规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9靶向Rho GDIα基因敲除质粒的构建及其对小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6迁移的影响

目的利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建Rho鸟苷酸解离抑制因子α(GDIα)的基因敲除载体,并探讨干扰Rho GDIα后对小鼠肝癌细胞Hepa 1-6迁移的影响。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计Rho GDIα的向导RNA(sgRNA)序列,并与PX458载体相连,构建Rho GDIα基因敲除重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1和PX458-Rho GDIα-sgRNA2;脂质体转染法将重组质粒转染入Hepa 1-6细胞抑制Rho GDIα的基因表达;RT-PCR法检测Rho GDIα被抑制后的mRNA表达情况;划痕法检测Rho GDIα干扰后Hepa 1-6细胞迁移距离的差异;迁移小室法检测抑制Rho GDIα后Hepa 1-6细胞迁移数量的差异。结果成功构建了Rho GDIα的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-Rho GDIα-sgRNAs;转染有PX458-Rho GDIα-sgRNA1的Hepa 1-6细胞与对照组只转染空载体PX458的细胞相比,Rho GDIα的表达被明显抑制(P<0.05),而且该组细胞从划痕起始处迁移到空白处距离较远,从迁移小室上端迁移到底端数目明显增多,差异极其显著(P<0.01),说明Rho GDIα被抑制后肝癌细胞的迁移能力提高。结论CRISPR/Cas9法构建的重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1可以有效抑制Rho GDIα的基因表达;Rho GDIα被抑制后明显促进小鼠肝癌细胞Hepa 1-6的迁移,提示在体情况下,Rho GDIα的表达可能起到抑制细胞迁移的重要作用,在肿瘤组织中,可以利用过表达Rho GDIα来抑制肿瘤细胞的转移。

利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9系统敲减α2δ1对人肝癌细胞系Hep-12干性的影响

目的通过规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统敲减人肝癌细胞系Hep12中电压依赖性钙离子通道α2δ1的表达,观察α2δ1敲减后对肝癌细胞干性的影响。方法设计3对靶向α2δ1的向导(sgRNA),长度为20 bp,构建到lenti CRISPRv2-puro载体上,然后在体外检测sgRNA切割活性,利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒,将包装好的病毒感染Hep-12细胞,2 d后加入嘌呤霉素筛选。利用Western blotting验证α2δ1的敲减效果和干性相关基因的表达。通过成球实验检测其体外自我更新能力的变化。结果测序结果显示,sgRNA成功插入载体质粒;体外切割实验显示,3条sgRNA均有切割活性;Western blotting结果显示,α2δ1基因的表达显著降低,干性相关基因B细胞特异性莫洛尼白血病病毒插入位点1(BMI1)和Nanog的表达显著被抑制;无血清培养基成球实验结果表明,敲减α2δ1导致Hep-12细胞的体外自我更新能力减弱。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建敲除α2δ1基因的Hep-12细胞系;敲除α2δ1基因后能抑制Hep-12细胞肿瘤干细胞样特性。

空肠弯曲菌中规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)的检测与结构分析

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是近年在原核生物中发现的针对噬菌体等外源遗传物质的干扰而进化出的获得性和可遗传性生物免疫系统。因其序列的高度多态性及携带遗传信息的可追溯性,成为分子分型方法的理想位点。本研究对江苏地区分离的86株空肠弯曲菌基因组进行CRISPR结构的检测和分析。结果表明:36%的菌株基因组含有CRISPR结构,32株含有确定CRISPR结构的菌株均只含有1个CRISPR结构,CRISPR序列长度范围为92～366 bp;重复序列与数据库中出现频率最高的重复序列一致;识别到的间隔序列共111条,共分为17种类型,有10种类型的间隔序列与CRISPR DB数据库中公布的一致,有7种间隔序列为新报道的间隔序列,共55条,占总间隔序列的49.5%。通过同源性比对发现,间隔序列除与来自同属同种的质粒或噬菌体具有同源性外,有些还与其他致病菌的质粒或噬菌体具有同源性,这种现象说明空肠弯曲菌与其他致病菌可能存在基因的水平转移等信息交流方式。另外,通过CRISPR结构间隔序列的多样性,可以将38株空肠弯曲菌野生菌株分为5种不同的谱型。研究结果为空肠弯曲菌利用CRISPR结构进行分型和溯源提供数据基础。

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术已成为生物医学领域中研究基因功能及其表达调控的重要手段之一。随着CRISPR技术的拓展,各种基于CRISPR技术的新型研究、诊断和治疗等工具得到进一步的开发,并在新型动物疾病模型的建立、疾病快速诊断、肿瘤及免疫相关性疾病的治疗等方面取得了重大进展和突破。我们重点对CRISPR/CRISPR相关蛋白(Cas)技术的发展现状及其在生物医学领域的应用进展进行综述,并对其未来应用前景和发展方向进行讨论和展望。

规律成簇的间隔短回文重复：结构，功能与应用

规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs)是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。最近研究表明,CRISPR与一系列相关蛋白、前导序列一起,为原核生物提供对噬菌体等外源基因的获得性免疫能力,其作用机制可能与真核生物的RNA干扰过程类似。作为基因组中高度可变的区域,CRISPR非常适合成为研究细菌种内分型和微进化的分子靶标。本文综述了CRISPR系统的结构、功能及其应用概况,并对CRISPR研究的前景进行了展望。

基于成簇的规律性间隔的短回文重复序列关联的失活核酸酶9-脱氧核糖核酸甲基转移酶3A基因复合体的O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因启动子区甲基化修饰对胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性影响

目的探讨成簇的规律性间隔的短回文重复序列关联的失活核酸酶9-脱氧核糖核酸甲基转移酶3A基因复合体(CRISPR-dcas9-DNMT3A)介导的O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因(MGMT)基因启动子区域DNA甲基化修饰对胶质瘤细胞替莫唑胺(TMZ)耐药性的影响。方法 CRISPR-dcas9-DNMT3A表达载体通过慢病毒包装感染TMZ耐药细胞系U251-R[U251(中国医学科院基础医学研究所)通过替莫唑胺高浓度反复间歇诱导法诱导产生], 验证其对MGMT启动子区域DNA甲基化程度, MGMT表达水平以及TMZ药物敏感性影响。结果慢病毒感染成功的U251-R细胞, MGMT启动子区域甲基化水平增高[44.7%(17/38)、63.2%(24/38)、77.1%(27/38)比7.9%(3/38), P<0.05], MGMT蛋白表达减少, 细胞对TMZ化疗的敏感性增加(P<0.05)。结论 CRISPR-dcas9-DNMT3A慢病毒感染的U251-R细胞可通过增加其MGMT基因启动子区域甲基化水平减少MGMT蛋白表达从而增加化疗敏感性。

成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术在抗乙型肝炎病毒感染治疗中的应用

缺乏有效根除乙型肝炎病毒（HBV）的药物及技术手段是限制HBV感染无法治愈的瓶颈。成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9系统是近年来新兴的对特定基因位点进行编辑的技术，可以特异性靶向HBV共价闭合环状DNA，有效抑制HBV DNA复制、调控HBV功能蛋白表达，有望成为彻底根除HBV的强有力基因治疗工具。如何利用成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9系统实现对HBV基因组高效靶向修饰，从而达到根治HBV感染的目的已经成为当前国内外学者关注的焦点。现结合国内外最新研究成果，重点总结成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术在抗HBV感染治疗中应用的最新进展，阐述其作为彻底根治HBV感染方案的潜在可能和挑战。

利用CRISPR/Cas9系统制备斑马鱼cbsb敲除模型

目的 采用成簇的规律性间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统对斑马鱼胱硫醚-β-合成酶b基因(cbsb)进行编辑,并制备稳定的斑马鱼cbsb敲除品系。方法 使用ClustalX软件分析斑马鱼cbsb编码蛋白(Cbsb)的保守结构域,利用生物信息学选取向导RNA(gRNA)靶点,体外合成并纯化gRNA和密码子优化的Cas9 mRNA,在刚受精的斑马鱼胚胎(1-cell期)中显微注射混合的gRNA和Cas9 mRNA,提取受精后3 d的斑马鱼幼鱼基因组,通过PCR扩增并测序分析靶点的切割效率,通过基因组扩增和测序筛选并获得cbsb敲除的稳定品系。结果 斑马鱼Cbsb与人、小鼠胱硫醚-β-合成酶(CBS)高度同源。在斑马鱼Cbsb保守结构域的编码序列处设计4个靶点,其中4#靶点具有高效的切割效率,利用该靶点制备并筛选获得多个cbsb敲除斑马鱼,选取-3+13 bps和-228 bps移码突变的两种品系,进一步筛选获得稳定的cbsb敲除品系。结论 利用CRISPR/Cas9系统成功制备了两种斑马鱼cbsb敲除的稳定品系,为进一步在斑马鱼活体中研究Cbsb的功能奠定了基础。

基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的建立

目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后,使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)分别进行酶切;根据松弛环状DNA(rcDNA)和cccDNA的结构差异,设计特异性扩增HBV cccDNA的引物,对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增;并筛选crRNA,建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果利用α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和HBV表面抗原(HBsAg)引物对双重酶切后的产物进行扩增,验证产物中HBV基因组的存在;利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增,验证了产物中只存在HBV cccDNA;利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释,然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测,计算出检测下限为10拷贝/μl。结论本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法,可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测,为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因9系统在干细胞研究中的应用进展

随着对DNA碱基精确识别的核酸酶研究的深入，第3代基因编辑技术，如锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术等发展迅速，由于该类技术能够精确地进行DNA水平的特定位点敲除、插入及替换，加深研究者对生物基因组变化的了解，从而进一步探讨调控生物表型的内源性基因位点，最大限度在体外细胞模型中模拟疾病状态，因此越来越受到研究者的重视。这些技术在真核细胞中的应用也被证实是简便有效且具有位点特异性的，目前已成为实验室的一种常规基因编辑手段。虽然这些技术已进入临床应用阶段，但其脱靶率高、细胞毒性大及基因修饰类型单一等不足也亟待解决。

规律成簇间隔短回文重复序列及相关蛋白9基因编辑技术在肝脏疾病中的应用

近年来,基因编辑技术得到快速发展,基因编辑工具越来越多,且效率越来越高,其中以锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶以及规律成簇间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR/Cas)技术的应用最为广泛.尤其是CRISPR/Cas9技术及相关应用,自从面世以来已经连续3年被《自然》杂志评为“年度十大科学突破”,掀起前所未有的基因编辑研究热潮.“基因编辑婴儿”的诞生所引发的基因编辑相关医学伦理问题,进一步使基因编辑技术成为公众讨论和关注的焦点.CRISPR/Cas9技术因易于操作、效率高及成本低等优点使其在生物医疗领域中得到广泛应用.本文对近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术在肝脏疾病中的应用研究进展进行综述.

成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9敲除Ku80基因提高HEK293T细胞对阿霉素的敏感性

目的利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术将293T细胞中的Ku80基因敲除，建立Ku80敲除的293T细胞株，并验证Ku80缺失对DNA损伤修复的影响以及对293T细胞阿霉素耐药性的影响。方法首先，设计识别针对靶位点的1对DNA Oligos，利用pSpCas9（BB）-2A-Puro （PX459）质粒构建表达导向RNA（sgRNA）载体。载体转染293T细胞。通过定点聚合酶链式反应（PCR）和T7E1内切酶酶切鉴定，确认所设计的sgRNA的有效性。进一步通过细胞有限稀释法和嘌呤霉素筛选，挑选单细胞克隆进行Western blot检测筛选出稳定敲除Ku80基因的293T细胞株。最后通过定点测序确认Ku80编码基因是否发生突变。使用阿霉素处理诱导DNA损伤，以磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）为指标检测DNA损伤，同时用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测Ku80敲除的293T细胞对阿霉素的药物敏感性。结果成功构建Ku80基因敲除的293T细胞，用阿霉素处理诱导DNA损伤并经过修复之后，对照组和Ku80敲除组γ-H2AX染色的阳性率分别为（30.67±2.49）%和（88.00±1.63）%（P=0.000），表明Ku80敲除的293T细胞的DNA损伤修复功能显著受到抑制。同时Ku80敲除显著提高293T细胞对阿霉素的敏感性，阿霉素对Ku80敲除组细胞和对照组细胞的生长抑制率分别为（53.99±1.29）%和（32.42±1.20）%（P=0.000）。结论293T细胞中敲除Ku80抑制了DNA损伤的修复和提高了细胞对阿霉素的敏感性。

应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统核糖核蛋白复合物技术基因修正威尔森氏症的体外研究

目的应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型,设计3个CRISPR来源的RNA(crRNA)-crRNA001/002/003,应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞,48 h后提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率,筛选出效率最高者crRNA001,并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板;用crRNA001和ssODN共转染肝细胞,模板特异性引物行PCR,验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。结果Sanger测序结果显示,crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后,模板特异性引物行PCR,能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带;二代测序结果显示,ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率,相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因,为进一步的体内实验提供理论和实验基础。

利用成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞株的研究

目的探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。方法①选择GATA1基因为目的基因,利用CRISPR/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRNA)]和打靶载体(重组臂),并且以电穿孔的方式将共表达载体、打靶载体及环化重组酶(Cre)导入hPSC的H1细胞系。经电穿孔后的H1细胞培养2 d后,选择24个H1细胞单克隆进行PCR扩增,以验证共表达载体和打靶载体是否被成功导入,以及Cre是否成功去除H1细胞单克隆中的筛选标志物。②挑取经PCR验证的条带大小正确的阳性H1细胞单克隆,进行细胞培养后,提取H1细胞单克隆基因组,并且分别采用引物对1/2(GATA15′端臂外引物/mCherry 3′端引物)和3/5(HygroR 5′端引物/GATA13′端臂外引物)对基因组进行PCR扩增,以验证该H1细胞单克隆是否具有GATA1和mCherry正确序列。③使用构建完成的H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血功能验证实验,以确认基因编辑是否改变H1细胞特性,以及造血分化能力。选择未经基因编辑H1细胞和H1∶GATA1-mCherry细胞,置于相同的造血分化培养条件培养14 d后,分别于610 nm激发波长免疫荧光显微镜下观察,并采用流式细胞术(FCM)对细胞表面标志物CD34、CD43、CD45进行检测。选取培养至GATA1大量表达时期的H1∶GATA1-mCherry细胞,进行细胞甩片和免疫荧光染色实验。对经过基因编辑的H1∶GATA1-mCherry细胞,进行GATA1特异抗体染色体,观察其能否准确追踪并指示GATA1。结果①经电穿孔转入打靶载体和共表达载体后,H1细胞单克隆PCR扩增产物的电泳结果显示,H1细胞经电穿孔后,可获得2710和945 bp的PCR扩增产物电泳条带;电泳条带为2710 bp,说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列,但是Cre没有去除筛选标志物;条带大小为945 bp,说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列,并且Cre已去除筛选标志物,为目的H1细胞。选取24个H1细胞单克隆进行PCR验证结果显示,打靶载体和共表达载体成功敲入的H1细胞克隆、打靶载体和共表达载体成功敲入且Cre去除筛选标志的H1细胞克隆(目的细胞)及染色体纯合敲入的H1细胞比例分别为80%(20/24)、50%(10/20)和90%(18/20)。②H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血诱导培养14 d时,荧光显微镜下GATA1表达时期可见大量红色荧光,FCM检测结果显示,未经基因编辑H1细胞与H1∶GATA1-mCherry细胞相比,造血干/祖细胞群比例相似,二者CD34^(+)CD45^(+)细胞比例分别为12.4%和14.1%,CD34^(+)CD45^(+)细胞比例分别为17.0%和20.2%,表明H1∶GATA1-mCherry细胞的造血分化能力没有改变。③GATA1高表达时期H1∶GATA1-mCherry细胞的免疫荧光染色实验结果显示,荧光显微镜下可见仅GATA1抗体染色阳性细胞有mCherry标志物,表明H1∶GATA1-mCherry细胞通过mCherry荧光蛋白对GATA1基因的标记是准确且特异的。结论本研究以GATA1为目的基因,在hPSC中快速、高效进行基因敲入,成功建立快速、实时示踪目的基因表达的方法。

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因编辑技术在感染性疾病诊断中的应用及其进展

规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)与相关蛋白Cas(CRISPR-Cas)系统是近来的研究热点,除在基因编辑方面有重要作用外,其应用于感染性疾病诊断方面也有很好的发展前景。传统感染性疾病检测及分子检测诊断技术在操作、检测周期及敏感度、特异度等方面存在不足。随着对CRISPR-Cas系统的深入研究,针对其特异核酸的识别和遗传修饰功能,可开展对感染性病原体检测技术的应用,目前发现可应用于检测的主要有Cas9、Cas12a和Cas13核酸酶。利用该检测技术的高效性、特异性和可编程性,可开展对寨卡病毒、登革热病毒、疟疾菌株、结核分枝杆菌、人乳头瘤病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒及严重急性呼吸综合征冠状病毒2等一系列感染性疾病病原体的检测。CRISPR-Cas基因编辑技术可能成为一种快速、灵敏、特异、低廉和可靠的诊断技术,为感染性疾病的诊断提供重要的理论依据。笔者主要对Cas9、Cas12a、Cas13等在感染性疾病诊断中的应用及其进展进行综述。

成簇规律间隔的短回文重复序列/Cas9及在Duchenne型肌营养不良中应用的研究进展

成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9存在于细菌和古细菌中,是细菌抵抗噬菌体入侵的适应性免疫系统,可通过向导RNA靶向外源性DNA并对其进行剪切,还可经修饰后进行基因的过表达、阻断以及高通量筛选,扩大了CRISPR系统的应用范围。新近发现的CRISPR/C2c2系统可靶向降解外源性RNA,在特异性及效率上较RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术更有优势。应用CRISPR/Cas9系统修正小鼠抗肌萎缩蛋白,可使抗肌萎缩蛋白表达持久,肌力恢复良好,且无明显脑部及生殖系统不良反应,为Duchenne型肌营养不良提供了新的治疗方向。本文就CRISPR/Cas9及其在Duchenne型肌营养不良中应用的研究进展作一综述。

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因系统的发展及应用研究进展

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因(CRISPR/Cas)系统,作为一种新兴的基因编辑系统,根据Cas蛋白的数量可分为一类系统和二类系统。二类系统中的CRISPR/Cas9仅借助Cas9蛋白和单链向导RNA即可对目标核酸进行切割,是目前应用最为广泛的CRISPR/Cas系统。除了基因编辑在遗传病治疗中的应用,CRISPR/Cas系统衍生出的多种技术在疾病相关基因的筛查、基因表达调控、病原微生物的快速检测和防治等领域也展现了巨大的应用前景。本文就CRISPR/Cas系统的发现历程及其衍生的几个主要技术的应用进行总结,旨在为生命科学领域研究人员提供参考。

规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白系统在传染病病原体核酸检测中的应用

作为新一代的基因编辑技术,规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins,CRISPR/Cas)系统具有强大的基因编辑功能,已被应用于许多领域。目前,已开发的规律成簇的间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,Cas)9、Cas12、Cas13和Cas14检测系统被广泛应用于传染病病原体的核酸检测,具有检测成本低、操作简单、灵敏度高等优点。本研究介绍了CRISPR/Cas系统的发展史、作用机制,以及几种Cas蛋白在传染病相关病原核酸检测中的应用。

利用CRISPR-Cas9技术构建微小核糖核酸-551b基因敲除小鼠模型

目的:利用成簇规律性间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)相关蛋白9(CRISP associated protein 9,Cas9)技术构建微小核糖核酸-551b(miR-551b)基因敲除小鼠模型。方法:选择健康C57BL/6J小鼠,针对miR-551b外显子1区域,设计导向RNA(guide RNA,gRNA),构建Cas9载体质粒,将体外转录的Cas9 RNA及gRNA显微注射入小鼠的受精卵并体外培养。将培养合格的胚胎移植到代孕小鼠的输卵管中,待小鼠生育后得到F0代小鼠,使用基因测序确定基因敲除情况,与野生型小鼠繁育后,得到F1代杂合小鼠,F1代小鼠经自交繁育获得F2代小鼠,F3代小鼠由F2代纯合小鼠自交获得,采用电泳鉴定小鼠基因型,RT-PCR检测F3代小鼠组织miR-551b的表达。结果:利用CRISPR/Cas9技术构建模型小鼠得到F0代小鼠,通过测序筛选出缺失目标序列的F0代杂合子小鼠。与WT小鼠繁育后,琼脂糖凝胶电泳及测序筛选出F1代杂合小鼠,同样的方法鉴定并获得F2、F3代基因敲除小鼠,获取F3代纯合小鼠的心脏及下腔静脉样本,RT-PCR结果证实F3代纯合小鼠miR551b表达明显低于WT小鼠(P<0.05),成功敲除miR-551b基因。结论:通过CRISPR-Cas9技术成功构建miR⁃155基因敲除小鼠模型并稳定遗传,为进一步研究提供了有利条件。

靶向叉头框蛋白J2的CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建及其对肝癌细胞转化生长因子β/Smads表达和增殖的影响

目的构建靶向叉头框蛋白J2(FOXJ2)的规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因敲除质粒,探讨干扰FOXJ2基因后对小鼠肝癌细胞Hepa1-6的信号通路转化生长因子β/Smads家族蛋白(TGF-β/Smads)表达和增殖的影响。方法设计小鼠FOXJ2的小向导RNA(sgRNA)序列,与PX458载体连接并转化感受态大肠埃希菌,挑取单克隆扩增提质粒。利用脂质体将重组质粒PX458-FOXJ2-sgRNAs转染入肝癌细胞Hepa1-6,对照组只转染空载体,48 h后RT-PCR检测对Hepa1-6细胞FOXJ2的抑制作用,同时检测FOXJ2被抑制后TGF-β和Smads的表达情况;MTT法检测干扰FOXJ2后对肝癌细胞增殖能力的影响。结果成功构建3个FOXJ2的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-FOXJ2-sgRNAs,其中质粒PX458-FOXJ2-sgRNA2可以有效抑制FOXJ2的表达,同时检测到干扰了FOXJ2的细胞的TGF-β、Smad2和Smad4的表达均高于对照组,差异显著;并且FOXJ2被抑制组肝癌细胞的增殖能力明显提高。结论小鼠肝癌细胞中的FOXJ2基因在一定程度上抑制TGF-β、Smad2和Smad4基因的表达,抑制细胞的增殖,推测在体情况下,肝癌细胞的增殖和TGF-β信号通路的激活与FOXJ2基因的负调控有一定的相关性,FOXJ2可以作为肝癌预防和治疗的靶点分子进行干预。