miR-let-7d-HMGA2通路调控缺氧诱导的类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞增殖

目的 研究缺氧在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)滑膜成纤维样细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)增殖中的作用及机制。方法 采用HE染色法检测RA和对照骨关节炎(osteoarthritis,OA)滑膜组织FLS增生情况。分离原代RA-FLS并采用流式细胞术鉴定;将RA-FLS置于常氧(21%O_(2))或缺氧环境(3%O_(2))中培养,CCK-8法检测细胞增殖水平的变化,RT-PCR检测miR-let-7d表达的变化。通过类似物或抑制物改变miR-let-7d的表达,观察其对RA-FLS增殖、凋亡的影响;探究miR-let-7d靶基因在缺氧诱导的RA-FLS增殖中的作用。结果 FLS在RA滑膜中增生明显,在缺氧环境下RA-FLS增殖加快,miR-let-7d表达水平降低;过表达miR-let-7d抑制RA-FLS增殖,但对细胞凋亡水平无明显影响;进一步的研究证实miR-let-7d靶基因HMGA2参与缺氧诱导的RA-FLS增殖。结论 miR-let-7d-HMGA2通路调控缺氧诱导的RA-FLS增殖。

苗药黑骨藤中咖啡酰基奎宁酸类部位对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞MH7A增殖及炎症因子分泌的影响

目的:研究苗药黑骨藤中咖啡酰基奎宁酸类部位(CADF)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的人类风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞MH7A增殖及炎症因子分泌的影响,探讨CADF抗RA的作用机制。方法:将MH7A细胞分为空白组、TNF-α模型组、甲氨蝶呤组(阳性对照,20 mg/L)和CADF不同质量浓度组(50、100、200、400 mg/L),除空白组外,其余各组均以50μg/L TNF-α刺激活化MH7A细胞。以TNF-α与相应药物的混合液共同作用24 h后,检测细胞的增殖情况和培养液中一氧化氮(NO)、前列腺素E_2(PGE_2)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)的含量。结果:与空白组比较,TNF-α模型组细胞增殖活性显著增强(P<0.01),培养液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量显著增加(P<0.01);与TNF-α模型组比较,各给药组细胞的增殖均受到显著抑制(P<0.05或P<0.01),培养液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量均显著减少(P<0.01),且与CADF具有一定的量效关系。结论:CADF可通过抑制TNF-α诱导的MH7A细胞增殖,减少炎症因子NO、PGE2、IL-1β、IL-6的分泌,从而发挥其抗RA的作用。

大黄素对TNF-α诱导的成纤维样滑膜细胞株MH7A细胞ERK1/2和p38MAPK的影响

目的观察大黄素(emodin)对TNF-α诱导的类风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞ERK1/2和p38MAPK表达的影响,探讨大黄素治疗RA的作用机制。方法将体外培养的RA成纤维样滑膜细胞株MH7A分组培养、空白对照组、模型组(TNF-α,10 ng/ml)、药物组[TNF-α(10 ng/ml)+emodin(20、40、80μmol/L)]。用免疫荧光、Western blot和RT-PCR分别测定细胞中ERK1/2、p38MAPK及mRNA的表达。结果免疫荧光示,TNF-α促进ERK1/2、p38MAPK的表达,大黄素处理后,抑制ERK1/2转核及p38MAPK的表达。模型组中,Western blot和RT-PCR测定ERK1/2、p38MAPK及mRNA表达均明显上调(P0.05);与模型组比较,大黄素各剂量组中,ERK1/2、p38MAPK及mRNA表达明显减少(P<0.05),且具有剂量依赖性。结论抑制ERK1/2和p38MAPK在成纤维样滑膜细胞中的表达是大黄素治疗类风湿性关节炎的作用机制之一。

从NF-κB/Bcl-2信号通路调控成纤维样滑膜细胞凋亡角度探讨中医药抑制类风湿关节炎滑膜炎症机制的研究进展

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎症为主要特征的自身免疫性疾病,成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)的抗凋亡是导致该病病情发展的主要因素。如何促进FLS凋亡并抑制炎症反应是目前RA治疗和研究的重点。核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)/B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)信号通路在RA发病过程中发挥了关键作用,其与FLS炎症倾向、抗凋亡等密切相关。研究并探讨NF-κB/Bcl-2信号通路调控FLS凋亡的机制及作用,介绍中医药靶向该通路促进FLS凋亡进而抑制RA滑膜炎症的研究现状,旨在为中医药治疗RA的研究提供一定基础。

盐酸小檗碱对强直性脊柱炎患者成纤维样滑膜细胞体外增殖和成骨分化的影响

目的:探讨盐酸小檗碱对强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)患者成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)体外增殖和成骨分化的影响。方法:从AS患者的髋关节滑膜组织中分离培养FLS,经免疫荧光染色鉴定后进行后续实验。取第3代FLS,以白细胞介素(interleukin, IL)-17、IL-23预处理,再以0μmol·L^(-1)(空白组)、80μmol·L^(-1)(盐酸小檗碱低剂量组)、120μmol·L^(-1)(盐酸小檗碱中剂量组)、200μmol·L^(-1)(盐酸小檗碱高剂量组)的盐酸小檗碱干预后,采用光学显微镜观察细胞增殖情况,以酶联免疫吸附法检测炎症因子水平和骨稳态调节因子水平,通过茜素红染色观察细胞成骨分化情况。结果:(1)炎症因子水平测定结果。盐酸小檗碱低、中、高剂量组IL-17、IL-23、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平均低于空白组(IL-17:P=0.046,P=0.005,P=0.004;IL-23:P=0.024,P=0.002,P=0.000;IL-6:P=0.012,P=0.000,P=0.000;TNF-α:P=0.012,P=0.004,P=0.001),盐酸小檗碱中、高剂量组IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α水平均低于盐酸小檗碱低剂量组(IL-17:P=0.034,P=0.024;IL-23:P=0.020,P=0.000;IL-6:P=0.000,P=0.000;TNF-α:P=0.012,P=0.002),盐酸小檗碱高剂量组IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α水平均低于盐酸小檗碱中剂量组(IL-17:P=0.029;IL-23:P=0.014;IL-6:P=0.005;TNF-α:P=0.026)。(2)FLS增殖情况观察结果。光学显微镜观察结果显示,与空白组相比,盐酸小檗碱低、中、高剂量组细胞间隙增大、凋亡细胞数量增加,变化程度呈现剂量依赖性。(3)FLS成骨分化情况观察结果。与空白组相比,盐酸小檗碱低、中、高剂量组茜素红染色程度均降低,而且降低程度呈现剂量依赖性。(4)骨稳态调节因子水平测定结果。盐酸小檗碱低、中、高剂量组Dickkopf相关蛋白1(dickkopf-related protein 1,DKK-1)和核因子κB受体激活蛋白配体(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)水平均低于空白组(DKK-1:P=0.048,P=0.032,P=0.001;RANKL:P=0.046,P=0.021,P=0.001),盐酸小檗碱中、高剂量组DKK-1和RANKL水平均低于盐酸小檗碱低剂量组(DKK-1:P=0.028,P=0.002;RANKL:P=0.047,P=0.002),盐酸小檗碱高剂量组DKK-1和RANKL水平均低于盐酸小檗碱中剂量组(DKK-1:P=0.018;RANKL:P=0.011)。结论:盐酸小檗碱能够抑制AS患者FLS体外增殖,并通过减少FLS分泌骨稳态调节因子RANKL和DKK-1抑制FLS成骨分化,而且其作用具有剂量依赖性。

成像流式细胞术和免疫荧光技术检测成纤维样滑膜细胞Ahr入核的比较

目的探究成像流式细胞术和免疫荧光技术检测成纤维样滑膜细胞中Ahr入核的差别。方法用15%的DMEM培养人来源的成纤维样滑膜细胞细胞株MH7A,分别用激光共聚焦显微镜和量化成像流式细胞仪(ImageStreamX MarkⅡ)检测空白对照组、Kyn组和Kyn+CH223191组对MH7A中Ahr的入核水平,并采用非参数检验比较两种检测技术检测结果的相关性。结果与空白对照组相比,免疫荧光技术和成像流式细胞术测得的MH7A细胞中Kyn组和Kyn+CH223191组Ahr入核能力增加(P<0.05),两种实验方法测得的三组结果相关性良好,R 2值分别是0.8638、0.9287和0.9018,差异有统计学意义(P<0.05)。结论相较于免疫荧光技术的操作和结果,成像流式细胞术数据处理比较复杂,但所得结果精确度高,避免了实验者的主观性,减少实验误差。

RAP1B对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞生物学行为的影响研究

目的探讨RAP1B对体外培养的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-1ike synoviocyte,FLS)增殖、迁移以及炎症因子分泌能力的影响。方法通过构建RAP1B过表达及干扰表达的慢病毒载体,转染至人RA成纤维样滑膜细胞(MH7A),分别采用CCK8法、划痕实验、Transwell-迁移实验及ELISA法,对MH7A增殖、迁移及炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8)分泌能力进行检测。结果RAP1B表达上调后,MH7A增殖、迁移及炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8)分泌能力均明显增强(均P<0.01);RAP1B表达下调后,MH7A增殖、迁移及炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8)分泌能力均明显减弱(均P<0.05)。结论RAP1B具有促进RA-FLS增殖、迁移及炎症因子分泌的能力。

芒果苷抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移及炎性因子的表达

背景:芒果苷是一种从芒果叶、树皮、根中提取的双苯吡酮类化合物,前期研究表明芒果苷可以通过NF-κB、JAK/STAT等转录因子的活化发挥抗全身性炎症作用。目的:探讨芒果苷对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells,RA-FLS)增殖、迁移和炎症因子表达的影响及机制。方法:RA-FLS分为空白组、R848(TLR7/8激动剂)刺激组、芒果苷低、中、高浓度组(2,4,8μg/mL)、阳性对照组(Cu-CPT8,TLR8通路抑制剂)。CCK-8法检测不同质量浓度芒果苷对RA-FLS毒性的影响并筛选最终细胞用药质量浓度,细胞克隆形成实验检测RA-FLS的增殖能力,划痕实验及Transwell迁移实验检测RA-FLS的迁移能力,qRT-PCR检测RA-FLS中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA的表达。结果与结论:①与空白组比较,2-10μg/mL的芒果苷干预组对RA-FLS活力有抑制趋势,但差异不显著(P>0.05),说明对RA-FLS的毒性影响很小;②与R848刺激组比较,芒果苷低、中、高浓度组RA-FLS克隆数、划痕愈合率及迁移细胞数均降低(P<0.01);芒果苷中浓度和高浓度组白细胞介素1β、白细胞介素6及肿瘤坏死因子αmRNA的表达降低(P<0.01);③与R848刺激组比较,阳性对照组细胞克隆数、划痕愈合率及迁移细胞数以及白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01);白细胞介素1βmRNA表达水平无明显差异;④结果表明,芒果苷可能通过TLR7/8信号通路抑制RA-FLS增殖、迁移以及炎症因子表达发挥抗类风湿关节炎的作用。

湖北枫杨总黄酮通过调控PI3K/AKT信号通路抑制成纤维细胞样滑膜细胞的迁移和侵袭

目的:观察湖北枫杨总黄酮(PHSTF)对人类风湿成纤维细胞样滑膜细胞(MH7A细胞)迁移和侵袭的抑制作用并初步探讨其可能作用机制。方法:将MH7A细胞分为分为对照组(不做任何处理)、低剂量(6.25 mg/L)PHSTF组、中剂量(12.5 mg/L)PHSTF组、高剂量(25 mg/L)PHSTF组、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激动剂740Y-P(10μmol/L)组和740Y-P(10μmol/L)+高剂量(25 mg/L)PHSTF组。采用CCK-8法检测MH7A细胞活力;划痕实验和Transwell实验检测MH7A细胞的迁移和侵袭;Western blot检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白水平。结果:与对照组相比,各剂量PHSTF组MH7A细胞活力显著降低(P<0.05),划痕愈合面积显著减小(P<0.01),迁移和侵袭至下室的细胞显著减少(P<0.01),MMP-2和MMP-9蛋白表达水平及p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值显著降低(P<0.01)。与高剂量PHSTF组相比,PI3K激动剂740Y-P显著提高了PHSTF处理下MH7A细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01),也使得MMP-2和MMP-9蛋白表达水平及p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值显著升高(P<0.01)。结论:PHSTF能通过调控PI3K/AKT信号通路抑制MH7A细胞迁移和侵袭。

siRNA沉默锌指蛋白A20基因促进人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞焦亡

目的探讨小干扰RNA(siRNA)沉默锌指蛋白A20基因对人类风湿关节炎(RA)成纤维细胞样滑膜细胞(HFLS-RA)焦亡的调节作用。方法培养人HFLS-RA细胞系(MH7A细胞),通过RNA干扰技术靶向敲降人类A20基因,合成siRNA-A20,用脂质体法将siRNA-A20(沉默组)和siRNA-NC(阴性对照组)转染MH7A细胞。RT-qPCR检测细胞中NLRP3和Caspase-1 mRNA的表达;Western blot法检测细胞中NLRP3和Caspase-1蛋白表达;ELISA法检测细胞培养液中IL-1β和IL-18的水平;透射电子显微镜(TEM)检测细胞焦亡。结果siRNA-A20组MH7A细胞中NLRP3和Caspase-1 mRNA和蛋白表达水平与对照组相比均显著增高(P<0.01);siRNA-A20组细胞培养上清液中IL-1β、IL-18浓度与对照组相比均显著增高(P<0.01)。与对照组相比,siRNA-A20组部分细胞肿胀和破裂,细胞膜的完整性也丧失,细胞内出现大面积水肿区,细胞核局部核膜凹陷模糊,异染色质固缩增加,分布不均匀并在核膜周围聚集。结论通过siRNA沉默A20表达后可促进HFLS-RA中NLRP3/Caspase-1介导细胞焦亡,为探讨RA临床治疗新方案提供了实验依据。

独活寄生汤对TNF-α诱导的类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、凋亡和炎症的影响

目的探究独活寄生汤含药血清对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的类风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖、凋亡和炎症的影响及作用机制。方法将MH7A细胞分为正常组(10%空白血清)、模型组(10μg·L^(-1) TNF-α+10%空白血清)、独活寄生汤低(10μg·L^(-1) TNF-α+2.5%含药血清+7.5%空白血清)、中(10μg·L^(-1) TNF-α+5%含药血清+5%空白血清)、高(10μg·L^(-1) TNF-α+10%含药血清)剂量组共5组;MTT法筛选独活寄生汤含药血清给药浓度;EdU染色检测细胞增殖情况;免疫荧光染色检测增殖标志物Ki67表达情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率;ELISA法检测细胞中IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10的含量;RT-qPCR和Western blot检测Bax、Bcl-2、caspase-3及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路mRNA和蛋白的表达情况。结果与正常组比较,模型组细胞增殖水平明显上升,凋亡水平明显减弱,IFN-γ和IL-6的含量升高,IL-4和IL-10的含量减少,TLR4/MyD88/NF-κB信号通路被激活;经独活寄生汤含药血清低、中、高剂量组干预后,均能有效改善细胞异常增殖情况,增强细胞凋亡,抑制炎性反应和TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活。结论独活寄生汤含药血清能够抑制TNF-α诱导的RA-FLS异常增殖和促炎因子的分泌,增强细胞凋亡和抗炎水平,其作用机制可能与调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。

红景天苷调控miR-20a-5p/TIMP2轴对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和迁移的影响

目的探讨红景天苷调控miR-20a-5p/金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP2)轴对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(HFLS-RA)功能和活化的影响。方法以HFLS-RA细胞为研究对象,将HFLS-RA细胞分为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)组、对照组、红景天苷组、miR-20a-5p抑制物阴性对照(inhibitor NC)组、miR-20a-5p抑制物组、红景天苷+miR-20a-5p模拟物阴性对照(mimic NC)组、红景天苷+miR-20a-5p模拟物组。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测HFLS-RA细胞中miR-20a-5p表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HFLS-RA细胞上清液中白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平;细胞计数试剂盒8(CCK-8)法、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)染色检测HFLS-RA细胞增殖;划痕实验检测HFLS-RA细胞迁移;免疫印迹实验(Western blot)检测HFLS-RA细胞中TIMP2、细胞周期素D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶(MMP)-9蛋白表达;双荧光素酶验证miR-20a-5p与TIMP2的关系。结果与对照组比较,TNF-α组miR-20a-5p表达、IL-1β、IL-6水平、吸光度(OD_(450))值、EdU阳性细胞率、划痕愈合率及CyclinD1、MMP-9蛋白上调,TIMP2蛋白下调(P<0.05);与TNF-α组相比,红景天苷组miR-20a-5p表达、IL-1β、IL-6水平、OD_(450)值、EdU阳性细胞率、划痕愈合率及CyclinD1、MMP-9蛋白下调,TIMP2蛋白上调(P<0.05);与inhibitor NC组、TNF-α组相比比较,miR-20a-5p抑制物组miR-20a-5p表达、IL-1β、IL-6水平、OD_(450)值、EdU阳性细胞率、划痕愈合率及CyclinD1、MMP-9蛋白下调,TIMP2蛋白上调(P<0.05);与红景天苷+mimic NC组、红景天苷组相比,红景天苷+miR-20a-5p模拟物组miR-20a-5p表达、IL-1β、IL-6水平、OD_(450)值、EdU阳性细胞率、划痕愈合率及CyclinD1、MMP-9蛋白表达升高,TIMP2蛋白表达降低(P<0.05)。miR-20a-5p与TIMP2存在靶向调控关系。结论红景天苷可能通过调控miR-20a-5p/TIMP2抑制TNF-α诱导的HFLS-RA细胞增殖、迁移及炎症反应。

兔膝骨关节炎成纤维样滑膜细胞分离培养方法的研究

目的在传统细胞组织块培养方法的基础上进行改进,建立一种简单、可重复性操作的兔膝骨关节炎成纤维样滑膜细胞分离培养方法。方法通过手术诱导建立兔膝骨关节炎模型,在无菌条件下,快速取出兔膝骨关节炎的滑膜组织,经过冲洗处理后剪成一定大小碎片,用无菌滤纸吸净组织上附着的水分,接种在培养皿后,进行观察、换液、传代、拍照。将原代培养的细胞传至第三代细胞接种于96孔板中,采用噻唑蓝(MTT)法分别在不同时间梯度检测各孔对应吸光度,制作生长曲线;采用免疫荧光染色法观察细胞中波形蛋白的表达情况。结果培养的细胞为典型的梭形,符合成纤维样滑膜细胞的生长形态特征,免疫荧光染色显示波形蛋白强表达。结论改进后的组织块培养方法简单、操作可重复性强,可以获得大量兔膝骨关节炎成纤维样滑膜细胞,为后续膝骨关节炎的机理研究提供了大量细胞支持。

5, 7, 3′-三乙酰橙皮素对AA大鼠成纤维样滑膜细胞Jak2/Stat3信号通路及凋亡相关蛋白的影响

目的研究5,7,3'-三乙酰橙皮素(5,7,3'-triacetylhesperetin,TAHP)对佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)Jak2/Stat3信号通路及凋亡相关蛋白的影响。方法用弗氏完全佐剂诱导大鼠AA模型;MTT法检测FLS的增殖反应;Hoechst 33258染色法检测FLS的凋亡;RT-PCR法检测FLS中Jak2、Stat3、Bcl-2、Bax及Caspase-3的基因表达;Western blot法检测FLS中p-Stat3及Caspase-3的蛋白表达情况。结果 TAHP呈剂量和时间依赖性抑制FLS的增殖(P<0.05);Hoechst 33258染色结果提示TAHP可以明显地促进FLS的凋亡;同时TAHP(50,250μmol·L-1)可以明显降低Jak2、Stat3及Bcl-2表达,而上调Bax及Caspase-3表达。Western blot结果显示,TAHP可降低p-Stat3的表达、上调Caspase-3表达。结论 TAHP可以抑制FLS增殖,其作用机制可能与抑制FLS Jak2/Stat3信号通路、促进Bax及Caspase-3表达、抑制Bcl-2的表达有关。

白细胞介素-17对老年类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞增殖和趋化因子分泌的影响及作用机制

目的探讨白细胞介素(IL)-17对老年类风湿关节炎(RA)患者成纤维样滑膜细胞增殖和趋化因子分泌的影响及作用机制。方法选取行关节置管术的老年RA患者,从术中切除的新鲜滑膜组织中分离滑膜成纤维细胞进行培养。3-(4,5-二甲噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测IL-17对细胞增殖的影响;蛋白芯片试剂盒检测滑膜成纤维细胞上清液趋化因子[中性粒细胞激活肽(ENA)-78、IL-8、生长相关癌基因(GRO)、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1]的水平;流式细胞术检测滑膜成纤维细胞表面IL-17受体(IL-17R)的表达。在成纤维样滑膜细胞中分别加入MEK1/2信号通路抑制剂(PD98059)、核转录因子(NF)-κB信号通路抑制剂(LY294002)、STAT3信号通路抑制剂(AG490)、RANKL信号通路抑制剂(小白菊内酯),孵育60 min后加IL-17刺激72 h,荧光定量PCR法检测ENA-78、IL-8、GRO、MCP-1 mRNA表达水平。结果 IL-17对滑膜成纤维细胞各时间点刺激指数差异均有统计学意义(P<0.05),其中刺激72 h滑膜成纤维细胞增殖能力最强。IL-17刺激滑膜成纤维细胞48 h后,滑膜成纤维细胞分泌的ENA-78、IL-8、GRO、MCP-1水平均明显高于对照组(P<0.05)。流式细胞术显示,加入抗IL-17R抗体组IL-17R表达水平明显高于同型对照组(P<0.05)。滴加PD98059、LY294002、AG490后,ENA-78、IL-8、GRO、MCP-1 mRNA表达量均明显低于空白对照组(P<0.05);而滴加小白菊内酯后与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IL-17可促进老年RA成纤维样滑膜细胞增殖及趋化因子表达;IL-17可能通过MEK1/2、NF-κB、STAT3信号通路诱导滑膜成纤维细胞趋化因子表达。

调控类风湿关节炎PBMC中miR-142-3p的表达对ADAM17表达及成纤维样滑膜细胞活性的影响

目的:探讨类风湿关节炎(RA)外周血单个核细胞(PBMC)中微小RNA-142-3p(miR-142-3p)的表达对RA成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖和凋亡的影响。方法:采用生物信息学预测和双荧光素酶报告实验分析miR-142-3p和解聚素金属蛋白酶17(ADAM17)的靶向关系。分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测人正常PBMC和RA-PBMC中miR-142-3p和ADAM17蛋白的表达。利用miR-142-3p模拟物或抑制物转染调控RA-PBMC中miR-142-3p的表达,观察低表达miR-142-3p,及过表达ADAM17和miR-142-3p的RA-PBMC对RA-FLS增殖和凋亡的影响。RA-FLS增殖的检测采用MTT法,RA-FLS凋亡的检测采用Annexin V-FITC和PI双染法。结果:ADAM17和miR-142-3p存在靶向关系。与正常PBMC相比,RA-PBMC中miR-142-3p表达上调,ADAM17蛋白表达下调(P<0.05)。低表达miR-142-3p的RA-PBMC和过表达ADAM17的RA-PBMC均可增强RA-FLS增殖活性,减少其凋亡(P<0.05)。过表达miR-142-3p的RA-PBMC可降低RA-FLS的增殖活性,促进其凋亡(P<0.05)。过表达ADAM17和过表达miR-142-3p的作用可以相互拮抗(P<0.05)。结论:调控RA-PBMC中miR-142-3p的表达可以通过调控ADAM17而影响RA-FLS的增殖和凋亡。

异绿原酸A抑制TNF-α引起的MH7A人成纤维细胞样滑膜细胞的增殖和迁移并促进其凋亡

目的研究异绿原酸A对MH7A人成纤维细胞样滑膜细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。方法20μg/L肿瘤坏死因子α(TNF-α)体外诱导MH7A细胞后,加入(0、0.04、0.09、0.13、0.16、0.20)μg/μL异绿原酸A处理。采用CCK-8法检测MH7A细胞增殖、TranswellTM小室法检测细胞侵袭和迁移能力,试剂盒检测MH7A细胞胱天蛋白酶3(caspase-3)、活性氧(ROS)、基质金属蛋白酶3(MMP3)的含量,免疫荧光细胞化学染色分别检测MH7A细胞BAX和Bcl2表达。结果20μg/L TNF-α处理明显增加MH7A细胞增殖、侵袭和迁移,减少细胞凋亡。与TNF-α体外诱导相比,异绿原酸A能明显抑制MH7A细胞增殖、侵袭、迁移及MMP3分泌,增加ROS的释放,促进MH7A细胞凋亡。结论异绿原酸A抑制MH7A人成纤维细胞样滑膜细胞增殖、侵袭、迁移并促进其凋亡。

雷公藤多苷对类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞α7nAChR及炎症因子的作用

目的 :观察雷公藤多苷对类风湿关节炎(RA)患者成纤维样滑膜细胞α7 N型乙酰胆碱受体(α7nAChR)及炎症因子的作用。方法:取行膝关节置换术的RA患者的关节滑膜组织6例,采用酶消化法进行分离培养成成纤维样滑膜细胞(FLS),采用HE染色、免疫组化法鉴定FLS。分为模型组、激动剂组、抑制剂组、西药组、雷公藤多苷组,分别用生理盐水、PNU-282987、α-银环蛇毒素、甲氨蝶呤、雷公藤多苷进行药物干预。结果:①α7nAChR的mRNA表达:与模型组、抑制剂组比较,雷公藤多苷组α7nAChR mRNA表达的差异均有统计学意义(P<0.05)。雷公藤多苷组较激动剂组α7nAChR mRNA的表达减少,差异有统计学意义(P<0.05),雷公藤组较西药组α7nAChR mRNA的表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。②α7nAChR、NF-κBp65、p-STAT3蛋白表达:与模型组、抑制剂组比较,雷公藤多苷组α7nAChR表达均增多,NF-κBp65表达减少;p-STAT3表达均减少,差异均有统计学意义(P<0.05);雷公藤多苷组较激动剂组p-STAT3表达减少,差异有统计学意义(P<0.05);雷公藤多苷组较西药组α7nAChR表达增多,差异有统计学意义(P<0.05)。③炎症因子:雷公藤多苷组IL-17、HMGB1含量较模型组均降低,差异有统计学意义(P<0.05);雷公藤多苷IL-17较激动剂组均升高,差异有统计学意义(P<0.01),较抑制剂组降低(P<0.05);雷公藤多苷组HMGB1水平较抑制剂明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:雷公藤多苷可能通过促进α7nAChR的表达,激活胆碱能抗炎通路,抑制NF-κB信号通路活化及炎症因子的生成,干预RA滑膜炎的发生。

lncRNA SNHG16通过miR-182-5p/PPARG轴调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和侵袭

目的:确定小核仁RNA宿主基因16(SNHG16)在类风湿关节炎(RA)患者成纤维样滑膜细胞(FLS)中的表达及其在RA发展中的作用。方法:RT-qPCR用于测量SNHG16、miR-182-5p和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARG) mRNA表达;双荧光素酶实验用于检测SNHG16、miR-182-5p和PPARG mRNA的相互作用关系;EdU和Transwell用于检测细胞增殖、侵袭;Western blot用于检测PPARG蛋白水平。结果:RA滑膜组织和人RA-FLS系(HFLS-RA)中SNHG16和PPARG mRNA表达上调,miR-182-5p表达下调。SNHG16负靶向调节miR-182-5p表达,正调节PPARG(miR-182-5p靶标)表达。沉默SNHG16抑制HFLS-RA增殖、侵袭;下调miR-182-5p部分逆转SNHG16沉默对细胞增殖、侵袭的抑制作用;过表达PPARG部分逆转miR-182-5p上调对HFLS-RA增殖、侵袭的抑制作用。结论:沉默SNHG16靶向miR-182-5p/PPARG轴抑制HFLS-RA的增殖、侵袭。

抑制LINC00667表达对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的探究长链非编码RNA(LncRNA)LINC00667对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)增殖、迁移、侵袭的影响及其机制。方法复制类风湿关节炎(RA)模型大鼠,SPF级Wistar大鼠分离踝关节滑膜组织,用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测RA-FLS中LINC00667和miR-19a-3p的表达。在RA-FLS中分别转染si-NC(si-NC组)、si-LINC00667(si-LINC00667组)、miR-NC(miR-NC组)、miR-19a-3p模拟物(miR-19a-3p组)、si-LINC00667与anti-miR-NC(si-LINC00667+anti-miR-NC组)、si-LINC00667与anti-miR-19a-3p(si-LINC00667+anti-miR-19a-3p组)。CCK-8法检测各组转染后RA-FLS的增殖抑制率。Transwell法检测RA-FLS迁移、侵袭。Westernblotting检测E钙黏蛋白(Ecadherin)、N钙黏蛋白(N-cadherin)表达。双萤光素酶报告验证LINC00667和miR-19a-3p的靶向关系。结果RA模型组滑膜组织中LINC00667表达量约为正常组的270%,miR-19a-3p表达量约为正常组的36%(P<0.05)。转染成功后,si-LINC00667组RA-FLS的增殖抑制率、E-cadherin蛋白相对表达量高于si-NC组(P<0.05),si-LINC00667组迁移、侵袭细胞数、N-cadherin蛋白相对表达量低于si-NC组(P<0.05)。LINC00667靶向miR-19a-3p,miR-19a-3p组RA-FLS的增殖抑制率、E-cadherin蛋白相对表达量高于miR-NC组(P<0.05),miR-19a-3p组迁移、侵袭细胞数、N-cadherin蛋白相对表达量低于miR-NC组(P<0.05)。si-LINC00667+anti-miR-19a-3p组RA-FLS的增殖抑制率、E-cadherin蛋白相对表达量低于si-LINC00667+anti-miR-NC组(P<0.05),si-LINC00667+anti-miR-19a-3p组迁移、侵袭细胞数、Ncadherin蛋白相对表达量高于si-LINC00667+anti-miR-NC组(P<0.05)。结论抑制miR-19a-3p通过靶向LINC00667,抑制RA-FLS的增殖、迁移、侵袭,LINC00667或可用作诊断和治疗RA的靶点。