利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9系统敲减α2δ1对人肝癌细胞系Hep-12干性的影响

目的通过规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统敲减人肝癌细胞系Hep12中电压依赖性钙离子通道α2δ1的表达,观察α2δ1敲减后对肝癌细胞干性的影响。方法设计3对靶向α2δ1的向导(sgRNA),长度为20 bp,构建到lenti CRISPRv2-puro载体上,然后在体外检测sgRNA切割活性,利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒,将包装好的病毒感染Hep-12细胞,2 d后加入嘌呤霉素筛选。利用Western blotting验证α2δ1的敲减效果和干性相关基因的表达。通过成球实验检测其体外自我更新能力的变化。结果测序结果显示,sgRNA成功插入载体质粒;体外切割实验显示,3条sgRNA均有切割活性;Western blotting结果显示,α2δ1基因的表达显著降低,干性相关基因B细胞特异性莫洛尼白血病病毒插入位点1(BMI1)和Nanog的表达显著被抑制;无血清培养基成球实验结果表明,敲减α2δ1导致Hep-12细胞的体外自我更新能力减弱。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建敲除α2δ1基因的Hep-12细胞系;敲除α2δ1基因后能抑制Hep-12细胞肿瘤干细胞样特性。

规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9靶向Rho GDIα基因敲除质粒的构建及其对小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6迁移的影响

目的利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建Rho鸟苷酸解离抑制因子α(GDIα)的基因敲除载体,并探讨干扰Rho GDIα后对小鼠肝癌细胞Hepa 1-6迁移的影响。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计Rho GDIα的向导RNA(sgRNA)序列,并与PX458载体相连,构建Rho GDIα基因敲除重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1和PX458-Rho GDIα-sgRNA2;脂质体转染法将重组质粒转染入Hepa 1-6细胞抑制Rho GDIα的基因表达;RT-PCR法检测Rho GDIα被抑制后的mRNA表达情况;划痕法检测Rho GDIα干扰后Hepa 1-6细胞迁移距离的差异;迁移小室法检测抑制Rho GDIα后Hepa 1-6细胞迁移数量的差异。结果成功构建了Rho GDIα的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-Rho GDIα-sgRNAs;转染有PX458-Rho GDIα-sgRNA1的Hepa 1-6细胞与对照组只转染空载体PX458的细胞相比,Rho GDIα的表达被明显抑制(P<0.05),而且该组细胞从划痕起始处迁移到空白处距离较远,从迁移小室上端迁移到底端数目明显增多,差异极其显著(P<0.01),说明Rho GDIα被抑制后肝癌细胞的迁移能力提高。结论CRISPR/Cas9法构建的重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1可以有效抑制Rho GDIα的基因表达;Rho GDIα被抑制后明显促进小鼠肝癌细胞Hepa 1-6的迁移,提示在体情况下,Rho GDIα的表达可能起到抑制细胞迁移的重要作用,在肿瘤组织中,可以利用过表达Rho GDIα来抑制肿瘤细胞的转移。

志贺菌成簇的规律间隔短回文重复序列的检测及同源性分析

目的:检测志贺菌成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR),并与GenBank全基因组中志贺菌重复序列和间隔序列对比,分析其结构特征及同源性。方法:利用PCR法扩增获得志贺菌CRISPR,采用生物信息学方法对重复序列及间隔序列进行同源性分析;运用多序列比对分析间隔序列特点及其与侧翼序列间的联系;BLAST分析间隔序列与质粒和噬菌体的同源性;weblogo分析重复序列碱基频率及RNAfold预测其RNA二级结构;重复序列的同源聚类分析并用BLAST分析重复序列与其他细菌的同源性。结果:被测3株临床志贺菌及9株全基因组志贺菌中均含有不同数量CRISPR;同一个CRISPR中,间隔序列有的相似、有的完全不同,某些CRISPR间隔序列的部分序列与CRISPR侧翼序列存在同源性,某些间隔序列可能是信息基因和操纵基因的拼接重组;重复序列保守性不一致,可能与细菌进化存在一定的联系,重复序列碱基的差异影响茎的长度,从而影响二级结构的稳定性及CRISPR的功能。重复序列与个别远缘菌种具有较高的同源性。结论:志贺菌存在多样的CRISPR结构,不同CRISPR的重复序列保守性不同。某些间隔序列部分与CRISPR侧翼序列同源,某些间隔序列是多基因拼接而成。

志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列与毒力基因和耐药基因的关系

目的探索志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与毒力基因和耐药基因的关系。方法从GenBank数据库中获得志贺菌的基因组、毒力基因和耐药基因的序列,通过多序列比对等方法获得志贺菌中CRISPR1、CRISPR2和CRISPR-Q1的分布情况、重复序列和间隔序列信息,通过BLAST方法获得毒力基因和耐药基因在志贺菌中的分布情况,SPSS 21.0软件分析CRISPR与毒力基因和耐药基因的关系。结果志贺菌中的CRISPR1和CRISPR2在不同菌株中的间隔序列差别较大,CRISPRQ1分布更为广泛(超过99%)。毒力基因在志贺菌中分布比较广泛(均超过56%),耐药基因中的blaOXA-1、camr、Sul2、tetB分布也比较广(超过50%)。CRISPR1/CRISPR2与是否携带9种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05),CRISPR-Q1与是否携带3种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2和CRISPR-Q1均与志贺菌中存在的毒力基因和耐药基因的个数间有统计学关联(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目之间存在统计学关联(χ2=61.6,P<0.001)。结论志贺菌中不同CRISPR的分布差异比较大,存在的间隔序列数目不等;志贺菌CRISPR与部分毒力基因和耐药基因之间存在负相关;CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目存在正相关。

空肠弯曲菌中规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)的检测与结构分析

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是近年在原核生物中发现的针对噬菌体等外源遗传物质的干扰而进化出的获得性和可遗传性生物免疫系统。因其序列的高度多态性及携带遗传信息的可追溯性,成为分子分型方法的理想位点。本研究对江苏地区分离的86株空肠弯曲菌基因组进行CRISPR结构的检测和分析。结果表明:36%的菌株基因组含有CRISPR结构,32株含有确定CRISPR结构的菌株均只含有1个CRISPR结构,CRISPR序列长度范围为92～366 bp;重复序列与数据库中出现频率最高的重复序列一致;识别到的间隔序列共111条,共分为17种类型,有10种类型的间隔序列与CRISPR DB数据库中公布的一致,有7种间隔序列为新报道的间隔序列,共55条,占总间隔序列的49.5%。通过同源性比对发现,间隔序列除与来自同属同种的质粒或噬菌体具有同源性外,有些还与其他致病菌的质粒或噬菌体具有同源性,这种现象说明空肠弯曲菌与其他致病菌可能存在基因的水平转移等信息交流方式。另外,通过CRISPR结构间隔序列的多样性,可以将38株空肠弯曲菌野生菌株分为5种不同的谱型。研究结果为空肠弯曲菌利用CRISPR结构进行分型和溯源提供数据基础。

志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列的特点及其关联性分析

目的:利用数据库和临床分离的志贺菌菌株分析志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)的特点,探讨CRISPR-Q1的特性及CRISPR间的关联性。方法:根据志贺菌基因组数据库利用引物序列和PCR扩增获得志贺菌的CRISPR序列信息,采用多序列比对等方法获得每个菌株中CRISPR的分布、间隔序列数及序列特点;利用BLAST分析CRISPR-Q1中重复序列和间隔序列,检测重复序列和间隔序列在菌株中的分布特点以及CRISPR-Q1在菌株中的位置及特征;分析数据库和实验室中志贺菌CRISPR-Q1中间隔序列数与CRISPR1或CRISPR2的关系。结果:在数据库107株志贺菌中,106株志贺菌含有CRISPR1或CRISPR2,8株志贺菌的CRISPR1或CRISPR2含有多个间隔序列;106株志贺菌含有CRISPR-Q1,其中有13株志贺菌的CRISPR-Q1中有多个间隔序列。在实验室12株志贺菌中,有6株含有CRISPR1或CRISPR2,12株均含有CRISPR-Q1;CRISPR-Q1间隔序列中的一部分(约35bp)在同一个菌株的染色体基因组上分布广泛,重复序列同样如此,CRISPR-Q1中还存在基因外重复序列(REP)元素。数据库志贺菌中的CRISPR-Q1间隔序列数与CRISPR1和CRISPR2有关联(χ~2=61.6,P<0.01),实验室志贺菌中的CRISPR-Q1间隔序列数与CRISPR1和CRISPR2有关联(P=0.015)。结论:CRISPR-Q1在志贺菌中广泛分布,其序列中存在REP元素;志贺菌的CRISPR1和CRISPR2与CRISPR-Q1有关联。

食源性致病菌耐药性与成簇的规律间隔短回文重复序列系统关联性研究进展

近年来,随着对抗生素的滥用,食源性致病菌的耐药性问题日趋严重。目前除了从管理上规范抗生素的使用,对规律间隔短回文重复序列系统(clusterd regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与耐药性相关研究也在持续进行。CRISPR-Cas作为一种天然免疫机制,因为其独特的免疫作用机理,目前常被用以基因编辑、耐药性等方面研究。本文对CRISPR-Cas系统进行简要介绍,从其结构、原理以及目前的研究趋势对不同菌株间CRISPR系统与耐药性、毒力因素进行相关总结,为防治食源性致病菌引起的食品安全问题提供新思路。

成簇的规律间隔的短回文重复序列/成簇的规律间隔的短回文重复序列关联系统在核酸检测中的应用进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR关联基因(Cas)系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古生菌中的一种后天免疫系统,以消灭外来的质体或者噬菌体,其中CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13系统在核酸检测领域得到应用。该研究简要介绍了CRISPR/Cas系统的分类、作用机制及在核酸检测中的应用。

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术已成为生物医学领域中研究基因功能及其表达调控的重要手段之一。随着CRISPR技术的拓展,各种基于CRISPR技术的新型研究、诊断和治疗等工具得到进一步的开发,并在新型动物疾病模型的建立、疾病快速诊断、肿瘤及免疫相关性疾病的治疗等方面取得了重大进展和突破。我们重点对CRISPR/CRISPR相关蛋白(Cas)技术的发展现状及其在生物医学领域的应用进展进行综述,并对其未来应用前景和发展方向进行讨论和展望。

规律成簇的间隔短回文重复：结构，功能与应用

规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs)是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。最近研究表明,CRISPR与一系列相关蛋白、前导序列一起,为原核生物提供对噬菌体等外源基因的获得性免疫能力,其作用机制可能与真核生物的RNA干扰过程类似。作为基因组中高度可变的区域,CRISPR非常适合成为研究细菌种内分型和微进化的分子靶标。本文综述了CRISPR系统的结构、功能及其应用概况,并对CRISPR研究的前景进行了展望。

基于成簇的规律性间隔的短回文重复序列关联的失活核酸酶9-脱氧核糖核酸甲基转移酶3A基因复合体的O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因启动子区甲基化修饰对胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性影响

目的探讨成簇的规律性间隔的短回文重复序列关联的失活核酸酶9-脱氧核糖核酸甲基转移酶3A基因复合体(CRISPR-dcas9-DNMT3A)介导的O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因(MGMT)基因启动子区域DNA甲基化修饰对胶质瘤细胞替莫唑胺(TMZ)耐药性的影响。方法 CRISPR-dcas9-DNMT3A表达载体通过慢病毒包装感染TMZ耐药细胞系U251-R[U251(中国医学科院基础医学研究所)通过替莫唑胺高浓度反复间歇诱导法诱导产生], 验证其对MGMT启动子区域DNA甲基化程度, MGMT表达水平以及TMZ药物敏感性影响。结果慢病毒感染成功的U251-R细胞, MGMT启动子区域甲基化水平增高[44.7%(17/38)、63.2%(24/38)、77.1%(27/38)比7.9%(3/38), P<0.05], MGMT蛋白表达减少, 细胞对TMZ化疗的敏感性增加(P<0.05)。结论 CRISPR-dcas9-DNMT3A慢病毒感染的U251-R细胞可通过增加其MGMT基因启动子区域甲基化水平减少MGMT蛋白表达从而增加化疗敏感性。

成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术在抗乙型肝炎病毒感染治疗中的应用

缺乏有效根除乙型肝炎病毒（HBV）的药物及技术手段是限制HBV感染无法治愈的瓶颈。成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9系统是近年来新兴的对特定基因位点进行编辑的技术，可以特异性靶向HBV共价闭合环状DNA，有效抑制HBV DNA复制、调控HBV功能蛋白表达，有望成为彻底根除HBV的强有力基因治疗工具。如何利用成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9系统实现对HBV基因组高效靶向修饰，从而达到根治HBV感染的目的已经成为当前国内外学者关注的焦点。现结合国内外最新研究成果，重点总结成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术在抗HBV感染治疗中应用的最新进展，阐述其作为彻底根治HBV感染方案的潜在可能和挑战。

基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的建立

目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后,使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)分别进行酶切;根据松弛环状DNA(rcDNA)和cccDNA的结构差异,设计特异性扩增HBV cccDNA的引物,对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增;并筛选crRNA,建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果利用α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和HBV表面抗原(HBsAg)引物对双重酶切后的产物进行扩增,验证产物中HBV基因组的存在;利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增,验证了产物中只存在HBV cccDNA;利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释,然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测,计算出检测下限为10拷贝/μl。结论本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法,可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测,为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因9系统在干细胞研究中的应用进展

随着对DNA碱基精确识别的核酸酶研究的深入，第3代基因编辑技术，如锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术等发展迅速，由于该类技术能够精确地进行DNA水平的特定位点敲除、插入及替换，加深研究者对生物基因组变化的了解，从而进一步探讨调控生物表型的内源性基因位点，最大限度在体外细胞模型中模拟疾病状态，因此越来越受到研究者的重视。这些技术在真核细胞中的应用也被证实是简便有效且具有位点特异性的，目前已成为实验室的一种常规基因编辑手段。虽然这些技术已进入临床应用阶段，但其脱靶率高、细胞毒性大及基因修饰类型单一等不足也亟待解决。

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因系统的发展及应用研究进展

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因(CRISPR/Cas)系统,作为一种新兴的基因编辑系统,根据Cas蛋白的数量可分为一类系统和二类系统。二类系统中的CRISPR/Cas9仅借助Cas9蛋白和单链向导RNA即可对目标核酸进行切割,是目前应用最为广泛的CRISPR/Cas系统。除了基因编辑在遗传病治疗中的应用,CRISPR/Cas系统衍生出的多种技术在疾病相关基因的筛查、基因表达调控、病原微生物的快速检测和防治等领域也展现了巨大的应用前景。本文就CRISPR/Cas系统的发现历程及其衍生的几个主要技术的应用进行总结,旨在为生命科学领域研究人员提供参考。

志贺菌成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白基因cas1和cas2研究

目的：研究成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白基因cas1和cas2在志贺菌中的分布，并分析cas1和cas2基因突变与细菌耐药的关系。方法采用PCR扩增196株志贺菌cas1和cas2基因。对3株志贺菌（Z23、2003135、2008113）的cas2、cas1（a）和cas1（b）基因进行测序，分析其突变与耐药之间的关系。结果196株志贺菌均检出CRISPR相关蛋白基因cas1和cas2。测序结果显示，cas2的一致性为96.44%，cas1（a）的一致性为97.61%，cas1（b）的一致性为96.97%。菌株2003135的cas1（b）基因有2个突变位点：3177129位点（C→G）及3177126位点（G→C），Z23、2008113对应位置没有突变。药敏结果显示菌株2003135的耐抗生素种类和耐抗生素数目均大于菌株Z23、2008113。结论志贺菌中CRISPR基因广泛存在。cas1（b）基因突变菌株与未突变株比较，耐药性增强。cas1（b）基因突变可能是引起耐药程度不同的原因之一。

应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统核糖核蛋白复合物技术基因修正威尔森氏症的体外研究

目的应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型,设计3个CRISPR来源的RNA(crRNA)-crRNA001/002/003,应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞,48 h后提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率,筛选出效率最高者crRNA001,并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板;用crRNA001和ssODN共转染肝细胞,模板特异性引物行PCR,验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。结果Sanger测序结果显示,crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后,模板特异性引物行PCR,能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带;二代测序结果显示,ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率,相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因,为进一步的体内实验提供理论和实验基础。

规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白系统在传染病病原体核酸检测中的应用

作为新一代的基因编辑技术,规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins,CRISPR/Cas)系统具有强大的基因编辑功能,已被应用于许多领域。目前,已开发的规律成簇的间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,Cas)9、Cas12、Cas13和Cas14检测系统被广泛应用于传染病病原体的核酸检测,具有检测成本低、操作简单、灵敏度高等优点。本研究介绍了CRISPR/Cas系统的发展史、作用机制,以及几种Cas蛋白在传染病相关病原核酸检测中的应用。

一种新的沙门氏菌成簇重复序列的预测方法

目的建立一个新的、直观的鉴定和显示细菌基因组成簇重复序列的方法,了解沙门氏菌基因组成簇重复序列的组成特征。方法直接将细菌的基因组用滑动窗口法切割成重叠片段,每一个片段自体比对,利用Pip Maker生成共线性图。通过共线性图特征识别成簇重复序列区。结果用所设计方案-成簇重复序列预测器(CRpred)对鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株基因组进行扫描,总共鉴定出151个成簇重复区。特征分析表明,这些成簇重复区包含低拷贝简单串联重复、高拷贝简单串联重复、间隔串联重复、反向回文重复和反向间隔重复等5种类型。此外,沙门氏菌基因组中有9个复杂重复区域无法使用上述模式进行归类。结论提出了一个新的、简便直观的基因组成簇重复序列的鉴定方法,为搜寻成簇的、规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、数目可变串联重复序列(VNTR)以及其他重复序列相关研究提供支持。

志贺菌成簇的规律间隔的短回文重复序列系统结构特征的生物信息学分析

利用生物信息学方法探索志贺菌成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统结构的特征。本文通过BLAST、序列比对、RNA二级结构预测等方法对志贺菌CRISPR进行研究。结果显示:志贺菌的4个群中均发现有CRISPR结构,其侧翼上、下游序列可分为相同组群,在leader序列中存在具有回文性质、相对保守的motif;侧翼序列与重复序列具有相同的分组,重复序列有一定的保守性,可以形成以"茎"为主和以"环"为主两类不同的RNA二级结构;间隔序列与质粒或噬菌体有一定的同源性。本研究表明重复序列与侧翼序列间存在相关性,重复序列可能作为一种识别机制来介导外源元素与Cas蛋白间的相互作用。