生修复是解决牙体缺损、缺失的前沿研究方向,诱导牙源性细胞成牙分化是实现牙齿组织生物性再生修复的重要途径之一。多种信号通路共同参与调控牙源性细胞成牙分化的过程。其中MAPK信号通路研究已成为国内外研究热点。本文就MAPK信号通路在牙源性细胞成牙分化中的功能及其与其他信号通路间的相互作用作简要综述。

碱性成纤维细胞生长因子对3D培养条件下牙髓干细胞成牙分化的研究

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,FGF-2)对3D培养的牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成牙分化的影响。方法:体外分离和培养DPSCs,通过成牙/成骨和成脂诱导,鉴定其多向分化的潜能;构建纳米纤维微球,将DPSCs与纳米纤维微球复合3D培养,FGF-2(20 ng/m L)刺激DPSCs 7 d,常规培养7 d,诱导培养7 d后,实时定量PCR和免疫荧光染色分别测定DPSCs成牙分化相关基因和蛋白的表达变化。结果:体外成功培养的DPSCs,具有成牙/成骨和成脂方向分化的潜能;FGF-2刺激3D培养的DPSCs后,成牙分化相关基因ALP、DMP1、OCN、DSPP以及成牙分化相关蛋白在2周时显著升高(P<0.05)。结论:FGF-2可效促进DPSCs向成牙本质样细胞分化。

基于MAPK信号通路研究miR-218对牙髓干细胞增殖及成牙分化的作用

目的基于丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路研究微小RNA(miR)-218对牙髓干细胞(DPSCs)增殖及成牙分化的影响。方法将含miR-218抑制物的重组质粒、阴性对照质粒转染至DPSCs,分别设为Anti-miR-218组、空载组,采用p38 MAPK抑制剂SB203580(5 mmol/L)处理12 h,设为SB203580组,取不作处理细胞为空白组;转染8 h后p38 MAPK抑制剂SB203580处理Anti-miR-218组,设为Anti-miR-218+SB 203580组,培养至48 h进行后续实验。观察转染效率,测定4组miR-218相对表达量;测定各组继续培养24、48、72 h细胞增殖情况;比较各组诱导分化3、5、7 d碱性磷酸酶(ALP)活性;观察诱导分化情况,比较诱导21 d矿化结节面积百分比、结节数量;测定各组诱导14 d牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨桥蛋白(OPN)表达水平,p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK、p-ERK蛋白相对表达量,计算p-p38 MAPK/p38MAPK、p-ERK/ERK。结果稳定转染48 h后,Anti-miR-218组、空载组转染效率均> 75%;转染含miR-218抑制物的重组质粒后,Anti-miR-218组miR-218表达明显降低;与空白组、空载组比较,Anti-miR-218组细胞继续培养24、48、72 h时细胞增殖能力增强,诱导分化3、5、7 d ALP活性增强,诱导21 d矿化结节面积百分比升高,结节数量增加,诱导14 d DSPP、OPN表达水平升高,p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK/ERK升高;SB203580组、Anti-miR-218+SB203580组、Anti-miR-218组对DPSCs增殖与分化的促进作用依次增强。结论敲减miR-218基因可促进DPSCs增殖、分化,其作用机制可能与激活MAPK信号通路,上调p38 MAPK、ERK磷酸化有关。

人根尖牙乳头干细胞条件培养基体外诱导成牙分化的研究

目的探讨人根尖牙乳头干细胞(conditional medium of stem cells from apical papilla,SCAP-CM)条件培养基诱导牙髓细胞成牙分化的作用。方法从人新鲜拔除的离体牙中,分离培养根尖牙乳头干细胞,收集其在常氧和低氧环境下培养的条件培养基[SCAP-CM(N)和SCAP-CM(H)]。用浓缩后的SCAP-CM(N)、SCAPCM(H)处理牙髓细胞,检测牙髓细胞的碱性磷酸酶活性,以qRT-PCR检测成牙相关基因Runx2、ALP、DSPP、OCN及DMP-1的表达,以WesternBlot检测牙本质涎蛋白的表达。结果在加入成骨诱导培养基的前提下,7天后SCAP-CM(H)组的碱性磷酸酶活性明显提高,SCAP-CM(N)组其次,而空白对照组的碱性磷酸酶活性最低。在基因水平上,相比空白对照组,SCAP-CM(N)和SCAP-CM(H)组的成牙相关基因Runx2、ALP、DSPP在mRNA水平上的表达增加。在蛋白水平上,SCAP-CM(H)和SCAP-CM(N)组DSP表达较其他组有所增加。结论SCAP-CM在体外具有一定的诱导成牙本质的能力,具有协同促进矿化的能力,在再生性牙髓治疗中具有潜在的应用价值。

低浓度氟化钠对人牙髓细胞的成骨/成牙本质分化的影响

目的探讨低浓度氟化钠对人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)成骨/成牙本质分化的影响。方法本研究已通过单位伦理委员会审查批准。原代培养hDPCs,采用MTT法检测不同浓度氟化钠对hDPCs增殖的影响;选取合适浓度的氟化钠加入成骨/成牙本质分化诱导培养液中,对hDPCs进行体外诱导,通过茜素红染色检测hDPCs成骨/成牙本质分化能力的变化,RT⁃qPCR检测分化相关基因的mRNA表达;同时通过RT⁃qPCR和Western blot检测hDPCs成骨/成牙本质分化过程中内质网应激相关基因的表达。结果低浓度氟化钠(0.1 mmol/L)在体外可刺激hDPCs增殖,高浓度氟化钠(5~10 mmol/L)可抑制hDPCs增殖(P<0.05)。选取0.1 mmol/L氟化钠体外混合成骨/成牙本质分化诱导培养后hDPCs的茜素红染色增加,成骨/成牙本质分化相关基因牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)mRNA表达水平升高(P<0.05)。同时在此过程中RT⁃qPCR检测出mRNA水平hDPCs内质网应激相关基因:剪切x盒结合蛋白1(splicing x⁃box binding protein⁃1,sXBP1)、葡萄糖调节蛋白78(glucose⁃regulated protein 78,GRP78)以及活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)表达升高(P<0.05);Western blot检测出氟化钠混合成骨/成牙本质分化培养后细胞磷酸化真核起始因子⁃2α(phosphorylated eukary⁃otic initiation factor⁃2α,p⁃eIF2α)、磷酸化蛋白激酶样内质网激酶(phosphorylated the RNA⁃activated protein kinase⁃like ER⁃resident kinase,p⁃PERK)和ATF4蛋白表达增加(P<0.05)。结论低剂量氟化钠促进人牙髓细胞的成骨/成牙本质分化并伴有内质网应激水平的升高。

影响牙髓干细胞成骨及成牙本质分化的相关物理因素及作用机制

背景:牙髓干细胞是口腔颌面部组织工程中极具应用潜力的干细胞之一,较骨髓间充质干细胞具有采集方便、伦理问题少以及增殖分化潜能高等优势。目前,除了生物化学等因素外,物理刺激对于牙髓干细胞的成骨/成牙本质分化也起着关键性的作用。目的:综述影响牙髓干细胞成骨/成牙本质分化的相关物理因素以及可能涉及的信号传导通路作用机制,寻找影响其分化的最佳诱导条件。方法:检索PubMed和中国知网数据库,以“牙髓干细胞,成骨分化,成牙本质分化,低氧,机械力,激光,磁场,微重力”为中文检索词,以“dental pulp stem cells(DPSCs),osteogenesis differentiation,odontoblastic differentiation,hypoxia,mechanical force,laser therapy,magnetic fields,microgravity”为英文检索词,选取与影响牙髓干细胞成骨/成牙本质分化相关物理因素有关的79篇文献进行综述。结果与结论:(1)微环境中直接或间接的物理信号在调控牙髓干细胞定向分化方面展现出了广阔的应用前景。低氧、力学刺激(动静水压力、机械牵张力及剪切力等)、激光、微重力和磁场等相关物理因素对牙髓干细胞的影响以促进成骨/成牙本质分化为主,因口颌系统拥有复杂的力学环境,力学刺激是细胞环境改变的关键物理因素,同时也是组织工程的一个前沿领域,深入探讨牙髓干细胞对力学环境的响应为口腔疾病的诊断及治疗提供新思路。(2)因该领域比较“年轻”,相关因素涉及的设备参数尚未统一,相关结果存在不一致性,未能达成共识,之后应进一步探索及优化相关物理因素的最佳诱导参数及作用条件。(3)支架材料作为组织工程的三要素之一,在牙髓干细胞成骨/成牙本质分化方面也起到了促进作用,同时也推动了材料学的发展及临床技术的进步。(4)其中涉及到的信号通路有Notch,Wnt,MAPK等,关于物理刺激如何调控牙髓干细胞行为的相关生物学基础尚未明确,未来将进一步探究其具体作用机制,为物理因素影响下的牙髓再生及骨组织工程提供新思路。

牙髓干细胞成牙向分化的研究进展

牙髓干细胞(DPSCs)是一类牙源性间充质干细胞,在一定影响因素作用下可分化为成牙本质细胞,形成修复性牙本质,这对临床治疗牙髓病及修复具有指导意义。本文系统性回顾了DPSCs成牙分化的影响因素,包括生物因素、化学因素、物理因素、基因转染、生物材料等,探究影响DPSCs向成牙本质细胞分化的条件,为龋病、牙髓及根尖周病的修复治疗以及其他领域的应用提供理论基础。

白藜芦醇在人牙髓干细胞成牙本质向分化中的调控机制研究

目的:探讨白藜芦醇是否通过上调沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)的表达并激活β-catenin信号通路,从而促进人牙髓干细胞(DPSCs)成牙本质向分化。方法:不同浓度白藜芦醇(0、10、15、20、50μmol/L)作用于DPSCs 7天和14天后,利用CCK-8法检测细胞增殖活性。在15μmol/L白藜芦醇作用下,成牙本质向分化诱导培养DPSCs 7天后,检测碱性磷酸酶(ALP)活性;采用实时定量反转录PCR(qRT-PCR)检测Runt相关转录因子2(Runx2)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白1(DMP-1)的mRNA表达情况;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测DPSCs分化诱导不同时间(0、3、5、7、14天)后SIRT1的蛋白表达情况。15μmol/L白藜芦醇作用下分化诱导培养DPSCs 7天后,检测SIRT1和活化β连环蛋白(β-catenin)表达水平。采用GraphPad Prism 9软件包对数据进行统计学分析。结果:15μmol/L白藜芦醇对DPSCs 7天和14天的增殖活性无明显影响;15μmol/L白藜芦醇促进DPSCs的成牙本质向分化,上调Runx2、DSPP和DMP-1的mRNA表达。DPSCs分化诱导7天时,SIRT1蛋白表达量最大;15μmol/L白藜芦醇作用下分化诱导DPSCs 7天时,SIRT1及活化β-catenin蛋白表达显著增加。结论:白藜芦醇通过上调SIRT1蛋白表达并激活β-catenin信号通路,促进人DPSCs成牙本质向分化。

血管生成素4对牙髓干细胞成牙本质向分化的作用

目的探讨血管生成素4(angiopoietin 4,ANGPT4)对牙髓干细胞成牙本质向分化的影响。方法本实验研究已通过单位伦理委员会审查批准,并获得患者知情同意。将人前磨牙进行固定、脱钙、脱水、包埋和切片,免疫荧光染色观察ANGPT4的表达及定位。体外分离培养人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs),于倒置相差显微镜下观察hDPSCs的生长状态及形态;流式细胞术检测细胞表面相关分子标志物的表达;碱性磷酸酶和茜素红S染色鉴定hDPSCs成牙本质向分化的潜能;油红O染色鉴定hDPSCs成脂向分化潜能。提取hDPSCs成牙本质向诱导后不同时间点的RNA,采用RT-qPCR分析hDPSCs体外成牙本质向分化过程中ANGPT4基因及成牙本质细胞相关基因的表达。采用siRNA基因沉默技术沉默hDPSCs中ANGPT4基因的表达,通过RT-qPCR和Western blot检测沉默效率;在hDPSCs中沉默ANGPT4基因表达24 h后进行成牙本质向诱导,在诱导的第7天和14天分别进行碱性磷酸酶和茜素红S染色,检测沉默ANGPT4后hDPSCs的成牙本质向分化能力。结果人前磨牙的免疫荧光染色结果显示,ANGPT4在成牙本质细胞及成牙本质细胞下层多细胞区中表达。hDPSCs经分离培养14 d后状态良好,镜下观察到多个细胞集落,细胞形态均一,呈长梭形;流式细胞术结果显示,hDPSCs表达间充质干细胞标志物CD105(90.42%)和CD90(97.15%),不表达造血细胞标志物CD45(0.01%)和CD34(0.08%)。将hDPSCs进行成牙本质向和成脂向诱导培养后,碱性磷酸酶染色、茜素红S染色和油红O染色均呈阳性。RT-qPCR结果显示,ANGPT4在hDPSCs分化的第5、7、11和14天均高表达(P<0.05),其中第5天表达水平最高。转染si-ANGPT4后,hDPSCs的ANGPT4 mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.05);碱性磷酸酶染色结果显示,si-ANGPT4组ALP染色强度和面积均显著低于阴性对照组;茜素红S染色结果显示,si-ANGPT4组钙结节形成明显低于阴性对照组。结论ANGPT4基因在人前磨牙成牙本质细胞及下层多细胞区中表达;ANGPT4可能促进hDPSCs成牙本质向分化。

黄芩苷通过调节自噬在炎症牙髓中发挥抗炎及促进成牙/骨向分化作用的研究初探

目的:初步探讨黄芩苷(BA)在炎症牙髓中发挥抗炎及促进成牙/骨分化作用机制。方法:用酶消化法分离提取牙髓干细胞(DPSCs),CCK-8检测不同浓度BA对DPSCs与单核-巨噬细胞(THP-1)细胞活力的影响,通过碱性磷酸酶(ALP)活性检测及染色筛选BA促进DPSCs表达ALP活性的最佳浓度;用脂多糖(LPS)构建体外炎性微环境,采用实时荧光定量PCR、Western blot检测BA对DPSCs成牙/骨向分化相关蛋白和基因表达水平变化,采用免疫荧光染色、Western bolt检测细胞自噬相关蛋白泛素结合蛋白(p62)和微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)的表达水平。诱导THP-1成炎症状态的M1,采用实时荧光定量PCR检测BA对其白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。结果:当浓度≤30μmol/L时,BA对DPSCs的增殖无明显抑制(P>0.05),0~100μmol/L浓度的BA对THP-1细胞增殖无影响(P>0.05)。经10μmol/L BA处理LPS刺激后的DPSCs,其ALP活性增加最明显(P<0.01),牙本质涎蛋白(DSP)、Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子OSX、骨钙素(OCN)蛋白和基因的表达均上调(P<0.05),自噬相关蛋白p62下调,微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)表达上调(P<0.01)。LPS可增加THP-1中IL-1β、TNF-α、iNOS的表达(P<0.01),而10μmol/L BA处理后上述指标均下调(P<0.05)。结论:BA可能通过调节细胞自噬在炎症牙髓细胞中发挥抗炎作用,并促进其成牙/骨向分化。

miR-20a-3p基因干扰对人牙髓干细胞成牙本质分化的影响及信号通路调控机制

目的:探讨miR-20a-3p基因干扰对人牙髓干细胞(hDPSCs)成牙本质分化的影响及信号通路调控机制。方法:对hDPSCs转染miR-20a-3p-mimic和miR-20a-3p-inhibitor来上调或下调其表达,然后对hDPSCs进行成牙本质分化诱导培养。通过茜素红染色观察细胞钙基质的矿化程度并检测ALP活性。通过双荧光素酶报告基因测定实验验证miR-20a-3p与mothers against decapentaplegic homolog(SMAD)特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMURF1)的靶向调节关系。通过RT-qPCR检测hDPSCs中miR-20a-3p以及SMURF1、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙蛋白(OCN)和牙本质涎磷蛋白(DSPP)mRNA水平。结果:与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的茜素红相对染色强度升高了67.09%,miR-20a-3p-inhibitor组降低了46.13%(P<0.05)。与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的相对ALP活性升高了52.89%,miR-20a-3p-inhibitor组降低了53.32%(P<0.05)。与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的RUNX2、OCN和DSPP mRNA相对表达量分别升高了2.19倍、1.86倍和2.35倍,miR-20a-3p-inhibitor组分别降低了63.26%、58.84%和68.12%(P<0.05)。双荧光素酶报告基因测定显示miR-20a-3p靶向抑制SMURF1(P<0.05)。过表达SMURF1抑制了miR-20a-3p对成牙本质分化的影响(P<0.05)。结论:miR-20a-3p通过靶向抑制SMURF1及其下游基因促进hDPSCs的成牙本质分化。

LED红光上调MAPK信号促进炎性环境中人牙髓干细胞成骨/成牙本质分化

目的探讨发光二极管(light-emitting diode,LED)红光对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)成骨/成牙本质分化的影响及机制。方法本实验研究已通过单位伦理委员会审查批准。组织块酶消化法培养hDPSCs,在0、1、5、10μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下,CCK-8法检测hDPSCs增殖,筛选LPS刺激浓度。设置CG组(矿化诱导)、LPS+CG组、LPS+CG+LED光照组(能量分别为2、4、6、8、10 J/cm^(2))。第7天进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性测定,实时荧光定量PCR检测ALP、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)、牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialo-phosphoprotein,DSPP)基因表达情况,第21天进行茜素红染色及钙结节定量分析,筛选最佳光照能量。设置LPS+CG组、LPS+CG+LED组(最佳能量),ELISA法检测第1、3、5、7天肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白介素-1β(interlenkin-1β,IL-1β)表达量。Western blot法检测细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38、细胞外调节蛋白激酶5(extracellular regulated protein kinases 5,ERK5)及磷酸化蛋白表达。分别阻断ERK1/2、JNK、ERK5、p38通路后,Western blot法检测第7天ALP、OSX、DMP-1、DSPP蛋白表达。结果CCK-8结果显示10μg/mL LPS诱导下,在第5、7天hDPSCs增殖低于0、1、5μg/mL LPS组(P<0.05),后续选择10μg/mL作为LPS刺激浓度。ALP染色及活性,ALP、OSX、DMP-1、DSPP的基因表达水平及钙结节定量结果示LPS+CG+4 J/cm^(2)组均高于其他处理组(P<0.05)。4 J/cmLED红光上调MAPK信号促进炎性环境中人牙髓干细胞成骨/成牙本质分化LED红光促成骨/成牙本质分化能力最强,作为后续实验光照能量。ELISA结果显示第5、7天,LPS+CG+LED组的TNF-α与IL-1β的分泌表达量低于LPS+CG组(P<0.05)。Western blot结果显示4 J/cm^(2) LED红光促进p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、p-ERK5蛋白表达;分别阻断通路后,LPS+CG+LED+U0126(抑制ERK1/2)、SP600125(抑制JNK)、BIX02189(抑制ERK5)组ALP、OSX、DMP-1、DSPP蛋白表达量低于LPS+CG+LED组(P<0.001),LPS+CG+LED+SB203580(抑制p38)组ALP、OSX、DMP-1蛋白表达量与LPS+CG+LED组比较无显著差异(P>0.05)。结论LED红光促进炎症环境下hDPSCs成骨/成牙本质分化,其作用机制可能为通过上调ERK1/2、JNK、ERK5信号减少炎症因子TNF-α与IL-1β释放有关。

miR-140-3p靶向调控KMT5B对老年牙髓干细胞成牙本质分化的影响及机制

目的 分析微小RNA(miR)-140-3p靶向调控甲基转移酶(KMT)5B对老年牙髓干细胞成牙本质分化的影响及机制。方法 采用实时荧光定量法进行鉴定miR-140-3p、KMT5B表达量,通过倒置显微镜对矿化结节情况进行观察,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况,通过Western印迹对成牙关键转录因子Runt相关转录因子(RUNX)2、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨桥蛋白(OPN)、P21、细胞周期蛋白(Cyclin)D1相对表达量进行检测。结果 与未分化牙髓干细胞对比,分化牙髓干细胞miR-140-3p表达量显著升高,KMT5B表达量显著降低(P<0.05)。与si-NC组相比,si-miR-140-3p组miR-140-3p表达显著降低(P<0.05),表明干扰miR-140-3p的牙髓干细胞株构建成功,与si-NC组相比,si-miR-140-3p组矿化结节相对数量、Runx2蛋白、DSPP蛋白、OPN蛋白、OD值、CyclinD1显著降低,P21显著升高(P<0.05)。与KMT5B-NC组相比,KMT5B组KMT5B表达量升高(P<0.05),表明上调KMT5B的牙髓干细胞构建成功,与KMT5B-NC组相比,KMT5B组矿化结节相对数量、Runx2蛋白、DSPP蛋白、OPN蛋白、OD值、CyclinD1显著降低,P21显著升高(P<0.05)。双荧光素酶报告试验显示,与KMT5B-NC组相比,KMT5B可使WT-miR-140-3p荧光素酶活性显著降低(P<0.05),对MUT-miR-140-3p荧光素酶活性影响较小(P>0.05)。与si-NC组相比,抑制miR-140-3p表达可使牙髓干细胞中KMT5B表达显著升高(P<0.05),与si-miR-140-3p+anti-KMT5B-NC组相比,si-miR-140-3p+anti-KMT5B组矿化结节相对数量、Runx2蛋白、DSPP蛋白、OPN蛋白、OD值、CyclinD1显著升高,P21显著降低(P<0.05)。结论 干扰miR-140-3p可通过靶向调控KMT5B表达,促进牙髓干细胞成牙本质分化及增殖。

GREM1对根尖牙乳头干细胞成骨/成牙分化功能的影响机制研究

目的研究骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)拮抗剂Gremlin1(GREM1)对根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla,SCAPs)功能的影响,并探索其机制。方法体外分离培养SCAPs,免疫荧光染色实验检测GREM1在SCAPs的亚细胞定位;利用GREM1shRNA慢病毒转染,敲低GREM1;分别对GREM1敲低组和对照组SCAPs进行成骨诱导,实时荧光定量PCR(Real time-PCR)和Western blot检测转染后GREM1的敲低效果。取两组细胞,成骨诱导7 d后进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定,成骨/成牙本质诱导3周后进行茜素红染色,并用Real time-PCR检测成骨诱导0周、1周、2周、3周后成骨/成牙相关基因骨钙素(OCN)、骨桥素(OPN)、骨涎蛋白(BSP)、牙本质基质蛋白(DMP1)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)以及成骨/成牙关键转录因子Runt相关转录因子2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、同源盒基因2(DLX2)的表达。取两组细胞,CCK8和流式细胞术检测细胞增殖能力变化;Real time-PCR检测衰老相关基因p53、细胞周期调控因子1(Waf1)和干性相关基因krupple样因子4(KLF4)、性别决定区Y框蛋白2(SOX2)的表达,以及BMPs相关基因(BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP9)的表达。结果免疫荧光实验表明GREM1在胞核内表达量比胞浆中更高;Real time-PCR和Western blot验证了GREM1敲低组的敲低效果。GREM1敲低组ALP活性高于对照组(P<0.05),茜素红染色浅于对照组;OCN、DMP1在1周、2周、3周时表达均有升高,OPN在2周时升高,BSP在3周时升高,DSPP在1周时升高,差异有统计学意义(P<0.05),成骨关键转录因子RUNX2、OSX、DLX2均在不同时段升高,差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8法和流式细胞术显示GREM1敲低组增殖能力较对照组下降(P<0.05)。与对照组相比,GREM1敲低组BMP2、BMP6、BMP7表达升高,SOX2、KLF4表达升高(P<0.05),P53、Waf1表达下降(P<0.05)。结论GREM1敲低后,能促进SCAPs成骨/成牙分化及干性,抑制SCAPs的增殖及衰老;GREM1对SCAPs的功能作用可能是通过在mRNA水平调控BMP2、BMP6、BMP7的表达实现的。