志贺菌成簇的规律间隔短回文重复序列的检测及同源性分析

目的:检测志贺菌成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR),并与GenBank全基因组中志贺菌重复序列和间隔序列对比,分析其结构特征及同源性。方法:利用PCR法扩增获得志贺菌CRISPR,采用生物信息学方法对重复序列及间隔序列进行同源性分析;运用多序列比对分析间隔序列特点及其与侧翼序列间的联系;BLAST分析间隔序列与质粒和噬菌体的同源性;weblogo分析重复序列碱基频率及RNAfold预测其RNA二级结构;重复序列的同源聚类分析并用BLAST分析重复序列与其他细菌的同源性。结果:被测3株临床志贺菌及9株全基因组志贺菌中均含有不同数量CRISPR;同一个CRISPR中,间隔序列有的相似、有的完全不同,某些CRISPR间隔序列的部分序列与CRISPR侧翼序列存在同源性,某些间隔序列可能是信息基因和操纵基因的拼接重组;重复序列保守性不一致,可能与细菌进化存在一定的联系,重复序列碱基的差异影响茎的长度,从而影响二级结构的稳定性及CRISPR的功能。重复序列与个别远缘菌种具有较高的同源性。结论:志贺菌存在多样的CRISPR结构,不同CRISPR的重复序列保守性不同。某些间隔序列部分与CRISPR侧翼序列同源,某些间隔序列是多基因拼接而成。

规律成簇的短回文重复序列/Cas9的研究进展

规律成簇的短回文重复序列(clustered regularly intespaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas系统是最近兴起的一项基因编辑技术,在基因编辑中有着不可或缺的作用。CRISPR是继锌指人工核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)和类转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effectors nuclease,TALEN)之后的第三代人工合成的核酸酶,有着ZFN、TALEN不具备的众多优点,所以CRISPR正在慢慢取代ZFN和TALEN,成为最主要的人工核酸酶并广泛应用在基因编辑中。而CRISPR/Cas9是CRISPR/Cas系统中最为简单的,也是现在基因编辑技术中应用最为广泛的一种。下面从CRISPR/Cas9的工作原理、构建和研究进展等几个方面对其做一个简要综述,为在这一个领域的研究工作者提供一个参考。

志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列与毒力基因和耐药基因的关系

目的探索志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与毒力基因和耐药基因的关系。方法从GenBank数据库中获得志贺菌的基因组、毒力基因和耐药基因的序列,通过多序列比对等方法获得志贺菌中CRISPR1、CRISPR2和CRISPR-Q1的分布情况、重复序列和间隔序列信息,通过BLAST方法获得毒力基因和耐药基因在志贺菌中的分布情况,SPSS 21.0软件分析CRISPR与毒力基因和耐药基因的关系。结果志贺菌中的CRISPR1和CRISPR2在不同菌株中的间隔序列差别较大,CRISPRQ1分布更为广泛(超过99%)。毒力基因在志贺菌中分布比较广泛(均超过56%),耐药基因中的blaOXA-1、camr、Sul2、tetB分布也比较广(超过50%)。CRISPR1/CRISPR2与是否携带9种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05),CRISPR-Q1与是否携带3种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2和CRISPR-Q1均与志贺菌中存在的毒力基因和耐药基因的个数间有统计学关联(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目之间存在统计学关联(χ2=61.6,P<0.001)。结论志贺菌中不同CRISPR的分布差异比较大,存在的间隔序列数目不等;志贺菌CRISPR与部分毒力基因和耐药基因之间存在负相关;CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目存在正相关。

空肠弯曲菌中规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)的检测与结构分析

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是近年在原核生物中发现的针对噬菌体等外源遗传物质的干扰而进化出的获得性和可遗传性生物免疫系统。因其序列的高度多态性及携带遗传信息的可追溯性,成为分子分型方法的理想位点。本研究对江苏地区分离的86株空肠弯曲菌基因组进行CRISPR结构的检测和分析。结果表明:36%的菌株基因组含有CRISPR结构,32株含有确定CRISPR结构的菌株均只含有1个CRISPR结构,CRISPR序列长度范围为92～366 bp;重复序列与数据库中出现频率最高的重复序列一致;识别到的间隔序列共111条,共分为17种类型,有10种类型的间隔序列与CRISPR DB数据库中公布的一致,有7种间隔序列为新报道的间隔序列,共55条,占总间隔序列的49.5%。通过同源性比对发现,间隔序列除与来自同属同种的质粒或噬菌体具有同源性外,有些还与其他致病菌的质粒或噬菌体具有同源性,这种现象说明空肠弯曲菌与其他致病菌可能存在基因的水平转移等信息交流方式。另外,通过CRISPR结构间隔序列的多样性,可以将38株空肠弯曲菌野生菌株分为5种不同的谱型。研究结果为空肠弯曲菌利用CRISPR结构进行分型和溯源提供数据基础。

志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列的特点及其关联性分析

目的:利用数据库和临床分离的志贺菌菌株分析志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)的特点,探讨CRISPR-Q1的特性及CRISPR间的关联性。方法:根据志贺菌基因组数据库利用引物序列和PCR扩增获得志贺菌的CRISPR序列信息,采用多序列比对等方法获得每个菌株中CRISPR的分布、间隔序列数及序列特点;利用BLAST分析CRISPR-Q1中重复序列和间隔序列,检测重复序列和间隔序列在菌株中的分布特点以及CRISPR-Q1在菌株中的位置及特征;分析数据库和实验室中志贺菌CRISPR-Q1中间隔序列数与CRISPR1或CRISPR2的关系。结果:在数据库107株志贺菌中,106株志贺菌含有CRISPR1或CRISPR2,8株志贺菌的CRISPR1或CRISPR2含有多个间隔序列;106株志贺菌含有CRISPR-Q1,其中有13株志贺菌的CRISPR-Q1中有多个间隔序列。在实验室12株志贺菌中,有6株含有CRISPR1或CRISPR2,12株均含有CRISPR-Q1;CRISPR-Q1间隔序列中的一部分(约35bp)在同一个菌株的染色体基因组上分布广泛,重复序列同样如此,CRISPR-Q1中还存在基因外重复序列(REP)元素。数据库志贺菌中的CRISPR-Q1间隔序列数与CRISPR1和CRISPR2有关联(χ~2=61.6,P<0.01),实验室志贺菌中的CRISPR-Q1间隔序列数与CRISPR1和CRISPR2有关联(P=0.015)。结论:CRISPR-Q1在志贺菌中广泛分布,其序列中存在REP元素;志贺菌的CRISPR1和CRISPR2与CRISPR-Q1有关联。

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术已成为生物医学领域中研究基因功能及其表达调控的重要手段之一。随着CRISPR技术的拓展,各种基于CRISPR技术的新型研究、诊断和治疗等工具得到进一步的开发,并在新型动物疾病模型的建立、疾病快速诊断、肿瘤及免疫相关性疾病的治疗等方面取得了重大进展和突破。我们重点对CRISPR/CRISPR相关蛋白(Cas)技术的发展现状及其在生物医学领域的应用进展进行综述,并对其未来应用前景和发展方向进行讨论和展望。

食源性致病菌耐药性与成簇的规律间隔短回文重复序列系统关联性研究进展

近年来,随着对抗生素的滥用,食源性致病菌的耐药性问题日趋严重。目前除了从管理上规范抗生素的使用,对规律间隔短回文重复序列系统(clusterd regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与耐药性相关研究也在持续进行。CRISPR-Cas作为一种天然免疫机制,因为其独特的免疫作用机理,目前常被用以基因编辑、耐药性等方面研究。本文对CRISPR-Cas系统进行简要介绍,从其结构、原理以及目前的研究趋势对不同菌株间CRISPR系统与耐药性、毒力因素进行相关总结,为防治食源性致病菌引起的食品安全问题提供新思路。

成簇的规律间隔的短回文重复序列/成簇的规律间隔的短回文重复序列关联系统在核酸检测中的应用进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR关联基因(Cas)系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古生菌中的一种后天免疫系统,以消灭外来的质体或者噬菌体,其中CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13系统在核酸检测领域得到应用。该研究简要介绍了CRISPR/Cas系统的分类、作用机制及在核酸检测中的应用。

成簇规律间隔的短回文重复序列/Cas9及在Duchenne型肌营养不良中应用的研究进展

成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9存在于细菌和古细菌中,是细菌抵抗噬菌体入侵的适应性免疫系统,可通过向导RNA靶向外源性DNA并对其进行剪切,还可经修饰后进行基因的过表达、阻断以及高通量筛选,扩大了CRISPR系统的应用范围。新近发现的CRISPR/C2c2系统可靶向降解外源性RNA,在特异性及效率上较RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术更有优势。应用CRISPR/Cas9系统修正小鼠抗肌萎缩蛋白,可使抗肌萎缩蛋白表达持久,肌力恢复良好,且无明显脑部及生殖系统不良反应,为Duchenne型肌营养不良提供了新的治疗方向。本文就CRISPR/Cas9及其在Duchenne型肌营养不良中应用的研究进展作一综述。

CRISPR-Cas13a系统在病原体检测应用中的最新研究进展

规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR-Cas)系统已作为近年来兴起的新一代分子诊断工具,被广泛应用于基因编辑、核酸检测等领域,其中Cas13a亚型因其在核酸检测中高特异度、高灵敏度、无需昂贵设备、操作简单、费用低廉等特点,在病原体检测领域展现出巨大的潜力。该文综述了CRISPR-Cas13a的作用机制、在病原体检测中的应用以及相关检测方法,并对Cas13a应用前景进行了展望。以期为CRISPR-Cas13a系统的进一步研究及其在病原体检测中的应用提供借鉴和参考。

志贺菌成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白基因cas1和cas2研究

目的：研究成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白基因cas1和cas2在志贺菌中的分布，并分析cas1和cas2基因突变与细菌耐药的关系。方法采用PCR扩增196株志贺菌cas1和cas2基因。对3株志贺菌（Z23、2003135、2008113）的cas2、cas1（a）和cas1（b）基因进行测序，分析其突变与耐药之间的关系。结果196株志贺菌均检出CRISPR相关蛋白基因cas1和cas2。测序结果显示，cas2的一致性为96.44%，cas1（a）的一致性为97.61%，cas1（b）的一致性为96.97%。菌株2003135的cas1（b）基因有2个突变位点：3177129位点（C→G）及3177126位点（G→C），Z23、2008113对应位置没有突变。药敏结果显示菌株2003135的耐抗生素种类和耐抗生素数目均大于菌株Z23、2008113。结论志贺菌中CRISPR基因广泛存在。cas1（b）基因突变菌株与未突变株比较，耐药性增强。cas1（b）基因突变可能是引起耐药程度不同的原因之一。

一种新的沙门氏菌成簇重复序列的预测方法

目的建立一个新的、直观的鉴定和显示细菌基因组成簇重复序列的方法,了解沙门氏菌基因组成簇重复序列的组成特征。方法直接将细菌的基因组用滑动窗口法切割成重叠片段,每一个片段自体比对,利用Pip Maker生成共线性图。通过共线性图特征识别成簇重复序列区。结果用所设计方案-成簇重复序列预测器(CRpred)对鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株基因组进行扫描,总共鉴定出151个成簇重复区。特征分析表明,这些成簇重复区包含低拷贝简单串联重复、高拷贝简单串联重复、间隔串联重复、反向回文重复和反向间隔重复等5种类型。此外,沙门氏菌基因组中有9个复杂重复区域无法使用上述模式进行归类。结论提出了一个新的、简便直观的基因组成簇重复序列的鉴定方法,为搜寻成簇的、规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、数目可变串联重复序列(VNTR)以及其他重复序列相关研究提供支持。

应用规律成簇的间隔短回文重复/Cas9构建敲除趋化因子受体4的人胶质瘤U251细胞

目的 运用规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）/Cas9基因编辑技术构建敲除趋化因子受体4 （CXCR4）基因的人脑胶质瘤U251细胞.方法 设计3对针对目标基因CXCR4的导向RNA（sgRNA）,通过PX335质粒构建3组该基因的Cas9表达载体（CXCR4-sgRNA-1、CXCR4-sgRNA-2、CXCR4-sgRNA-3）,测序验证后,将构建正确的载体CXCR4-sgRNA-1转染进至U251细胞,T7核酸内切酶Ⅰ （T7E1）酶切鉴定敲除效率,分离单克隆细胞5组进行培养,分别测序及蛋白印迹法鉴定其敲除效率和蛋白含量,获得稳定敲除阳性单克隆细胞.结果 测序验证CXCR4-sgRNA-1组载体构建成功,转染载体后U251细胞经聚合酶联反应（PCR）酶切鉴定敲除效率为48％,其2、3、4、5号单克隆细胞敲除效率分别为20％、40％、30％、20％.PCR产物连接T载体后测序,结果显示3组出现点突变,2号为A突变为G,4号为T突变为C和5号为A突变为G,而3号单克隆敲入38 bp碱基,确定为有意义的突变.2、3、4号单克隆细胞CXCR4蛋白表达量为0,敲除组CXCR4蛋白相对表达量较对照组明显降低（0比0.746±0.010,P=0.000）,差异有统计学意义.免疫印迹结果说明敲除CXCR4基因的U251细胞株内无CXCR4蛋白的表达;测序比对得到有效的敲除细胞株.结论 通过CRISPR/Cas9系统高效地获得了靶向CXCR4重组质粒,并且筛选出稳定敲除CXCR4表达的U251细胞株.

志贺菌成簇的规律间隔的短回文重复序列系统结构特征的生物信息学分析

利用生物信息学方法探索志贺菌成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统结构的特征。本文通过BLAST、序列比对、RNA二级结构预测等方法对志贺菌CRISPR进行研究。结果显示:志贺菌的4个群中均发现有CRISPR结构,其侧翼上、下游序列可分为相同组群,在leader序列中存在具有回文性质、相对保守的motif;侧翼序列与重复序列具有相同的分组,重复序列有一定的保守性,可以形成以"茎"为主和以"环"为主两类不同的RNA二级结构;间隔序列与质粒或噬菌体有一定的同源性。本研究表明重复序列与侧翼序列间存在相关性,重复序列可能作为一种识别机制来介导外源元素与Cas蛋白间的相互作用。

云南省鼠疫耶尔森菌规律成簇间隔短回文重复序列分型

鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）基因组中包含3个规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）位点（YPa,YPb和YPc）.本研究对云南省不同生态型鼠疫菌株的CRISPR序列进行分析,了解不同鼠疫疫源地及鼠疫菌株间的相互联系.

成簇的规律间隔短回文重复序列技术在鼠疫菌基因分型中的应用

目的针对分离自内蒙古高原长爪沙鼠鼠疫自然疫源地的鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌),进行DNA成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)分型,对比同一类型疫源地,不同地区分离的菌株基因型,建立沙鼠鼠疫疫源地鼠疫菌株的CRISPR基因库,为疫情的追溯和流行病学分析奠定基础。方法应用3对CRISPR引物(YPa、YPb、YPc)将实验菌株DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增并测序,然后将所测得CRISPR序列与文献最新报道的CRISPR Dictionary比对,找出CRISPR spacer阵列,确定基因型别,最后用Bionumerics 7.6软件制作聚类图,分析其进化关系。结果33株鼠疫菌共发现9种spacer,包括4种YPa(a1、a2、a3、a56)、2种YPb(b1、b2)和3种YPc(c1、c2、c3),经比对所有菌株被归为1个CRISPR基因簇(Cb2),2个基因型,内蒙古自治区(内蒙古)鄂托克旗和杭锦后旗菌株为1个新基因型,命名为2′型(a1-a2-a3-a56,b1-b2,c1-c2-c3),内蒙古乌拉特前旗、河北省康保县和宁夏回族自治区银川市的菌株均为基因1型(a1-a2-a3,b1-b2,c1-c2-c3)。结论鼠疫菌在内蒙古长爪沙鼠鼠疫疫源地整体上遗传稳定,归于1个基因簇,但是也存在一些微进化,体现在不同地区的菌株有不同的基因型。

成簇的规律间隔短回文重复序列在致病菌中分型研究及应用

为全面深入了解CRISPR在致病菌中的最新进展,该文简介了CRISPR的结构与功能,深入论述其在各类致病菌中的分型研究及应用情况,剖析CRISPR分型研究现有问题和措施,并展望今后CRISPR重点研究方向。CRISPR分型在各类致病菌中有着不同程度应用,在结核分枝杆菌复合群、沙门氏菌、产志贺毒素大肠杆菌等致病菌中已获成功。加强多种致病菌的全基因组测序及扩充CRISPR数据库,CRISPR分型将会应用更广泛。

规律成簇的间隔短回文重复序列中间隔序列的噬菌体来源研究

目的发现在现有的全基因组测序完成的原核生物中规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）系统中间隔序列分布规律以及间隔序列中噬菌体来源情况。方法整理现有CRISPR数据库中2762株细菌基因组中的CRISPR系统和其中的间隔序列数据,整理Gen Bank数据库中发表的1444个噬菌体基因组数据。利用BLASTN软件对间隔序列数据与噬菌体基因组进行相似性比较,计数资料比较使用χ2检验。结果在2762个细菌基因组中整理出1940个基因组存在确定或可能的CRISPR结构和90 096条间隔序列,多数基因组具有1～50条间隔序列（1414/1940,72.9%）,间隔序列数量〉250条的仅有58个基因组（58/1940,3.0%）。其中古细菌13株（13/150,8.6%）,真细菌45株（45/2612,1.7%）,差异有统计学意义（χ2=29.98,P〈0.01）。相似性比较结果共发现245个细菌基因组的1055条间隔序列,成功比对上363个噬菌体,比对成功率仅为0.12%。结论细菌基因组中的CRISPR系统中间隔序列数量存在较大差异,古细菌基因组中CRISPR系统存在更多的间隔序列。相似性比较中噬菌体来源的间隔序列所占比例低,提示与细菌和噬菌体基因组发现较少相关,进一步深入研究可以大幅度提高成功率。

基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的建立

目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后,使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)分别进行酶切;根据松弛环状DNA(rcDNA)和cccDNA的结构差异,设计特异性扩增HBV cccDNA的引物,对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增;并筛选crRNA,建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果利用α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和HBV表面抗原(HBsAg)引物对双重酶切后的产物进行扩增,验证产物中HBV基因组的存在;利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增,验证了产物中只存在HBV cccDNA;利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释,然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测,计算出检测下限为10拷贝/μl。结论本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法,可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测,为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。

CRISPR/Cas12a系统:核酸检测的多功能工具

规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是原核生物的适应性免疫系统,对抗外来遗传物质(如质粒和噬菌体)的攻击。近年来,科学家们发现了一种新型基因编辑工具,一种强大的分子剪刀CRISPR/Cas12a系统,该系统在对靶标DNA进行切割的同时还具有对体系内单链DNA进行任意切割的活性,并将其转移到体外检测系统。本文对CRISPR/Cas12a系统组成、结构、Cas12a与Cas9的对比和CRISPR/Cas12a系统在核酸检测中的应用进行了综述。