裸鼠高成瘤性多药耐药白血病细胞系的建立及其生物学特性研究

目的:建立裸鼠高成瘤性多药耐药白血病细胞系并研究其生物学特性。方法:采用逐步递增长春新碱(VCR)剂量的方法培养高成瘤性人白血病细胞系K56g-n,采用细胞培养技术、透射电镜观察、流式细胞术、RT-PCR、免疫组化、染色体核型分析及体内接种等方法研究其生物学特性。结果:建立1株裸鼠高成瘤性人白血病多药耐药细胞系K562-n／VCR。与K562-n细胞比较,K562-n／VCR细胞对VCR耐药为其297.38倍,对蒽环类、鬼臼类等多种化疗药物具有交叉耐药性,bcr-abl融合基因仍为阳性,裸鼠体内成瘤性不变,但成瘤潜伏期缩短,成瘤体积明显增大。结论:裸鼠高成瘤性多药耐药白血病细胞系K562-n／VCR具有其独特的生物学特性。

肝癌中高表达的新基因LAPTM4B对细胞增殖及成瘤性的影响

目的 :研究在肝细胞癌中高表达的新基因LAPTM4B对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响 ,探讨LAPTM4B基因的生物学功能。方法 :构建真核表达质粒 pcDNA3 TM 4B ,利用脂质体稳定转染LAPTM 4BcDNA至NIH3T3细胞中 ,用RT -PCR、Northern和Western杂交法筛选和鉴定转染后LAPTM4B基因高表达的单克隆细胞株 ,研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果 :与转染空载体的对照组相比 ,转染了LAPTM4BcDNA的NIH3T3细胞表面发生明显变化 ,微绒毛的数量和长度增加 ,多分枝且缠绕成团。转染细胞在纤黏连蛋白、人工基膜和层黏连蛋白基质上的黏附 /铺展能力增强。生长曲线显示转染细胞的生长速率增高。流式细胞仪检测显示转染细胞的S期细胞数比未转染细胞显著增多 ,而G0 ～G1期细胞数减少。Western杂交显示CyclinE蛋白在转染细胞中的表达显著增加。转染细胞对血清的依赖性下降并具有成瘤性。结论 :LAPTM 4B基因能影响细胞增殖的调节 ,促进NIH3T3细胞的增殖 ,并使NIH3T3细胞具有成瘤性 ,在肿瘤发生过程中具有重要的作用。

大鼠骨髓间充质干细胞的纯化、冻存及成瘤性分析

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量极低,体外的长期培养过程中易丧失干细胞潜能以及体内移植后安全性等问题的存在,限制了骨髓间充质干细胞在临床上的广泛应用。目的:探索体外分离纯化、冻存大鼠骨髓间充质干细胞的最适方法,并观察以此方法培养的骨髓间充质干细胞移植体内后是否具有成瘤性。方法:分别采用差速贴壁结合24h首次换液、24h首次换液、48h首次换液的方法纯化培养骨髓间充质干细胞,筛选最适纯化方法进行后续实验。配制含体积分数为10%,20%,30%,40%,50%胎牛血清的细胞冻存液冻存细胞,复苏后计算细胞存活率,测定复苏后细胞的生长曲线及成脂诱导能力。将第3,15代骨髓间充质干细胞进行裸鼠肌肉、肝脏局部注射体内移植,45d后取注射部位行病理组织标本检查。结果与结论:差速贴壁结合24h首次换液法所获得骨髓间充质干细胞纯度最高,而细胞增殖能力与其他两组无明显差别,因此选用该方法纯化骨髓间充质干细胞,然后进行传代培养;含体积分数为30%血清冻存液既可保证细胞活性与增殖能力,又可保证干细胞特性及多向分化潜能。骨髓间充质干细胞传至15代仍保持间充质干细胞特性,骨髓间充质干细胞移植入裸鼠肝脏45d后仍可在肝脏局部存活,生长状态与体外培养相似,无异型性及向周围浸润生长,提示体外长时间培养15代以内的骨髓间充质干细胞可在裸鼠体内存活且无成瘤性。

槐耳清膏抑制MCF-7细胞裸鼠成瘤性实验研究

目的:构建裸鼠异种乳腺癌移植瘤模型(裸鼠接种MCF-7细胞),给予该模型鼠槐耳清膏处理,观察移植瘤组织病理变化特点,探讨其对裸鼠致瘤性的影响。方法:将裸鼠随机分为实验组和对照组,分别给予槐耳清膏(浓度150 mg·ml^(-1))和0.9%生理盐水各0.2 ml灌胃,每天两次,共30 d。观察裸鼠瘤体积及瘤体重的变化,显微镜观察移植瘤组织病理变化特点。结果:裸鼠在接种MCF-7细胞3周后,接种部位均长出肿瘤,成瘤率100%,实验组和对照组移植瘤重分别为(0.20±0.07)g和(0.57±0.32)g,实验组裸鼠移植瘤体重明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),两组移植瘤体积分别为(0.32±0.74)cm^3与(0.84±0.62)cm^3,实验组移植瘤体积较对照组小,具有统计学差异(P<0.01)。HE染色后,实验组裸鼠移植瘤镜下可见肿瘤组织细胞出现不同程度的退行性变,中央及边缘细胞出现大片缺血坏死区,在血供较丰富的区域表现尤为明显,而在坏死灶周围可见残存的肿瘤细胞。对照组细胞生长旺盛,有异型性,形态不规则,大小不等,细胞核大、浓染,可见病理性核分裂相,无明显坏死区。结论:在裸鼠体内,槐耳清膏能抑制乳腺癌细胞MCF-7的成瘤性,从而达到抑制乳腺癌细胞生长的作用。

大鼠骨髓来源肝干细胞的成瘤性

背景:通过动员自身或移植外来的骨髓来源肝干细胞可促进肝再生,但是,在大规模临床应用前,其安全性需要进一步研究。目的:采用含体积分数5%淤胆血清的培养基诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝干细胞方向分化,将这些骨髓来源肝干细胞接种到裸鼠体内,观察其是否具有成瘤性。方法:用含体积分数5%淤胆血清的培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞;以免疫荧光法检测白蛋白、甲胎蛋白及细胞角皮素18在诱导后细胞的表达;以糖原染色及尿素合成检测细胞功能。将培养14d的大鼠骨髓来源肝干细胞接种于裸鼠皮下,观察局部有无新生物形成。结果与结论:用含体积分数5%淤胆血清的培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞,4d后出现细胞集落,细胞为圆形;7d后集落变大,其周围开始出现多角形细胞;培养14d后可见细胞呈多角形和排列成铺路石样,免疫荧光染色发现这些细胞表达角皮素18、甲胎蛋白和白蛋白,糖原染色显示细胞内有糖原颗粒;培养第12～15天的培养液中尿素氮浓度逐渐升高。经诱导的大鼠骨髓来源的肝干细胞接种到裸鼠皮下,30d后局部未见新生物形成,组织结构未见异常。结果提示用体积分数5%淤胆血清培养基诱导的大鼠骨髓源性肝干细胞可能无成瘤性。

基于“单细胞移植-成瘤性验证”模式鉴定肝癌干细胞

背景:目前尚无较有效的肝癌干细胞的鉴定方法。目的:探索更为简单有效并适用于鉴定肝癌肿瘤细胞株中干细胞的方法。方法:首先利用单细胞分离技术获得单个细胞,逐个种入96孔板中,经筛选获得单细胞克隆(即成瘤性克隆)来源的细胞亚株,细胞亚株移植到裸鼠前肢腋下观察其成瘤作用。结果与结论:利用单细胞分离技术获得单细胞/孔的孔数为371个,成功率为96.4%;按照单细胞克隆的生长情况,筛选获得的来源于成瘤性克隆的细胞亚株移植到裸鼠前肢腋下,成瘤率为100%。结果证实"单细胞移植-成瘤性验证"具有鉴定肝癌干细胞的有效性,为后续的研究奠定技术和方法基础。

葡萄胎病理相关新基因F10与绒癌细胞系JEG-3成瘤性的关系

目的：探讨葡萄胎病理相关新基因F10与绒癌细胞系JEG-3裸鼠皮下成瘤的关系。方法通过细胞转染技术及RNA干扰技术，分别建立和筛选出F10基因稳定过表达及沉默的绒癌细胞系JEG-3。取SPF级裸鼠（4~5周龄）30只，随机均分为JEG-3 F10过表达组、JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组（n=10），分别接种F10基因过表达的JEG-3细胞、F10基因沉默的JEG-3细胞和未处理的JEG-3细胞株5×107个于颈背部皮下。接种后每3~4 d称量裸鼠质量观察，记录肿瘤发生时间，观察皮下肿瘤的生长情况。绘制在体肿瘤生长曲线，计算各组裸鼠的成瘤率。结果3组的成瘤率均为100%（10/10）。JEG-3 F10过表达组、JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组的成瘤时间分别为6.2±0.78、7±2.49、6.3±0.67 d，组间比较无统计学差异（F=0.781，P=0.468）。JEG-3 F10过表达组肿瘤的在体生长速度较JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组增快，差异有统计学意义（P〈0.05），JEG-3 F10未处理组肿瘤的在体生长速度较JEG-3 F10沉默组快（P〈0.05）。细胞接种5周后处死小鼠，取瘤组织称重，JEG-3 F10过表达组、JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组肿瘤重量分别为571.1±221.10 mg、136.2±66.25 mg、354.5±116.23 mg，组间比较存在统计学差异（F=21.199，P=0.000）。结论 F10基因与绒癌细胞系JEG-3的增殖调节有关，可增强JEG-3细胞系在裸鼠体内的致瘤性。

自体骨髓单个核细胞移植对急性肝损伤小鼠组织成瘤性的实验研究

目的观察急性肝损伤小鼠接受自体骨髓单个核细胞(BMMNC)移植后能否导致肿瘤的发生,从而对自体骨髓干细胞(BMSC)移植的安全性进行初步探讨。方法采用CCl4/2-AAF制备小鼠急性肝损伤模型,随机分为6组,A组:BMMNC移植对照组;B组:腹部皮下注射BMMNC0.3ml;C组:经尾静脉注射BMMNC0.3ml;D组:经尾静脉注射BMMNC0.9ml;E组:模型检测组;F组:供体组。BMMNC采用PKH26标记。病理观察小鼠接受BMMNC移植后皮下及肝脏内有无肿瘤形成。结果 C组及D组肝脏内未见肿瘤形成;B组皮下形成一肿物,病理证实为脂肪及淋巴细胞的炎性坏死所形成的包裹。结论理论上自体BMSC移植虽有形成肿瘤的可能性,但在本实验中未见肿瘤形成,自体BMSC移植能否诱发肿瘤还有待进一步探讨。

大肠癌细胞HCT-15肿瘤干细胞样细胞分离及成瘤性比较

目的:依据人大肠癌细胞HCT-15的表面标志物,分离其中的干细胞亚群。建立裸鼠体内原代大肠癌荷瘤模型,比较各亚群肿瘤体积和质量。方法:利用免疫磁珠分选技术,分离其中CD133/CD44干细胞亚群。分选得到CD133+CD44+、CD133+CD44-亚群分别接种于裸鼠体内,并观察肿瘤大小和质量。结果:CD133+CD44+和CD133+CD44-细胞亚群成功的从HCT-15细胞中分离出来。接种CD133+CD44+细胞的裸鼠形成的肿瘤体积[(2.76±0.22)cm3]和质量[(5.2±0.21)g]明显高于接种CD133+CD44-细胞裸鼠的肿瘤体积与质量[(1.56±0.34)cm3,(3.4±0.18)g](P<0.05)。结论:CD44阳性的大肠癌肿瘤干细胞成瘤能力明显高于CD44阴性的大肠癌肿瘤干细胞。

组织型纤溶酶原激活剂工程细胞系遗传特性及成瘤性分析

构建了突变体t-PA,使其在CHO-dhfr细胞中表达。获得t-PA工程细胞系。对该细胞系进行了遗传特性分析,在培养基中加入秋水仙素,通过低张、固定处理并将细胞滴片、染色,进行染色体分析,结果表明,该工程细胞系染色体条数为20条,畸变类型有异着丝粒、四倍体、裂隙、断片、微小体,畸变率为15％,属于正常范围。同时进行成瘤性检测,选用4周龄裸鼠作为试验鼠,以人宫颈癌细胞(Hela细胞)为阳性对照,CHO-dhfr细胞为阴性对照,试验表明,t-PA工程细胞及表达产物对裸鼠均无成瘤性。

应用活体内生物发光技术对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981成瘤性和转移性研究

背景与目的应用阳离子脂质体介导的基因转染方法对nm23-H1缺失的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981进行荧光素酶基因(Luc)标记,建立稳定高效表达荧光素酶(Luciferase)基因的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981-Luc。应用活体生物荧光成像技术,非侵入性地连续检测小鼠(裸鼠和SCID鼠)皮下肿瘤模型发展演进、自发转移的过程。方法将带有荧光素酶基因(Luc)的质粒PGL4.17经阳离子脂质体介导转入人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中,筛选出高效稳定表达荧光素酶的细胞株。将转染后的细胞接种于裸鼠和SCID鼠右后腿腹股沟皮下,建立皮下肿瘤模型,利用活体内可见光成像系统观察其在小鼠体内的生长和转移过程。结果转基因人高转移大细胞肺癌细胞株L9981-Luc可在体内、外持续稳定表达荧光素酶,细胞数和发光值成直线相关。成功地建立了表达荧光素酶活性的动物肿瘤皮下自发转移模型。L9981-Luc保留了原有的高转移特性。瘤重和发光强度呈直线相关。结论利用活体内生物发光技术可以非侵袭性地连续示踪肿瘤细胞在活体内的生长和转移过程,为研究肺癌侵袭转移过程及其机理和最佳治疗策略的选择提供了新的手段和工具。

IFN-γ和IL-4对人乳腺癌细胞系MCF-7成瘤性、黏附能力的影响及其机制

目的:探讨Th1类细胞因子IFN-γ和Th2类细胞因子IL-4对MCF-7细胞的成瘤、黏附能力的调节作用及其相关机制。方法:常规体外培养人乳腺癌细胞系MCF-7。以前期工作中筛选出的以有效剂量rh IFN-γ(100 ng/ml)或rh IL-4(10ng/ml)或细胞因子稀释液分别处理细胞96 h后,应用半定量RT-PCR法、Western blotting技术、双层软琼脂集落形成实验、细胞体外黏附实验等观察IFN-γ和IL-4对细胞VEGF表达、致瘤性和黏附侵袭特性的影响,并对其相关信号通路机制进行分析。结果:IFN-γ或IL-4可分别抑制或促进人乳腺癌细胞MCF-7的成瘤和黏附能力。分子机制研究表明,与对照组相比,rh IFN-γ可抑制MCF-7细胞VEGF、MMP-9的基因转录和蛋白表达水平,抑制Raf/MEK/ERK信号通路;rh IL-4可促进MCF-7细胞的VEGF、MMP-2和MMP-9的基因转录和蛋白表达水平,促进PI3K/AKT、Raf/MEK/ERK信号通路激活。结论:肿瘤微环境中,IFN-γ和IL-4可分别抑制和促进人乳腺癌细胞系MCF-7的VEGF表达和体外成瘤、黏附能力,其机制可能与PI3K/AKT、Raf/MEK/ERK信号通路相关。

p53缺失协同K-ras^(G12D)激活对细胞成瘤性的影响

为研究p53缺失和K-ras突变在肺癌发生中的作用,建立了p53条件性敲除,K-rasG12D条件性激活(p53loxp/loxp、Lox-Stop-Lox-K-rasG12D)的基因嵌合小鼠,获得条件性基因嵌合小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)。体外研究发现,内源性p53缺失协同K-rasG12D的突变激活可促进MEFs的分裂、增殖和转化;体内研究证实,该协同突变激活可快速诱发肺部肿瘤的产生,组织病理学分析表明该肺癌类型为腺癌。上述研究工作为进一步认识p53和K-ras在肺癌发生发展中的作用打下了基础。

结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞成瘤性的抑制作用

目的探索结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对动物体内的肺癌A-549细胞的成瘤性的影响,以及因此产生的对动物免疫功能的作用。方法构建BALB/C小鼠的免疫抑制模型,通过接种稳定表达结核分枝杆菌RelE毒素蛋白、RelB抗毒素蛋白和RelBE毒素-抗毒素蛋白的肺癌A-549细胞株,含空质粒PcDNA3.1(+)的A-549细胞株,以及正常的肺癌A-549细胞,构建BALB/C小鼠荷瘤模型,观察各组小鼠的肿瘤生长情况,并测定各组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性以及血清IFN-γ和IL-2的浓度。结果接种了表达RelE毒素蛋白的A-549细胞的小鼠组,肿瘤生长较其它实验组慢,肿瘤结节的瘤体体积和数量都较其它实验组有明显差异(P<0.05)。对各组小鼠免疫功能变化的研究发现,各实验组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性以及血清IFN-γ和IL-2的浓度的差异没有统计学意义(P>0.05)。结论结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞的成瘤性有抑制作用。

成瘤性相关蛋白的研究进展

肿瘤的发生发展包括肿瘤细胞的体内成瘤性、异种移植肿瘤的生长、血管生成、肿瘤迁移侵袭及转移等过程,而成瘤性相关蛋白在此过程中发挥着重要的调控作用。研究成瘤性相关蛋白对发现肿瘤治疗的新靶点、阻断肿瘤发生发展等具有重要意义。本文综述了成瘤性相关蛋白对细胞成瘤性的影响、蛋白相互作用对肿瘤迁移侵袭的影响、成瘤性相关蛋白在体外细胞迁移侵袭中的作用及其与肿瘤转移之间的关系,以期为揭示成瘤性相关蛋白在肿瘤发展中的调控机制提供参考。

悬浮培养型BHK-21细胞生长特性及成瘤性研究

目的:了解低血清驯化的悬浮培养型BHK-21细胞的生长特性及致裸鼠成瘤能力.方法:比较研究悬浮型和贴壁型BHK-21细胞的细胞形态、生长动力学和成瘤性.结果:驯化的悬浮培养型和贴壁培养型BHK-21细胞生长状态均良好,最大增殖浓度分别为517×10^4/mL和39.67×10^4/mL,群体倍增时间分别为23.03 h和21.36 h,能显著提高细胞培养密度(P<0.05).背部皮下接种致裸鼠成瘤性实验表明,驯化的悬浮培养型组裸鼠的体重增长率均低于贴壁培养型BHK-21细胞、阳性细胞组(Hela)和阴性细胞组(KMB17)(P>0.05),裸鼠成瘤体积增长率均高于其他三组(P<0.05).结论:驯化的悬浮培养型BHK-21细胞能显著提高细胞密度,其成瘤性方面还需进一步改善.

不同成瘤性MDCK细胞中SQSTM1的差异表达验证

SQSTM1/p62为一种泛素结合蛋白核自噬受体(sequestosome 1,SQSTM1),有调节NRF2、mTOR和NF-κB的作用,这些因子则在肿瘤信号通路中较为重要,SQSTM1的异常积聚提示自噬缺陷,已知乳腺癌、肺癌等疾病也发现了这种异常聚集小体的存在。本研究为探讨SQSTM1不同成瘤性MDCK细胞中的差异表达。培养不同成瘤性的MDCK细胞,通过RT-qPCR来检测SQSTM1在不同成瘤性MDCK细胞中的表达。结果表明:SQSTM1在不同成瘤性MDCK细胞中存在差异,在高成瘤性细胞株MEDK-A和MDCK-B中表达高,在低成瘤性细胞株MDCK-C中表达量低,说明该蛋白对MDCK细胞的成瘤性起到一定的调控作用,为进一步研究SQSTM1在不同成瘤性MDCK细胞中的作用机制奠定理论基础。

不同成瘤性MDCK细胞中FOXN2差异表达验证

叉头框蛋白(Forkhead box,FOX)N2(FOXN2)是FOX蛋白家族中的一员,据报道其与肿瘤的发生发展相关,在乳腺癌、肺癌等疾病中起关键作用.为利用基因工程构建低成瘤性Madin-Darby canine kidney(MDCK)细胞系,本研究探讨FOXN2不同成瘤性MDCK细胞中的差异表达,培养不同成瘤性的MDCK细胞.通过RT-qPCR来检测FOXN2在不同成瘤性MDCK细胞中的表达.结果表明FOXN2在不同成瘤性MDCK细胞中存在差异,在高成瘤性细胞株MEDK-A和MDCK-B中表达高,在低成瘤性细胞株MDCK-C中表达量低,说明该蛋白对MDCK细胞的成瘤性能起到一定的调控作用,可为进一步研究FOXN2在不同成瘤性MDCK细胞中的作用机制奠定理论基础.

黑色素细胞瘤细胞成瘤性的缺失情况及其机制

目的探讨黑色素细胞瘤细胞系成瘤能力的缺失情况及其机制。方法选取对数生长期人黑色素细胞瘤细胞系和人A375黑色素瘤细胞系,分别皮下注射至5只裸鼠右侧腋下,4个月后观察是否成瘤。取原代及传代培养的黑色素细胞瘤细胞系和黑色素瘤细胞系进行镜下观察,了解其体外成瘤情况。检测两种细胞系血管内皮生长因子(VEGF)、CD31和CD133 m RNA的表达情况。结果裸鼠皮下异种移植4个月后,黑色素细胞瘤细胞系未能成瘤,而黑色素瘤细胞系成瘤率100%。镜下发现黑色素瘤细胞可见细胞典型克隆,而黑色素细胞瘤细胞仅部分出现克隆样生长方式。黑色素细胞瘤细胞的VEGF和CD31 m RNA的表达水平低于黑色素瘤细胞系(P<0.05)。结论黑色素细胞瘤细胞致瘤性缺失,其血管生成基因表达减弱而导致血管生成能力的低下可能是成瘤性缺失的机制之一。

细胞治疗产品非临床致瘤性和成瘤性评价概况

细胞治疗产品(cell therapy products,CTPs)是指用于治疗人类疾病,来源、操作和临床试验过程符合伦理要求,按照药品管理相关法规进行研发和注册申报的人体来源的活细胞产品[1];是从实验室培养的干细胞、组织和器官中提取的,被注射到患者体内的生物技术产品[2]。CTPs主要包括干细胞和体细胞两类,其中干细胞分为胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)等,是目前正在研究的用于制备细胞治疗产品的主要细胞类型[3]。