成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术已成为生物医学领域中研究基因功能及其表达调控的重要手段之一。随着CRISPR技术的拓展,各种基于CRISPR技术的新型研究、诊断和治疗等工具得到进一步的开发,并在新型动物疾病模型的建立、疾病快速诊断、肿瘤及免疫相关性疾病的治疗等方面取得了重大进展和突破。我们重点对CRISPR/CRISPR相关蛋白(Cas)技术的发展现状及其在生物医学领域的应用进展进行综述,并对其未来应用前景和发展方向进行讨论和展望。

CRISPR-Cas13a系统在病原体检测应用中的最新研究进展

规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR-Cas)系统已作为近年来兴起的新一代分子诊断工具,被广泛应用于基因编辑、核酸检测等领域,其中Cas13a亚型因其在核酸检测中高特异度、高灵敏度、无需昂贵设备、操作简单、费用低廉等特点,在病原体检测领域展现出巨大的潜力。该文综述了CRISPR-Cas13a的作用机制、在病原体检测中的应用以及相关检测方法,并对Cas13a应用前景进行了展望。以期为CRISPR-Cas13a系统的进一步研究及其在病原体检测中的应用提供借鉴和参考。

CRISPR-Cas系统在病原微生物分子诊断中的研究进展

快速、灵敏、准确的病原微生物检测方法对感染性疾病的诊治及防控至关重要。基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)系统的检测技术在病原微生物核酸检测中具有高灵敏度和高特异度的特点,该文概述了CRISPR-Cas系统的作用机制及不同Cas的核酸酶活性,总结了基于CISPR-Cas系统的检测技术在病原微生物核酸检测中的研究现状,对该系统在核酸检测应用中的挑战进行了综合分析,并提出了目前存在的一些解决方案。目前基于CRISPR-Cas系统的非核酸分析物检测仍处于前期研究阶段,但其在扩大检测范围、缩短检测时间、提高检测灵敏度等方面具有较大潜力,为开发基于CRISPR-Cas系统的病原微生物检测平台提供新思路。

CRISPR-Cas系统在食源性致病菌检测中的研究进展

食源性致病菌的快速检测对预防食源性疾病的爆发具有重要意义。成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats,CRISPR)及CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)构成的CRISPR-Cas系统已被广泛的应用于核酸检测,并在对食源性致病菌的检测中展现出快速、灵敏度高、特异性强等优势。本文介绍了CRISPR-Cas系统的原理、机制,总结了CRISPR-Cas系统与不同扩增方法和信号输出模式相结合在食源性致病菌检测中的应用,并讨论了这些检测方法存在的一些问题和挑战,最后对该技术的未来发展前景进行展望,旨在为食源性致病菌的快速检测提供新思路。

规律成簇的间隔短回文重复：结构，功能与应用

规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs)是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。最近研究表明,CRISPR与一系列相关蛋白、前导序列一起,为原核生物提供对噬菌体等外源基因的获得性免疫能力,其作用机制可能与真核生物的RNA干扰过程类似。作为基因组中高度可变的区域,CRISPR非常适合成为研究细菌种内分型和微进化的分子靶标。本文综述了CRISPR系统的结构、功能及其应用概况,并对CRISPR研究的前景进行了展望。

利用CRISPR-Cas9技术构建微小核糖核酸-551b基因敲除小鼠模型

目的:利用成簇规律性间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)相关蛋白9(CRISP associated protein 9,Cas9)技术构建微小核糖核酸-551b(miR-551b)基因敲除小鼠模型。方法:选择健康C57BL/6J小鼠,针对miR-551b外显子1区域,设计导向RNA(guide RNA,gRNA),构建Cas9载体质粒,将体外转录的Cas9 RNA及gRNA显微注射入小鼠的受精卵并体外培养。将培养合格的胚胎移植到代孕小鼠的输卵管中,待小鼠生育后得到F0代小鼠,使用基因测序确定基因敲除情况,与野生型小鼠繁育后,得到F1代杂合小鼠,F1代小鼠经自交繁育获得F2代小鼠,F3代小鼠由F2代纯合小鼠自交获得,采用电泳鉴定小鼠基因型,RT-PCR检测F3代小鼠组织miR-551b的表达。结果:利用CRISPR/Cas9技术构建模型小鼠得到F0代小鼠,通过测序筛选出缺失目标序列的F0代杂合子小鼠。与WT小鼠繁育后,琼脂糖凝胶电泳及测序筛选出F1代杂合小鼠,同样的方法鉴定并获得F2、F3代基因敲除小鼠,获取F3代纯合小鼠的心脏及下腔静脉样本,RT-PCR结果证实F3代纯合小鼠miR551b表达明显低于WT小鼠(P<0.05),成功敲除miR-551b基因。结论:通过CRISPR-Cas9技术成功构建miR⁃155基因敲除小鼠模型并稳定遗传,为进一步研究提供了有利条件。

CRISPR-Cas9高通量文库筛选技术在胶质瘤中的应用进展

胶质瘤是最常见的神经系统肿瘤,其治疗以手术切除、术后辅助放化疗为主,但效果不理想,预后较差。成簇间隔规律短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(Cas9)高通量文库筛选技术以合成致死治疗策略为基础,通过CRISPR-Cas9技术对胶质瘤细胞进行基因编辑,将单向导RNA转入细胞中,在全基因组范围内干扰基因功能并筛选目的表型,以获得一系列与肿瘤发生发展机制及治疗相关的靶基因。目前,CRISPR-Cas9高通量文库筛选技术在胶质瘤中被广泛研究,已在细胞模型、动物模型等模型中获得了一系列与胶质瘤增殖、药物敏感性及耐药相关的靶基因,这可为后续临床胶质瘤的个体化靶向治疗提供新的指导方向,以得到更好的临床治疗效果。

CRISPR-Cas基因编辑技术在微生物组工程中的应用

微生物组工程是对复杂微生物群落进行改造,在基因组、代谢组及群落生态结构等多个层次上实现微生物组的精准调控.成簇规律间隔短回文序列(CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-Cas)系统是近期发展迅速的高效基因编辑工具.本文回顾了微生物组工程领域CRISPR-Cas系统的重要研究工作,重点关注CRISPR-Cas系统在微生物组的基因编辑和生态调控方面的应用.针对CRISPR-Cas系统在微生物组工程领域的应用挑战,本文从外源DNA递送方式和基因表达调控元件两个方面总结了微生物组工程的关键辅助方法与发展趋势,展望了微生物组工程领域所面临的挑战与机遇.

成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术在抗乙型肝炎病毒感染治疗中的应用

缺乏有效根除乙型肝炎病毒（HBV）的药物及技术手段是限制HBV感染无法治愈的瓶颈。成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9系统是近年来新兴的对特定基因位点进行编辑的技术，可以特异性靶向HBV共价闭合环状DNA，有效抑制HBV DNA复制、调控HBV功能蛋白表达，有望成为彻底根除HBV的强有力基因治疗工具。如何利用成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9系统实现对HBV基因组高效靶向修饰，从而达到根治HBV感染的目的已经成为当前国内外学者关注的焦点。现结合国内外最新研究成果，重点总结成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术在抗HBV感染治疗中应用的最新进展，阐述其作为彻底根治HBV感染方案的潜在可能和挑战。

基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的建立

目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后,使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)分别进行酶切;根据松弛环状DNA(rcDNA)和cccDNA的结构差异,设计特异性扩增HBV cccDNA的引物,对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增;并筛选crRNA,建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果利用α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和HBV表面抗原(HBsAg)引物对双重酶切后的产物进行扩增,验证产物中HBV基因组的存在;利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增,验证了产物中只存在HBV cccDNA;利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释,然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测,计算出检测下限为10拷贝/μl。结论本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法,可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测,为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因9系统在干细胞研究中的应用进展

随着对DNA碱基精确识别的核酸酶研究的深入，第3代基因编辑技术，如锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术等发展迅速，由于该类技术能够精确地进行DNA水平的特定位点敲除、插入及替换，加深研究者对生物基因组变化的了解，从而进一步探讨调控生物表型的内源性基因位点，最大限度在体外细胞模型中模拟疾病状态，因此越来越受到研究者的重视。这些技术在真核细胞中的应用也被证实是简便有效且具有位点特异性的，目前已成为实验室的一种常规基因编辑手段。虽然这些技术已进入临床应用阶段，但其脱靶率高、细胞毒性大及基因修饰类型单一等不足也亟待解决。

CRISPR-Cas13a系统在基因编辑和分子诊断领域中的研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)系统是一个强大的基因编辑工具。相对于Cas9,Cas13a可靶向多基因转录产物,从而调控基因功能表达,填补了Cas9仅限于DNA水平的编辑及脱靶效应等缺陷。不仅如此,利用Cas13a靶向RNA的特性,该系统被成功地改造成下一代核酸诊断工具。文章概述了CRISPR-Cas13系统在基因编辑及分子诊断领域的最新研究进展,并对该系统的应用前景进行了展望。

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因系统的发展及应用研究进展

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因(CRISPR/Cas)系统,作为一种新兴的基因编辑系统,根据Cas蛋白的数量可分为一类系统和二类系统。二类系统中的CRISPR/Cas9仅借助Cas9蛋白和单链向导RNA即可对目标核酸进行切割,是目前应用最为广泛的CRISPR/Cas系统。除了基因编辑在遗传病治疗中的应用,CRISPR/Cas系统衍生出的多种技术在疾病相关基因的筛查、基因表达调控、病原微生物的快速检测和防治等领域也展现了巨大的应用前景。本文就CRISPR/Cas系统的发现历程及其衍生的几个主要技术的应用进行总结,旨在为生命科学领域研究人员提供参考。

规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白系统在传染病病原体核酸检测中的应用

作为新一代的基因编辑技术,规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins,CRISPR/Cas)系统具有强大的基因编辑功能,已被应用于许多领域。目前,已开发的规律成簇的间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,Cas)9、Cas12、Cas13和Cas14检测系统被广泛应用于传染病病原体的核酸检测,具有检测成本低、操作简单、灵敏度高等优点。本研究介绍了CRISPR/Cas系统的发展史、作用机制,以及几种Cas蛋白在传染病相关病原核酸检测中的应用。

规律成簇间隔短回文重复序列及相关蛋白9基因编辑技术在肝脏疾病中的应用

近年来,基因编辑技术得到快速发展,基因编辑工具越来越多,且效率越来越高,其中以锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶以及规律成簇间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR/Cas)技术的应用最为广泛.尤其是CRISPR/Cas9技术及相关应用,自从面世以来已经连续3年被《自然》杂志评为“年度十大科学突破”,掀起前所未有的基因编辑研究热潮.“基因编辑婴儿”的诞生所引发的基因编辑相关医学伦理问题,进一步使基因编辑技术成为公众讨论和关注的焦点.CRISPR/Cas9技术因易于操作、效率高及成本低等优点使其在生物医疗领域中得到广泛应用.本文对近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术在肝脏疾病中的应用研究进展进行综述.

基于CRISPR/Cas9方法构建‘沪农灵芝1号’基因编辑系统

构建密码子优化的cas 9表达质粒pMD-EXP-cas 9,通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导转化灵芝(Ganoderma lucidum)菌株‘沪农灵芝1号’(‘Hunong No.1’)单核菌株L1,得到含有cas9完整表达盒的菌株L1-cas9。利用T7启动子构建靶向ura3基因的表达质粒psgRNA-1和psgRNA-2,体外转录后得到sgRNA 1和sgRNA 2。通过PEG介导的转化,将sgRNA 1和sgRNA 2转化进L1-cas9的原生质体中,得到ura3基因被破坏的突变体,首次在‘沪农灵芝1号’菌株单核体中构建成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑系统,ura3基因的编辑效率为4个突变体(107个原生质体)。利用0.006%曲拉通X-100优化PEG介导的转化系统,可使ura3基因编辑效率提高至18个以上突变体(107个原生质体),本研究的结果为灵芝基因功能的研究和分子育种提供更高效的方法。

成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9敲除Ku80基因提高HEK293T细胞对阿霉素的敏感性

目的利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术将293T细胞中的Ku80基因敲除，建立Ku80敲除的293T细胞株，并验证Ku80缺失对DNA损伤修复的影响以及对293T细胞阿霉素耐药性的影响。方法首先，设计识别针对靶位点的1对DNA Oligos，利用pSpCas9（BB）-2A-Puro （PX459）质粒构建表达导向RNA（sgRNA）载体。载体转染293T细胞。通过定点聚合酶链式反应（PCR）和T7E1内切酶酶切鉴定，确认所设计的sgRNA的有效性。进一步通过细胞有限稀释法和嘌呤霉素筛选，挑选单细胞克隆进行Western blot检测筛选出稳定敲除Ku80基因的293T细胞株。最后通过定点测序确认Ku80编码基因是否发生突变。使用阿霉素处理诱导DNA损伤，以磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）为指标检测DNA损伤，同时用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测Ku80敲除的293T细胞对阿霉素的药物敏感性。结果成功构建Ku80基因敲除的293T细胞，用阿霉素处理诱导DNA损伤并经过修复之后，对照组和Ku80敲除组γ-H2AX染色的阳性率分别为（30.67±2.49）%和（88.00±1.63）%（P=0.000），表明Ku80敲除的293T细胞的DNA损伤修复功能显著受到抑制。同时Ku80敲除显著提高293T细胞对阿霉素的敏感性，阿霉素对Ku80敲除组细胞和对照组细胞的生长抑制率分别为（53.99±1.29）%和（32.42±1.20）%（P=0.000）。结论293T细胞中敲除Ku80抑制了DNA损伤的修复和提高了细胞对阿霉素的敏感性。

利用成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞株的研究

目的探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。方法①选择GATA1基因为目的基因,利用CRISPR/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRNA)]和打靶载体(重组臂),并且以电穿孔的方式将共表达载体、打靶载体及环化重组酶(Cre)导入hPSC的H1细胞系。经电穿孔后的H1细胞培养2 d后,选择24个H1细胞单克隆进行PCR扩增,以验证共表达载体和打靶载体是否被成功导入,以及Cre是否成功去除H1细胞单克隆中的筛选标志物。②挑取经PCR验证的条带大小正确的阳性H1细胞单克隆,进行细胞培养后,提取H1细胞单克隆基因组,并且分别采用引物对1/2(GATA15′端臂外引物/mCherry 3′端引物)和3/5(HygroR 5′端引物/GATA13′端臂外引物)对基因组进行PCR扩增,以验证该H1细胞单克隆是否具有GATA1和mCherry正确序列。③使用构建完成的H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血功能验证实验,以确认基因编辑是否改变H1细胞特性,以及造血分化能力。选择未经基因编辑H1细胞和H1∶GATA1-mCherry细胞,置于相同的造血分化培养条件培养14 d后,分别于610 nm激发波长免疫荧光显微镜下观察,并采用流式细胞术(FCM)对细胞表面标志物CD34、CD43、CD45进行检测。选取培养至GATA1大量表达时期的H1∶GATA1-mCherry细胞,进行细胞甩片和免疫荧光染色实验。对经过基因编辑的H1∶GATA1-mCherry细胞,进行GATA1特异抗体染色体,观察其能否准确追踪并指示GATA1。结果①经电穿孔转入打靶载体和共表达载体后,H1细胞单克隆PCR扩增产物的电泳结果显示,H1细胞经电穿孔后,可获得2710和945 bp的PCR扩增产物电泳条带;电泳条带为2710 bp,说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列,但是Cre没有去除筛选标志物;条带大小为945 bp,说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列,并且Cre已去除筛选标志物,为目的H1细胞。选取24个H1细胞单克隆进行PCR验证结果显示,打靶载体和共表达载体成功敲入的H1细胞克隆、打靶载体和共表达载体成功敲入且Cre去除筛选标志的H1细胞克隆(目的细胞)及染色体纯合敲入的H1细胞比例分别为80%(20/24)、50%(10/20)和90%(18/20)。②H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血诱导培养14 d时,荧光显微镜下GATA1表达时期可见大量红色荧光,FCM检测结果显示,未经基因编辑H1细胞与H1∶GATA1-mCherry细胞相比,造血干/祖细胞群比例相似,二者CD34^(+)CD45^(+)细胞比例分别为12.4%和14.1%,CD34^(+)CD45^(+)细胞比例分别为17.0%和20.2%,表明H1∶GATA1-mCherry细胞的造血分化能力没有改变。③GATA1高表达时期H1∶GATA1-mCherry细胞的免疫荧光染色实验结果显示,荧光显微镜下可见仅GATA1抗体染色阳性细胞有mCherry标志物,表明H1∶GATA1-mCherry细胞通过mCherry荧光蛋白对GATA1基因的标记是准确且特异的。结论本研究以GATA1为目的基因,在hPSC中快速、高效进行基因敲入,成功建立快速、实时示踪目的基因表达的方法。

CRISPR/Cas9基因编辑技术与神经系统疾病的基础研究及临床应用进展

规律间隔成簇短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种由获得性免疫系统在微生物中开发的基因组编辑技术,它根据互补碱基配对原理在特定位点插入或移除基因,或修复致病基因突变,具有高效、简便、低廉的特点,在基础研究和疾病治疗领域显示出巨大的潜力。近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术发展迅速,在多种神经疾病模型的构建、致病基因筛选和靶向治疗等方面具有极大的应用潜力,被评估为神经相关类型疾病研究和治疗的一种有前途的方法。未来,对CRISPR/Cas9基因编辑技术进行深入研究有望为神经系统相关疾病提供有效的治疗方法。

CRISPR/Cas9基因编辑非病毒递送系统

规律间隔成簇短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统的基因编辑技术为哺乳细胞基因组的精准修饰与编辑研究提供了高效、快捷的工具,但其化学生物学应用依然面临着CRISPR基因编辑工具Cas9蛋白和gRNA的细胞及活体递送等问题.近年来,研究人员通过开发多种非病毒递送载体,实现了编码CRISPR/Cas9基因编辑工具的DNA和信使RNA(mRNA)以及Cas9/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物的递送,并应用于靶基因的化学修饰与编辑调控.本文主要概述了近期CRISPR/Cas9基因编辑递送的研究进展,并对其化学生物学应用前景进行了展望.