低浓度氟化钠对人牙髓细胞的成骨/成牙本质分化的影响

目的探讨低浓度氟化钠对人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)成骨/成牙本质分化的影响。方法本研究已通过单位伦理委员会审查批准。原代培养hDPCs,采用MTT法检测不同浓度氟化钠对hDPCs增殖的影响;选取合适浓度的氟化钠加入成骨/成牙本质分化诱导培养液中,对hDPCs进行体外诱导,通过茜素红染色检测hDPCs成骨/成牙本质分化能力的变化,RT⁃qPCR检测分化相关基因的mRNA表达;同时通过RT⁃qPCR和Western blot检测hDPCs成骨/成牙本质分化过程中内质网应激相关基因的表达。结果低浓度氟化钠(0.1 mmol/L)在体外可刺激hDPCs增殖,高浓度氟化钠(5~10 mmol/L)可抑制hDPCs增殖(P<0.05)。选取0.1 mmol/L氟化钠体外混合成骨/成牙本质分化诱导培养后hDPCs的茜素红染色增加,成骨/成牙本质分化相关基因牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)mRNA表达水平升高(P<0.05)。同时在此过程中RT⁃qPCR检测出mRNA水平hDPCs内质网应激相关基因:剪切x盒结合蛋白1(splicing x⁃box binding protein⁃1,sXBP1)、葡萄糖调节蛋白78(glucose⁃regulated protein 78,GRP78)以及活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)表达升高(P<0.05);Western blot检测出氟化钠混合成骨/成牙本质分化培养后细胞磷酸化真核起始因子⁃2α(phosphorylated eukary⁃otic initiation factor⁃2α,p⁃eIF2α)、磷酸化蛋白激酶样内质网激酶(phosphorylated the RNA⁃activated protein kinase⁃like ER⁃resident kinase,p⁃PERK)和ATF4蛋白表达增加(P<0.05)。结论低剂量氟化钠促进人牙髓细胞的成骨/成牙本质分化并伴有内质网应激水平的升高。

影响牙髓干细胞成骨及成牙本质分化的相关物理因素及作用机制

背景:牙髓干细胞是口腔颌面部组织工程中极具应用潜力的干细胞之一,较骨髓间充质干细胞具有采集方便、伦理问题少以及增殖分化潜能高等优势。目前,除了生物化学等因素外,物理刺激对于牙髓干细胞的成骨/成牙本质分化也起着关键性的作用。目的:综述影响牙髓干细胞成骨/成牙本质分化的相关物理因素以及可能涉及的信号传导通路作用机制,寻找影响其分化的最佳诱导条件。方法:检索PubMed和中国知网数据库,以“牙髓干细胞,成骨分化,成牙本质分化,低氧,机械力,激光,磁场,微重力”为中文检索词,以“dental pulp stem cells(DPSCs),osteogenesis differentiation,odontoblastic differentiation,hypoxia,mechanical force,laser therapy,magnetic fields,microgravity”为英文检索词,选取与影响牙髓干细胞成骨/成牙本质分化相关物理因素有关的79篇文献进行综述。结果与结论:(1)微环境中直接或间接的物理信号在调控牙髓干细胞定向分化方面展现出了广阔的应用前景。低氧、力学刺激(动静水压力、机械牵张力及剪切力等)、激光、微重力和磁场等相关物理因素对牙髓干细胞的影响以促进成骨/成牙本质分化为主,因口颌系统拥有复杂的力学环境,力学刺激是细胞环境改变的关键物理因素,同时也是组织工程的一个前沿领域,深入探讨牙髓干细胞对力学环境的响应为口腔疾病的诊断及治疗提供新思路。(2)因该领域比较“年轻”,相关因素涉及的设备参数尚未统一,相关结果存在不一致性,未能达成共识,之后应进一步探索及优化相关物理因素的最佳诱导参数及作用条件。(3)支架材料作为组织工程的三要素之一,在牙髓干细胞成骨/成牙本质分化方面也起到了促进作用,同时也推动了材料学的发展及临床技术的进步。(4)其中涉及到的信号通路有Notch,Wnt,MAPK等,关于物理刺激如何调控牙髓干细胞行为的相关生物学基础尚未明确,未来将进一步探究其具体作用机制,为物理因素影响下的牙髓再生及骨组织工程提供新思路。

LED红光上调MAPK信号促进炎性环境中人牙髓干细胞成骨/成牙本质分化

目的探讨发光二极管(light-emitting diode,LED)红光对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)成骨/成牙本质分化的影响及机制。方法本实验研究已通过单位伦理委员会审查批准。组织块酶消化法培养hDPSCs,在0、1、5、10μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下,CCK-8法检测hDPSCs增殖,筛选LPS刺激浓度。设置CG组(矿化诱导)、LPS+CG组、LPS+CG+LED光照组(能量分别为2、4、6、8、10 J/cm^(2))。第7天进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性测定,实时荧光定量PCR检测ALP、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)、牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialo-phosphoprotein,DSPP)基因表达情况,第21天进行茜素红染色及钙结节定量分析,筛选最佳光照能量。设置LPS+CG组、LPS+CG+LED组(最佳能量),ELISA法检测第1、3、5、7天肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白介素-1β(interlenkin-1β,IL-1β)表达量。Western blot法检测细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38、细胞外调节蛋白激酶5(extracellular regulated protein kinases 5,ERK5)及磷酸化蛋白表达。分别阻断ERK1/2、JNK、ERK5、p38通路后,Western blot法检测第7天ALP、OSX、DMP-1、DSPP蛋白表达。结果CCK-8结果显示10μg/mL LPS诱导下,在第5、7天hDPSCs增殖低于0、1、5μg/mL LPS组(P<0.05),后续选择10μg/mL作为LPS刺激浓度。ALP染色及活性,ALP、OSX、DMP-1、DSPP的基因表达水平及钙结节定量结果示LPS+CG+4 J/cm^(2)组均高于其他处理组(P<0.05)。4 J/cmLED红光上调MAPK信号促进炎性环境中人牙髓干细胞成骨/成牙本质分化LED红光促成骨/成牙本质分化能力最强,作为后续实验光照能量。ELISA结果显示第5、7天,LPS+CG+LED组的TNF-α与IL-1β的分泌表达量低于LPS+CG组(P<0.05)。Western blot结果显示4 J/cm^(2) LED红光促进p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、p-ERK5蛋白表达;分别阻断通路后,LPS+CG+LED+U0126(抑制ERK1/2)、SP600125(抑制JNK)、BIX02189(抑制ERK5)组ALP、OSX、DMP-1、DSPP蛋白表达量低于LPS+CG+LED组(P<0.001),LPS+CG+LED+SB203580(抑制p38)组ALP、OSX、DMP-1蛋白表达量与LPS+CG+LED组比较无显著差异(P>0.05)。结论LED红光促进炎症环境下hDPSCs成骨/成牙本质分化,其作用机制可能为通过上调ERK1/2、JNK、ERK5信号减少炎症因子TNF-α与IL-1β释放有关。

miR-20a-3p基因干扰对人牙髓干细胞成牙本质分化的影响及信号通路调控机制

目的:探讨miR-20a-3p基因干扰对人牙髓干细胞(hDPSCs)成牙本质分化的影响及信号通路调控机制。方法:对hDPSCs转染miR-20a-3p-mimic和miR-20a-3p-inhibitor来上调或下调其表达,然后对hDPSCs进行成牙本质分化诱导培养。通过茜素红染色观察细胞钙基质的矿化程度并检测ALP活性。通过双荧光素酶报告基因测定实验验证miR-20a-3p与mothers against decapentaplegic homolog(SMAD)特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMURF1)的靶向调节关系。通过RT-qPCR检测hDPSCs中miR-20a-3p以及SMURF1、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙蛋白(OCN)和牙本质涎磷蛋白(DSPP)mRNA水平。结果:与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的茜素红相对染色强度升高了67.09%,miR-20a-3p-inhibitor组降低了46.13%(P<0.05)。与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的相对ALP活性升高了52.89%,miR-20a-3p-inhibitor组降低了53.32%(P<0.05)。与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的RUNX2、OCN和DSPP mRNA相对表达量分别升高了2.19倍、1.86倍和2.35倍,miR-20a-3p-inhibitor组分别降低了63.26%、58.84%和68.12%(P<0.05)。双荧光素酶报告基因测定显示miR-20a-3p靶向抑制SMURF1(P<0.05)。过表达SMURF1抑制了miR-20a-3p对成牙本质分化的影响(P<0.05)。结论:miR-20a-3p通过靶向抑制SMURF1及其下游基因促进hDPSCs的成牙本质分化。

miR-140-3p靶向调控KMT5B对老年牙髓干细胞成牙本质分化的影响及机制

目的 分析微小RNA(miR)-140-3p靶向调控甲基转移酶(KMT)5B对老年牙髓干细胞成牙本质分化的影响及机制。方法 采用实时荧光定量法进行鉴定miR-140-3p、KMT5B表达量,通过倒置显微镜对矿化结节情况进行观察,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况,通过Western印迹对成牙关键转录因子Runt相关转录因子(RUNX)2、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨桥蛋白(OPN)、P21、细胞周期蛋白(Cyclin)D1相对表达量进行检测。结果 与未分化牙髓干细胞对比,分化牙髓干细胞miR-140-3p表达量显著升高,KMT5B表达量显著降低(P<0.05)。与si-NC组相比,si-miR-140-3p组miR-140-3p表达显著降低(P<0.05),表明干扰miR-140-3p的牙髓干细胞株构建成功,与si-NC组相比,si-miR-140-3p组矿化结节相对数量、Runx2蛋白、DSPP蛋白、OPN蛋白、OD值、CyclinD1显著降低,P21显著升高(P<0.05)。与KMT5B-NC组相比,KMT5B组KMT5B表达量升高(P<0.05),表明上调KMT5B的牙髓干细胞构建成功,与KMT5B-NC组相比,KMT5B组矿化结节相对数量、Runx2蛋白、DSPP蛋白、OPN蛋白、OD值、CyclinD1显著降低,P21显著升高(P<0.05)。双荧光素酶报告试验显示,与KMT5B-NC组相比,KMT5B可使WT-miR-140-3p荧光素酶活性显著降低(P<0.05),对MUT-miR-140-3p荧光素酶活性影响较小(P>0.05)。与si-NC组相比,抑制miR-140-3p表达可使牙髓干细胞中KMT5B表达显著升高(P<0.05),与si-miR-140-3p+anti-KMT5B-NC组相比,si-miR-140-3p+anti-KMT5B组矿化结节相对数量、Runx2蛋白、DSPP蛋白、OPN蛋白、OD值、CyclinD1显著升高,P21显著降低(P<0.05)。结论 干扰miR-140-3p可通过靶向调控KMT5B表达,促进牙髓干细胞成牙本质分化及增殖。

富血小板血浆对人牙髓干细胞/内皮细胞共培养体外成牙本质分化的影响

目的:探讨人牙髓干细胞(hDPSCs)与内皮祖细胞(EPCs)在体外成牙本质分化中的相互作用以及富血小板血浆(PRP)对其增殖和矿化的影响。方法:体外分离培养hDPSCs和EPCs,并将两者单独或共同接种于含PRP或FBS的DMEM中进行培养,分别于培养1、3、5、7、9 d,MTT法检测各组细胞的增殖活性;然后再按上述相同方法接种细胞并进行矿化诱导,分别于诱导后7 d和14 d,qRT-PCR检测各组细胞的碱性磷酸酶(ALP)、牙本质基质蛋白1(DMP-1)及牙本质涎磷蛋白(DSPP)mRNA的表达水平。结果:无论是单种细胞培养还是两种细胞共同培养,含PRP各组细胞的增殖活性均明显高于含FBS各组(P<0.05);ALP、DMP-1、DSPP mRNA的表达水平也均为含PRP组明显高于含FBS组(P<0.05);而且在相同培养条件下,两种细胞共同培养组的各基因表达水平均明显高于各细胞单独培养组(P<0.05)。结论:PRP有维持和促进hDPSCs、EPCs增殖的能力;并可促进hDPSCs向成牙本质分化,两细胞共同培养时其促进作用更明显。

高迁移率族蛋白B1在人牙髓细胞成牙本质分化中的表达

目的:检测人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)诱导矿化过程中高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1)的表达变化,探讨HMGB1在人牙髓细胞损伤修复中的可能作用。方法:组织块法分离培养hDPCs,收集矿化诱导0、3、7、11、14d后hDPCs的mRNA、蛋白质及细胞爬片,实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(western blot)分别检测HMGB1、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1,DMP1)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的mRNA及蛋白表达水平;并检测ALP活性,免疫荧光检测HMGB1在hDPCs矿化过程中的表达。结果:hDPCs矿化诱导后,DMP1、DSPP、ALP及HMGB1的mRNA表达显著性上调,DMP1、DSPP和ALP的mRNA以及碱性磷酸酶活性在诱导7d、11d和14d后与对照组间差异有统计学意义(P<0.05),HMGB1mRNA在矿化诱导11d和14d后与对照组的差异具有统计学意义(P<0.05)。蛋白印迹法检测示细胞内各矿化标记的蛋白表达均较对照组上调,而细胞内HMGB1的蛋白表达较对照组下调。免疫荧光结果显示hDPCs矿化过程中,HMGB1逐渐从胞核转移至胞浆。结论:在hDPCs诱导成牙本质细胞分化过程中,HMGB1在mRNA水平上与DMP1、DSPP和ALP的表达变化趋势相似,而细胞内HMGB1蛋白水平表达下调,且HMGB1在hDPCs细胞内出现转位,提示HMGB1与hDPCs的成牙本质分化有关,可能在牙髓细胞损伤修复中发挥作用。

人脱落乳牙牙髓干细胞与恒牙牙髓干细胞成牙本质分化能力的比较

目的:探讨人脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)和恒牙牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成牙本质分化能力的差异,以及肝配蛋白B1(ephrinB1)的表达水平在两种细胞成牙本质分化过程中的变化。方法:将牙髓干细胞分为SHED组和DPSCs组,对两组细胞进行成牙本质诱导,再将SHED组和DPSCs组分别随机分为3 d组和7 d组。采用碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和茜素红染色检测钙盐沉积;real-time PCR和蛋白质印迹法分别检测ephrinB1以及牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1,DMP-1)和牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的mRNA和蛋白质表达。结果:SHED组ALP染色和茜素红染色均明显深于DPSCs组;除SHED 3 d组DMP-1的蛋白质表达外,SHED组DMP-1,DSPP和ephrinB1的mRNA和蛋白质表达水平均高于DPSCs组(均P<0.05)。结论:SHED较DPSCs具有更强的成牙本质分化能力,ephrinB1可能参与SHED和DPSCs成牙本质分化的调节。

硅化胶原对人牙髓干细胞成牙本质分化的影响

目的:通过观察硅化胶原支架材料对人牙髓干细胞牙本质再生相关基因表达的影响,探讨其对成牙本质细胞分化和牙本质再生的促进作用。方法:体外培养人牙髓干细胞,分别与硅化胶原、胶原材料复合,构建细胞-支架复合体后,置于矿化诱导液和常规培养液中培养。分别于培养48 h和2周、3周时,扫描电镜和HE染色观察不同培养条件下牙髓干细胞在两种胶原支架材料上的生长情况;半定量PCR、实时定量PCR法比较各组DSPP、DMP-1、OCNmRNA表达水平的差异。结果:人牙髓干细胞在硅化胶原支架材料上生长情况与胶原材料组相比无明显差异;胶原支架材料经硅化处理后能明显促进DSPP、DMP-1、OCN等牙本质再生相关基因的表达。结论:胶原支架材料经硅化处理后能促进人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化。

LMK-235对牙周膜细胞成骨和成牙本质分化的影响

目的探讨Ⅱa类组蛋白去乙酰化酶抑制剂LMK-235对人牙周膜细胞(human periodontal ligamentcells,h PDLCs)早期成骨和成牙本质分化的影响。方法通过酶消化法获得h PDLCs,分别用浓度为0、50、100、250、500 nmol/L的LMK-235处理第三代h PDLCs 3 d。MTT法检测h PDLCs的增殖,同时q RT-PCR检测成骨及成牙本质相关因子Runx2、ALP及DMP-1 m RNA的表达水平。结果 MTT结果显示100 nmol/L的LMK-235对h PDLCs增殖具有促进作用。q RT-PCR结果表明100 nmol/L处理组Runx2 m RNA的表达水平为对照组的1.77倍(P<0.05);而ALP m RNA的表达水平在实验组均高于对照组(P<0.05),同时100 nmol/L处理组表达量最高;DMP-1 m RNA的表达水平在50 nmol/L及100 nmol/L组较对照组升高(P<0.05)。结论浓度为100 nmol/L的Ⅱa类组蛋白去乙酰化酶抑制剂LMK-235促进h PDLCs增殖,并通过上调Runx2、ALP、DMP-1等成骨及成牙本质相关因子m RNA表达来促进h PDLCs早期成骨及成牙本质分化。

组蛋白去甲基化酶FBXL11抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化

目的研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响。方法成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化。逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究。碱性磷酸酶活性实验及碱性磷酸酶染色检测成骨/成牙本质分化早期分化指标-碱性磷酸酶活性。茜素红染色及钙离子定量分析检测牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化能力。实时定量RTPCR检测FBXL11及成骨/成牙本质分化相关基因-骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素的表达。结果成骨诱导牙髓干细胞抑制FBXL11的表达。过表达FBXL11明显抑制牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、牙髓干细胞体外矿化能力以及骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达。结论组蛋白去甲基化酶FBXL11具有抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化的潜能。

BMP9通过ERK5信号通路调控根尖牙乳头干细胞成骨／成牙本质分化

目的研究骨形成蛋白9(BMP9)是否通过激活ERK5信号通路调控永生化根尖牙乳头干细胞(i SCAP)成骨/成牙本质向分化。方法首先使用ERK5抑制剂BIX02189作用于BMP9的腺病毒转染i SCAP,采用Western blotting检测ERK5蛋白的磷酸化水平变化;然后通过碱性磷酸酶(ALP)染色、RT-PCR及茜素红染色检测成骨/成牙本质相关基因Runx2、OCN、OPN和DMP1的表达,研究BMP9对i SCAP成骨/成牙本质分化的影响。结果 BMP9可以上调ERK5磷酸化水平,BIX02189干预后ERK5磷酸化下降;ALP染色,RT-PCR检测表达及茜素红染色均发现BMP9可以促进Runx2、OCN、OPN、DMP1阳性表达,而BIX02189则抑制成骨/成牙本质分化。结论 BMP9可以通过激活ERK5信号通路促进根尖牙乳头干细胞成骨/成牙本质分化。

miR-146a-5p对人牙髓干细胞成牙本质分化的影响

目的:探讨miR-146a-5p对人牙髓干细胞成牙本质分化的调控作用。方法:前期通过二代测序技术检测人牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞中miRNAs的差异表达,用qRT-PCR验证前期筛选出的7个miRNAs的表达水平。通过重组慢病毒转染人牙髓干细胞,特异性上调miR-146a-5p后进行成牙本质诱导,用茜素红染色,碱性磷酸酶活性检测和qRT-PCR的方法检测成牙本质分化能力的改变。结果:miR-146a-5p在人牙髓干细胞中的表达显著高于根尖牙乳头干细胞。过表达miR-146a-5p后矿化结节、ALP活性和成牙本质分化标志基因表达增加。结论:miR-146a-5p促进人牙髓干细胞向成牙本质分化。

根尖牙乳头干细胞成牙本质分化的研究进展

牙根的发育在牙冠发育即将完成之际开始,由成釉器的内釉上皮与外釉上皮在颈环处向未来根尖孔方向增生,形成上皮根鞘,进而启动牙根的发育。上皮根鞘生成之后,其内侧的牙乳头细胞也向根尖方向增生,牙乳头的外周细胞与上皮根鞘的基底膜紧密结合,使得牙乳头间质细胞分化成成牙本质细胞,后者形成原发性牙本质,将牙乳头包围起来并使其发育成为牙髓。

MEPE基因沉默对人牙髓细胞增殖与成牙本质分化的作用研究

目的:研究细胞外基质磷酸化糖蛋白(Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein,MEPE)基因沉默对人牙髓细胞(Human Dental Pulp Cells,hDPCs)增殖和成牙本质分化能力的影响,探讨其在牙髓损伤修复中的功能。方法:酶消化组织块法分离培养hDPCs,以lipo2000介导siRNA-hMEPE转染hDPCs,以阴性对照组和未转染组设为对照,1、3、5、7d后,CCK-8法检测细胞增殖情况;转染hDPCs后以矿化诱导液培养5、7、10d后,实时荧光定量RT-PCR检测骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、牙本质涎磷蛋白(Dentin Sialoph osph oprotein,DSPP)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、Collagen I mRNA表达水平。结果:CCK-8结果显示Si-h-MEPE转染h DPCs 1d后OD值下降,3d时到达最低值,且均低于未转染组与阴性对照组,3d时差异有统计学差异(P<0.05),未转染组与阴性对照组中,OD值持续升高,7d时到达峰值,与各自组内其他时间点比较有统计学差异(P<0.05);ALP活性检测结果显示,Si-h-MEPE转染hDPCs 3d细胞OD值最低,且明显低于未转染组与阴性对照组(P<0.05),未转染组与阴性对照组hDPCs OD值呈现逐渐升高趋势,在7d时达到最大值(P<0.05)。Si-h-MEPE转染h DPCs 3d时BSP、DSPP、OCN、Collagen I mRNA的表达量均较未转染组与阴性对照组下调(P<0.05)。在未转染组中,BSP、DSPP、OCN、Collagen I mRNA水平持续升高,在7d时达最高值,与3d比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:MEPE基因瞬时沉默抑制h DPCs增殖、使BSP、DSPP、OCN、Collagen I基因表达下调,ALP活性降低,与未转染组与阴性对照组比较结果提示MEPE可能通过调控h DPCs的增殖和成牙本质分化能力,在牙髓损伤修复中发挥重要作用。

MiR-27a对人牙髓干细胞增殖、迁移及成牙本质分化的作用

目的探讨miR-27a对人牙髓干细胞的增殖、迁移以及成牙本质分化的影响及其潜在的分子作用机制。方法利用实时荧光定量PCR检测miR-27a以及相关基因的表达水平;分别利用CCK-8实验以及Transwell细胞迁移实验检测人牙髓干细胞的增殖以及迁移能力;通过采用双萤光素酶报告实验验证miR-27a的靶基因;利用Western blot检测相关蛋白的表达水平。结果 MiR-27a过表达可抑制人牙髓干细胞的增殖以及迁移,同时抑制成牙本质向分化相关基因(ALP,DMP1及OCN)的表达(P<0.05);miR-27a的抑制可促进人牙髓干细胞的增殖及迁移,同时增加成牙本质向分化相关基因(ALP,DMP1及OCN)的表达(P<0.05);双萤光素酶报告实验和miR-27a转染实验结果提示miR-27a可以通过作用于Satb2的3'UTR区,负向调控其mRNA及蛋白的表达水平(P<0.05);Satb2的过表达能够拮抗miR-27a过表达对人牙髓干细胞增殖及迁移的抑制(P<0.05)。结论 MiR-27a能够抑制人牙髓干细胞的增殖及迁移,同时抑制成牙本质向分化相关基因的表达,这种作用可能与调控Sabt2基因有关。

姜黄素通过Wnt信号通路调节人牙髓干细胞的成牙本质分化

背景:研究证实,姜黄素不仅可促进成体干细胞成骨分化还可通过激活Wnt信号通路促进神经干细胞的增殖与分化。但姜黄素能否通过激活Wnt信号通路促进人牙髓干细胞成牙本质分化尚未见报道。目的:探讨姜黄素对人牙髓干细胞增殖和成牙本质分化的影响及其可能机制。方法:将人牙髓干细胞(购于上海妍生实业有限公司)分为6组:正常对照组不进行干预,低、中、高浓度姜黄素组用50,250,500 nmol/L姜黄素干预,IWR-1组用1μmol/L Wnt信号通路抑制剂IWR-1干预,IWR-1+姜黄素组用1μmol/L IWR-1和500 nmol/L姜黄素干预。各组进行矿化诱导7 d和14 d后,实时定量PCR检测Wnt5a、碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白的m RNA表达;Western blot检测Wnt5a、β-catenin、骨唾液酸蛋白、牙本质涎磷蛋白、骨钙蛋白、牙本质基质蛋白1水平;比色法检测细胞碱性磷酸酶活性;CCK-8法检测细胞增殖活性。结果与结论:①姜黄素能够提高牙髓干细胞增殖活性和碱性磷酸酶活性,且呈时间和剂量依赖性;②姜黄素能够提高牙髓干细胞中牙本质涎磷蛋白、碱性磷酸酶的m RNA表达以及牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1、骨唾液酸蛋白和骨钙蛋白水平,且呈时间和剂量依赖性;③姜黄素能够提高牙髓干细胞中Wnt5a和β-catenin蛋白的表达,且呈时间和剂量依赖性;④IWR-1+姜黄素组人牙髓干细胞中Wnt5a m RNA表达以及Wnt5a、牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1、骨唾液酸蛋白及骨钙蛋白水平和增殖活性高于正常对照组和IWR-1组(P <0.05);⑤以上结果表明,姜黄素通过激活Wnt信号通路促进人牙髓干细胞的增殖和成牙本质分化。

牙髓细胞成牙本质分化的体外诱导:诱导因子及机制揭示

背景:研究表明牙髓细胞在一定条件下经诱导可以向成牙本质细胞方向分化,该过程由信号网络调控。目的:综述牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化的诱导因子及作用机制的研究进展。方法:应用计算机检索1998年1月至2014年7月中国知网(CNKI)和万方数据库相关文献,检索词"牙髓细胞,成牙本质细胞分化"限定文献语言种类为中文。同时计算机检索同期PubMed数据库相关文献,检索词"dental pulp cells,odontoblastic differentiation",限定文献种类为英文。初检所得文献467篇。包括中文214篇,英文253篇。对于初检文献,阅读标题和摘要进行初筛,排除因研究目的与本研究无关者或内容重复性的研究,最终纳入63篇文章进行综述。结果与结论:不同的诱导因子可以作为调控器,文章系统归纳了牙髓细胞在不同的诱导因子作用下,例如:骨形态发生蛋白、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及多种生长因子等,通过相关信号通路信号转导在一定程度上参与牙髓细胞向成牙本质细胞分化定向诱导。但成牙本质细胞分化是一个复杂的过程,进一步从细胞及分子水平研究成牙本质分化诱导因子及相关机制对于牙齿再生治疗临床应用具有重要意义。

Cx43通过Erk1/2促进BMP-2诱导的人牙髓细胞成牙本质分化

目的:探讨骨形态发生蛋白(BMP)-2和连接蛋白(Cx) 43在促进人牙髓细胞(hDPCs)成牙本质分化过程中的联系。方法:在hDPCs中过表达Cx43并施以300 ng/m L BMP-2刺激1 h,qRT-PCR、Western blot和免疫荧光(IF)检测成牙本质分化标记物的表达变化;检测BMP-2介导的Smad1/5/9和Erk1/2通路活性,并施加PD98059(Erk1/2抑制剂)刺激1 h,检测抑制Erk1/2后过表达Cx43对BMP-2诱导的DSPP等的表达变化影响。结果:BMP-2上调hDPCs内osterix、DSPP、DMP-1、ALP和OCN RNA水平以及osterix蛋白表达,增强hDPCs中DSPP的荧光强度。过表达Cx43明显促进BMP-2诱导的hDPCs成牙本质分化。BMP-2激活hDPCs中的Smad1/5/9通路,过表达Cx43上调hDPCs中Erk1/2磷酸化水平。抑制Erk1/2明显减弱过表达Cx43对BMP-2诱导的osterix、DSPP、DMP-1、ALP、OCN mRNA表达以及osterix蛋白水平和DSPP染色强度的增强作用。结论:Cx43通过Erk1/2促进BMP-2诱导的osterix和DSPP等表达以及hDPCs成牙本质分化。

VPS4B调控Notch通路对促进牙髓干细胞成牙本质分化的机制研究

目的探讨细胞液泡分选蛋白4B(VPS4B)对人牙髓干细胞(hDPSCs)成牙本质分化及Notch通路的影响。方法hDPSCs分正常组、矿化组、阴性对照组、VPS4B-siRNA组,除正常组(正常培养,不做任何处理)外,其余各组添加矿化液(0.785 g/L地塞米松、0.05 g/L维生素、2.16 g/Lβ-甘油磷酸钠),同时阴性对照组和VPS4BsiRNA组均用脂质体Lipofectamine 2000分别和阴性对照siRNA、VPS4B-siRNA共转染。CCK8检测细胞增殖情况;蛋白免疫印迹检测细胞中VPS4B、Notch受体释放其胞内结构域(NICD)、hairy相关转录因子1(Hey1)蛋白水平;茜素红染色观察细胞矿化情况;钙浓度检测试剂盒检测细胞钙浓度;实时荧光定量PCR检测细胞Runx2、骨桥蛋白(OPN)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)mRNA水平。结果正常组茜素红染色较浅,面积较小;矿化组、阴性对照组染色较深,且面积较大;VPS4B-siRNA组染色颜色有所减轻,面积减少。与正常组相比,矿化组、阴性对照组OD450水平,NICD、Hey1蛋白水平降低(P<0.05),矿化结节相对数量,VPS4B蛋白水平,钙浓度,Runx2、OPN、DSPP mRNA水平升高(P<0.05);VPS4B-siRNA组矿化结节相对数量,OPN、DSPP mRNA水平升高(P<0.05);OD450水平,NICD、Hey1蛋白水平降低(P<0.05)。分别与矿化组、阴性对照组相比,VPS4B-siRNA组NICD、Hey1蛋白水平升高(P<0.05);OD450水平,VPS4B蛋白水平,矿化结节相对数量,钙浓度,Runx2、OPN、DSPP mRNA水平降低(P<0.05)。结论干扰VPS4B后可抑制hDPSCs牙本质分化,并初步探究可能是通过激活Notch通路实现的。