基于成簇的规则间隔短回文重复序列的严重急性呼吸综合征冠状病毒2检测的最新进展

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)导致的新冠肺炎(COVID-19)迅速蔓延全球,给全球公共卫生系统带来了挑战。由于逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和抗原测试的普遍适用性和灵敏度较差,并且具有不同突变的SARS-CoV-2变体持续的出现,给疫情防控带来了更大的挑战,因此,高灵敏度、无需设备并且能够区分SARS-CoV-2变体的诊断方法亟须发展。基于成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)的诊断对设备要求低,具有可编程性、灵敏性和易用性,已经发展出多种核酸检测工具用于传染病的诊断,其在临床上具有巨大的应用潜力。文章聚焦于近期发表的基于CRISPR实现SARS-CoV-2检测和变体区分的最新技术,总结其特点并对其发展进行了展望。

规律成簇的间隔短回文重复：结构，功能与应用

规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs)是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。最近研究表明,CRISPR与一系列相关蛋白、前导序列一起,为原核生物提供对噬菌体等外源基因的获得性免疫能力,其作用机制可能与真核生物的RNA干扰过程类似。作为基因组中高度可变的区域,CRISPR非常适合成为研究细菌种内分型和微进化的分子靶标。本文综述了CRISPR系统的结构、功能及其应用概况,并对CRISPR研究的前景进行了展望。

志贺菌成簇的规律间隔短回文重复序列的检测及同源性分析

目的:检测志贺菌成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR),并与GenBank全基因组中志贺菌重复序列和间隔序列对比,分析其结构特征及同源性。方法:利用PCR法扩增获得志贺菌CRISPR,采用生物信息学方法对重复序列及间隔序列进行同源性分析;运用多序列比对分析间隔序列特点及其与侧翼序列间的联系;BLAST分析间隔序列与质粒和噬菌体的同源性;weblogo分析重复序列碱基频率及RNAfold预测其RNA二级结构;重复序列的同源聚类分析并用BLAST分析重复序列与其他细菌的同源性。结果:被测3株临床志贺菌及9株全基因组志贺菌中均含有不同数量CRISPR;同一个CRISPR中,间隔序列有的相似、有的完全不同,某些CRISPR间隔序列的部分序列与CRISPR侧翼序列存在同源性,某些间隔序列可能是信息基因和操纵基因的拼接重组;重复序列保守性不一致,可能与细菌进化存在一定的联系,重复序列碱基的差异影响茎的长度,从而影响二级结构的稳定性及CRISPR的功能。重复序列与个别远缘菌种具有较高的同源性。结论:志贺菌存在多样的CRISPR结构,不同CRISPR的重复序列保守性不同。某些间隔序列部分与CRISPR侧翼序列同源,某些间隔序列是多基因拼接而成。

志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列与毒力基因和耐药基因的关系

目的探索志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与毒力基因和耐药基因的关系。方法从GenBank数据库中获得志贺菌的基因组、毒力基因和耐药基因的序列,通过多序列比对等方法获得志贺菌中CRISPR1、CRISPR2和CRISPR-Q1的分布情况、重复序列和间隔序列信息,通过BLAST方法获得毒力基因和耐药基因在志贺菌中的分布情况,SPSS 21.0软件分析CRISPR与毒力基因和耐药基因的关系。结果志贺菌中的CRISPR1和CRISPR2在不同菌株中的间隔序列差别较大,CRISPRQ1分布更为广泛(超过99%)。毒力基因在志贺菌中分布比较广泛(均超过56%),耐药基因中的blaOXA-1、camr、Sul2、tetB分布也比较广(超过50%)。CRISPR1/CRISPR2与是否携带9种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05),CRISPR-Q1与是否携带3种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2和CRISPR-Q1均与志贺菌中存在的毒力基因和耐药基因的个数间有统计学关联(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目之间存在统计学关联(χ2=61.6,P<0.001)。结论志贺菌中不同CRISPR的分布差异比较大,存在的间隔序列数目不等;志贺菌CRISPR与部分毒力基因和耐药基因之间存在负相关;CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目存在正相关。

空肠弯曲菌中规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)的检测与结构分析

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是近年在原核生物中发现的针对噬菌体等外源遗传物质的干扰而进化出的获得性和可遗传性生物免疫系统。因其序列的高度多态性及携带遗传信息的可追溯性,成为分子分型方法的理想位点。本研究对江苏地区分离的86株空肠弯曲菌基因组进行CRISPR结构的检测和分析。结果表明:36%的菌株基因组含有CRISPR结构,32株含有确定CRISPR结构的菌株均只含有1个CRISPR结构,CRISPR序列长度范围为92～366 bp;重复序列与数据库中出现频率最高的重复序列一致;识别到的间隔序列共111条,共分为17种类型,有10种类型的间隔序列与CRISPR DB数据库中公布的一致,有7种间隔序列为新报道的间隔序列,共55条,占总间隔序列的49.5%。通过同源性比对发现,间隔序列除与来自同属同种的质粒或噬菌体具有同源性外,有些还与其他致病菌的质粒或噬菌体具有同源性,这种现象说明空肠弯曲菌与其他致病菌可能存在基因的水平转移等信息交流方式。另外,通过CRISPR结构间隔序列的多样性,可以将38株空肠弯曲菌野生菌株分为5种不同的谱型。研究结果为空肠弯曲菌利用CRISPR结构进行分型和溯源提供数据基础。

志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列的特点及其关联性分析

目的:利用数据库和临床分离的志贺菌菌株分析志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)的特点,探讨CRISPR-Q1的特性及CRISPR间的关联性。方法:根据志贺菌基因组数据库利用引物序列和PCR扩增获得志贺菌的CRISPR序列信息,采用多序列比对等方法获得每个菌株中CRISPR的分布、间隔序列数及序列特点;利用BLAST分析CRISPR-Q1中重复序列和间隔序列,检测重复序列和间隔序列在菌株中的分布特点以及CRISPR-Q1在菌株中的位置及特征;分析数据库和实验室中志贺菌CRISPR-Q1中间隔序列数与CRISPR1或CRISPR2的关系。结果:在数据库107株志贺菌中,106株志贺菌含有CRISPR1或CRISPR2,8株志贺菌的CRISPR1或CRISPR2含有多个间隔序列;106株志贺菌含有CRISPR-Q1,其中有13株志贺菌的CRISPR-Q1中有多个间隔序列。在实验室12株志贺菌中,有6株含有CRISPR1或CRISPR2,12株均含有CRISPR-Q1;CRISPR-Q1间隔序列中的一部分(约35bp)在同一个菌株的染色体基因组上分布广泛,重复序列同样如此,CRISPR-Q1中还存在基因外重复序列(REP)元素。数据库志贺菌中的CRISPR-Q1间隔序列数与CRISPR1和CRISPR2有关联(χ~2=61.6,P<0.01),实验室志贺菌中的CRISPR-Q1间隔序列数与CRISPR1和CRISPR2有关联(P=0.015)。结论:CRISPR-Q1在志贺菌中广泛分布,其序列中存在REP元素;志贺菌的CRISPR1和CRISPR2与CRISPR-Q1有关联。

规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9靶向Rho GDIα基因敲除质粒的构建及其对小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6迁移的影响

目的利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建Rho鸟苷酸解离抑制因子α(GDIα)的基因敲除载体,并探讨干扰Rho GDIα后对小鼠肝癌细胞Hepa 1-6迁移的影响。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计Rho GDIα的向导RNA(sgRNA)序列,并与PX458载体相连,构建Rho GDIα基因敲除重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1和PX458-Rho GDIα-sgRNA2;脂质体转染法将重组质粒转染入Hepa 1-6细胞抑制Rho GDIα的基因表达;RT-PCR法检测Rho GDIα被抑制后的mRNA表达情况;划痕法检测Rho GDIα干扰后Hepa 1-6细胞迁移距离的差异;迁移小室法检测抑制Rho GDIα后Hepa 1-6细胞迁移数量的差异。结果成功构建了Rho GDIα的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-Rho GDIα-sgRNAs;转染有PX458-Rho GDIα-sgRNA1的Hepa 1-6细胞与对照组只转染空载体PX458的细胞相比,Rho GDIα的表达被明显抑制(P<0.05),而且该组细胞从划痕起始处迁移到空白处距离较远,从迁移小室上端迁移到底端数目明显增多,差异极其显著(P<0.01),说明Rho GDIα被抑制后肝癌细胞的迁移能力提高。结论CRISPR/Cas9法构建的重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1可以有效抑制Rho GDIα的基因表达;Rho GDIα被抑制后明显促进小鼠肝癌细胞Hepa 1-6的迁移,提示在体情况下,Rho GDIα的表达可能起到抑制细胞迁移的重要作用,在肿瘤组织中,可以利用过表达Rho GDIα来抑制肿瘤细胞的转移。

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术已成为生物医学领域中研究基因功能及其表达调控的重要手段之一。随着CRISPR技术的拓展,各种基于CRISPR技术的新型研究、诊断和治疗等工具得到进一步的开发,并在新型动物疾病模型的建立、疾病快速诊断、肿瘤及免疫相关性疾病的治疗等方面取得了重大进展和突破。我们重点对CRISPR/CRISPR相关蛋白(Cas)技术的发展现状及其在生物医学领域的应用进展进行综述,并对其未来应用前景和发展方向进行讨论和展望。

利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9系统敲减α2δ1对人肝癌细胞系Hep-12干性的影响

目的通过规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统敲减人肝癌细胞系Hep12中电压依赖性钙离子通道α2δ1的表达,观察α2δ1敲减后对肝癌细胞干性的影响。方法设计3对靶向α2δ1的向导(sgRNA),长度为20 bp,构建到lenti CRISPRv2-puro载体上,然后在体外检测sgRNA切割活性,利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒,将包装好的病毒感染Hep-12细胞,2 d后加入嘌呤霉素筛选。利用Western blotting验证α2δ1的敲减效果和干性相关基因的表达。通过成球实验检测其体外自我更新能力的变化。结果测序结果显示,sgRNA成功插入载体质粒;体外切割实验显示,3条sgRNA均有切割活性;Western blotting结果显示,α2δ1基因的表达显著降低,干性相关基因B细胞特异性莫洛尼白血病病毒插入位点1(BMI1)和Nanog的表达显著被抑制;无血清培养基成球实验结果表明,敲减α2δ1导致Hep-12细胞的体外自我更新能力减弱。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建敲除α2δ1基因的Hep-12细胞系;敲除α2δ1基因后能抑制Hep-12细胞肿瘤干细胞样特性。

食源性致病菌耐药性与成簇的规律间隔短回文重复序列系统关联性研究进展

近年来,随着对抗生素的滥用,食源性致病菌的耐药性问题日趋严重。目前除了从管理上规范抗生素的使用,对规律间隔短回文重复序列系统(clusterd regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与耐药性相关研究也在持续进行。CRISPR-Cas作为一种天然免疫机制,因为其独特的免疫作用机理,目前常被用以基因编辑、耐药性等方面研究。本文对CRISPR-Cas系统进行简要介绍,从其结构、原理以及目前的研究趋势对不同菌株间CRISPR系统与耐药性、毒力因素进行相关总结,为防治食源性致病菌引起的食品安全问题提供新思路。

成簇的规律间隔的短回文重复序列/成簇的规律间隔的短回文重复序列关联系统在核酸检测中的应用进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR关联基因(Cas)系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古生菌中的一种后天免疫系统,以消灭外来的质体或者噬菌体,其中CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13系统在核酸检测领域得到应用。该研究简要介绍了CRISPR/Cas系统的分类、作用机制及在核酸检测中的应用。

规律成簇的短回文重复序列/Cas9的研究进展

规律成簇的短回文重复序列(clustered regularly intespaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas系统是最近兴起的一项基因编辑技术,在基因编辑中有着不可或缺的作用。CRISPR是继锌指人工核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)和类转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effectors nuclease,TALEN)之后的第三代人工合成的核酸酶,有着ZFN、TALEN不具备的众多优点,所以CRISPR正在慢慢取代ZFN和TALEN,成为最主要的人工核酸酶并广泛应用在基因编辑中。而CRISPR/Cas9是CRISPR/Cas系统中最为简单的,也是现在基因编辑技术中应用最为广泛的一种。下面从CRISPR/Cas9的工作原理、构建和研究进展等几个方面对其做一个简要综述,为在这一个领域的研究工作者提供一个参考。

基于环介导等温扩增技术及规则成簇间隔短回文重复序列的日本血吸虫核酸检测方法的建立及评价

目的 建立一种灵敏、特异的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)-规则成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的日本血吸虫核酸检测方法。方法 以日本血吸虫SjR2基因片段作为靶序列,设计LAMP引物、gRNA和ssDNA探针,建立并优化LAMPCRISPR反应体系。用LAMP-CRISPR方法检测含有SjR2靶序列的10倍梯度稀释的重组质粒,不同发育阶段日本血吸虫基因组DNA,以及肝片形吸虫、曼氏血吸虫、肥胖带绦虫、华支睾吸虫、似蚓蛔线虫、美洲钩口线虫、卫氏并殖吸虫、细粒棘球绦虫等蠕虫基因组DNA,评价其灵敏度和特异度。用LAMP-CRISPR方法分别检测15份血吸虫感染的阳性钉螺样本以及30份未感染的阴性钉螺样本,并与LAMP检测结果比较,以评价LAMP-CRISPR方法用于筛查感染性钉螺的应用效果。结果 建立的基于LAMP-CRISPR的核酸检测方法可特异性扩增并检测出日本血吸虫目的基因片段。其最适反应温度为37℃,反应体系中gRNA的最佳反应浓度为40 nmol/L,Cas12a蛋白的最佳反应浓度为40 nmol/L。该方法与肝片形吸虫等蠕虫基因组DNA均无交叉反应;以10倍梯度稀释的重组质粒为模板,该方法检测限为10拷贝/μL;此外,该方法能够准确检测出日本血吸虫虫卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴、童虫及成虫基因组DNA。45份钉螺样本检测结果显示,LAMP-CRISPR与LAMP检测感染性钉螺的结果差异无统计学意义(χ^(2)=0.05,P>0.05);与金标准比较,LAMP-CRISPR方法的灵敏度为100.00%(15/15),特异度为96.67%(29/30),LAMP方法的灵敏度为100.00%(15/15),特异度为93.33%(28/30)。结论 本研究建立了一种灵敏性和特异性均较高的基于LAMP-CRISPR的日本血吸虫核酸检测方法,具有用于日本血吸虫感染快速检测及风险监测的潜力。

基于成簇的规律性间隔的短回文重复序列关联的失活核酸酶9-脱氧核糖核酸甲基转移酶3A基因复合体的O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因启动子区甲基化修饰对胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性影响

目的探讨成簇的规律性间隔的短回文重复序列关联的失活核酸酶9-脱氧核糖核酸甲基转移酶3A基因复合体(CRISPR-dcas9-DNMT3A)介导的O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因(MGMT)基因启动子区域DNA甲基化修饰对胶质瘤细胞替莫唑胺(TMZ)耐药性的影响。方法 CRISPR-dcas9-DNMT3A表达载体通过慢病毒包装感染TMZ耐药细胞系U251-R[U251(中国医学科院基础医学研究所)通过替莫唑胺高浓度反复间歇诱导法诱导产生], 验证其对MGMT启动子区域DNA甲基化程度, MGMT表达水平以及TMZ药物敏感性影响。结果慢病毒感染成功的U251-R细胞, MGMT启动子区域甲基化水平增高[44.7%(17/38)、63.2%(24/38)、77.1%(27/38)比7.9%(3/38), P<0.05], MGMT蛋白表达减少, 细胞对TMZ化疗的敏感性增加(P<0.05)。结论 CRISPR-dcas9-DNMT3A慢病毒感染的U251-R细胞可通过增加其MGMT基因启动子区域甲基化水平减少MGMT蛋白表达从而增加化疗敏感性。

一种新的沙门氏菌成簇重复序列的预测方法

目的建立一个新的、直观的鉴定和显示细菌基因组成簇重复序列的方法,了解沙门氏菌基因组成簇重复序列的组成特征。方法直接将细菌的基因组用滑动窗口法切割成重叠片段,每一个片段自体比对,利用Pip Maker生成共线性图。通过共线性图特征识别成簇重复序列区。结果用所设计方案-成簇重复序列预测器(CRpred)对鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株基因组进行扫描,总共鉴定出151个成簇重复区。特征分析表明,这些成簇重复区包含低拷贝简单串联重复、高拷贝简单串联重复、间隔串联重复、反向回文重复和反向间隔重复等5种类型。此外,沙门氏菌基因组中有9个复杂重复区域无法使用上述模式进行归类。结论提出了一个新的、简便直观的基因组成簇重复序列的鉴定方法,为搜寻成簇的、规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、数目可变串联重复序列(VNTR)以及其他重复序列相关研究提供支持。

志贺菌成簇的规律间隔的短回文重复序列系统结构特征的生物信息学分析

利用生物信息学方法探索志贺菌成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统结构的特征。本文通过BLAST、序列比对、RNA二级结构预测等方法对志贺菌CRISPR进行研究。结果显示:志贺菌的4个群中均发现有CRISPR结构,其侧翼上、下游序列可分为相同组群,在leader序列中存在具有回文性质、相对保守的motif;侧翼序列与重复序列具有相同的分组,重复序列有一定的保守性,可以形成以"茎"为主和以"环"为主两类不同的RNA二级结构;间隔序列与质粒或噬菌体有一定的同源性。本研究表明重复序列与侧翼序列间存在相关性,重复序列可能作为一种识别机制来介导外源元素与Cas蛋白间的相互作用。

云南省鼠疫耶尔森菌规律成簇间隔短回文重复序列分型

鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）基因组中包含3个规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）位点（YPa,YPb和YPc）.本研究对云南省不同生态型鼠疫菌株的CRISPR序列进行分析,了解不同鼠疫疫源地及鼠疫菌株间的相互联系.

成簇的规律间隔短回文重复序列在致病菌中分型研究及应用

为全面深入了解CRISPR在致病菌中的最新进展,该文简介了CRISPR的结构与功能,深入论述其在各类致病菌中的分型研究及应用情况,剖析CRISPR分型研究现有问题和措施,并展望今后CRISPR重点研究方向。CRISPR分型在各类致病菌中有着不同程度应用,在结核分枝杆菌复合群、沙门氏菌、产志贺毒素大肠杆菌等致病菌中已获成功。加强多种致病菌的全基因组测序及扩充CRISPR数据库,CRISPR分型将会应用更广泛。

规律成簇的间隔短回文重复序列中间隔序列的噬菌体来源研究

目的发现在现有的全基因组测序完成的原核生物中规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）系统中间隔序列分布规律以及间隔序列中噬菌体来源情况。方法整理现有CRISPR数据库中2762株细菌基因组中的CRISPR系统和其中的间隔序列数据,整理Gen Bank数据库中发表的1444个噬菌体基因组数据。利用BLASTN软件对间隔序列数据与噬菌体基因组进行相似性比较,计数资料比较使用χ2检验。结果在2762个细菌基因组中整理出1940个基因组存在确定或可能的CRISPR结构和90 096条间隔序列,多数基因组具有1～50条间隔序列（1414/1940,72.9%）,间隔序列数量〉250条的仅有58个基因组（58/1940,3.0%）。其中古细菌13株（13/150,8.6%）,真细菌45株（45/2612,1.7%）,差异有统计学意义（χ2=29.98,P〈0.01）。相似性比较结果共发现245个细菌基因组的1055条间隔序列,成功比对上363个噬菌体,比对成功率仅为0.12%。结论细菌基因组中的CRISPR系统中间隔序列数量存在较大差异,古细菌基因组中CRISPR系统存在更多的间隔序列。相似性比较中噬菌体来源的间隔序列所占比例低,提示与细菌和噬菌体基因组发现较少相关,进一步深入研究可以大幅度提高成功率。

成簇的规律间隔短回文重复序列技术在鼠疫菌基因分型中的应用

目的针对分离自内蒙古高原长爪沙鼠鼠疫自然疫源地的鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌),进行DNA成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)分型,对比同一类型疫源地,不同地区分离的菌株基因型,建立沙鼠鼠疫疫源地鼠疫菌株的CRISPR基因库,为疫情的追溯和流行病学分析奠定基础。方法应用3对CRISPR引物(YPa、YPb、YPc)将实验菌株DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增并测序,然后将所测得CRISPR序列与文献最新报道的CRISPR Dictionary比对,找出CRISPR spacer阵列,确定基因型别,最后用Bionumerics 7.6软件制作聚类图,分析其进化关系。结果33株鼠疫菌共发现9种spacer,包括4种YPa(a1、a2、a3、a56)、2种YPb(b1、b2)和3种YPc(c1、c2、c3),经比对所有菌株被归为1个CRISPR基因簇(Cb2),2个基因型,内蒙古自治区(内蒙古)鄂托克旗和杭锦后旗菌株为1个新基因型,命名为2′型(a1-a2-a3-a56,b1-b2,c1-c2-c3),内蒙古乌拉特前旗、河北省康保县和宁夏回族自治区银川市的菌株均为基因1型(a1-a2-a3,b1-b2,c1-c2-c3)。结论鼠疫菌在内蒙古长爪沙鼠鼠疫疫源地整体上遗传稳定,归于1个基因簇,但是也存在一些微进化,体现在不同地区的菌株有不同的基因型。