成纤维细胞激活蛋白载体的构建及表达

目的建立成纤维细胞激活蛋白(FAP)表达系统,以获得完整蛋白。方法采用RT-PCR方法,自人新鲜胃癌组织中扩增FAP-cDNA,同时将FAP-cDNA克隆到pMD18-T中,表达正确后,再定向插入真核表达载体pQE30中,转化大肠埃希菌JM109,经异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果测定FAP-cDNA序列与GeneBank(基因库)中的FAP序列相同;构建出重组表达载体pQE30-FAP;转化大肠埃希菌JM109,并获得完整蛋白,经验证为诱导后的表达蛋白。结论成功构建pQE30-FAP表达载体,Western-Blotting验证为完整蛋白,为进一步获得抗FAP抗体奠定了基础。

p38丝裂原激活蛋白阻断剂对机械压力诱导人牙周膜成纤维细胞表达白介素-6的影响

目的分析p38丝裂原激活蛋白(MAPK)在压力诱导人牙周膜成纤维细胞(HPLF)合成炎症因子白介素(IL)-6过程中所起的作用。方法以p38MAPK阻断剂SB203580对HPLF预处理60min,然后用酶联免疫吸附法检测HPLF受200kPa压力刺激后培养上清内IL-6蛋白水平,比较预处理组与对照组2之间IL-6含量的差异。结果加压后16和24h两时间点加力组均较对照组1IL-6表达量显著增高;而预处理组较对照组2IL-6表达量下降。结论p38MAPK是机械压力诱导HPLF产生IL-6的重要环节。

成纤维细胞激活蛋白在大鼠烫伤创面修复过程中的动态表达

目的观测成纤维细胞激活蛋白(FAP)在大鼠不同深度烫伤创面修复过程中的动态表达特点。方法制作大鼠浅Ⅱ°和深Ⅱ°两组烫伤模型(每组42只),每组在伤后6、12 h,1、3、7、14、21 d各处死6只大鼠,另设6只正常大鼠皮肤作为对照。免疫组织化学和免疫印迹技术观测创面组织FAP的含量。结果 FAP在创面成纤维细胞的细胞膜和细胞质表达,尤其是创面新生血管周围。烫伤后6 h FAP表达明显增多。浅Ⅱ°创面6 h与12 h,1 d与3 d比较,FAP的表达差异无统计学意义(P>0.05),余各时间点与相邻时间点比较差异均有统计学意义(P<0.05)。深Ⅱ°创面12 h与1 d,1 d和3 d比较,FAP的表达差异无统计学意义(P>0.05),余各时间点与相邻时间点比较差异均有统计学意义(P<0.05)。两组创面FAP表达的高峰均出现在烫伤后第7天,之后逐渐下降,至伤后第21天FAP的表达量仍高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 FAP的动态表达特点提示它在创面修复过程中起重要作用。

成纤维细胞激活蛋白及其突变体真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建并鉴定人成纤维细胞激活蛋白（FAPα）真核表达质粒pc DNA-w FAPα（野生型FAPα）、pc DNA-t FAPα（胞外段FAPα）和pc DNA-m FAPα（缺失624~704位氨基酸的突变型FAPα）。方法 以口腔癌组织总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增w FAPαc DNA基因片段,连接至真核表达质粒pc DNA3.1（＋）获得重组pc DNA-w FAPα质粒。以重组pc DNA-w FAPα为模板,扩增t FAPα基因片段;用overlap PCR技术,获得m FAPα基因;分别连接至pc DNA3.1（＋）获得重组pc DNA-t FAPα和pc DNA-m FAPα质粒。结果 酶切鉴定和测序验证皆显示pc DNA-w FAPα、pc DNA-t FAPα和pc DNA-m FAPα为正确重组质粒。结论 成功构建人野生型FAPα（w FAPα）、胞外段FAPα（t FAPα）和突变型FAPα（m FAPα）真核表达质粒,为进一步研究FAPα在口腔鳞癌发病过程中的分子机制奠定基础。

稳定过表达成纤维细胞激活蛋白的口腔鳞状细胞癌细胞株的构建

目的构建人成纤维细胞激活蛋白(FAP)过表达慢病毒载体,转染口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞株SCC9,构建稳定过表达FAP的OSCC细胞株。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术获得FAP片段,利用基因重组技术构建过表达FAP的慢病毒载体,包埋病毒并收集上清液感染SCC9细胞株,通过流式细胞荧光分选技术(FACS)进行筛选,获得稳定过表达FAP的SCC9细胞株。结果对阳性克隆进行酶切鉴定和基因测序证明FAP的慢病毒载体构建成功,实时荧光定量PCR和Western blot检测结果证明成功构建稳定过表达FAP的SCC9细胞株。结论本研究有助于获得纯化FAP蛋白,为进一步研究FAP在OSCC发生发展过程中的机制奠定基础。

成纤维细胞生长因子受体3在牙源性肿瘤中的表达

目的:探讨成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)在牙源性肿瘤中的表达状况。方法:采用免疫组化方法,检测FGFR3在正常牙囊或残余牙板上皮和牙源性造釉细胞瘤、角化囊肿及始基囊肿中的表达。结果:FGFR3在造釉细胞瘤、角化囊肿及始基囊肿中呈阳性表达,表达率分别为59%、45%、8%,三者表达差异有显著性。FGFR3在正常牙囊或残余牙板上皮中呈阴性表达。FGFR3阳性细胞集中在肿瘤的细胞成熟区。结论:FGFR3可能与造釉细胞瘤、角化囊肿的发病机制及终末分化机制有关。

成纤维激活蛋白α在不同实体瘤组织的表达及其与病理分级和淋巴结转移的相关性

目的观察人实体瘤组织成纤维激活蛋白α(FAPα)蛋白表达与肿瘤发生发展的关系。方法收集55例经手术切除的不同来源实体瘤组织和10例良性肿瘤组织病理标本,用免疫组织化学方法检测其中FAPα的表达,分析其与临床病例参数的关系并比较2种肿瘤组织的差异。结果实体瘤组织与良性肿瘤的FAPα表达率差异有统计学意义(P<0.001);组织中有无淋巴结转移对FAPα强阳性表达差异有统计学意义(P<0.05);病理分级的级别越高,肿瘤组织中FAPα的表达越强(I级vs IV级,P<0.05);不同临床分期的肿瘤组织中FAPα表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 FAPα在乳腺癌等多种实体瘤组织中存在阳性表达,且其表达水平与病例的病理分级及淋巴结转移密切相关。

小鼠成纤维细胞激活蛋白α二肽基肽酶核心序列原核表达与纯化及复性

目的:构建小鼠成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)二肽基肽酶催化核心序列(FAPαc)的高效原核表达载体,进行该序列的原核表达、纯化和复性,为下一步高效抗体制作和以FAPα为靶标的抗肿瘤疫苗研发提供实验基础。方法:用PCR技术,从质粒pSecTag2/Hy-groB-FAPα中扩增出编码FAPα二肽基肽酶催化核心区域的基因片段,与原核表达载体pET28α(+)连接,在BL21(DE3)工程菌中实现重组蛋白His6-FAPαc的表达,并进行纯化和复性。结果:成功构建了小鼠来源的FAPα二肽基肽酶催化核心区域的原核表达质粒,通过对转化该质粒后的感受态细菌进行菌液PCR鉴定以及对该质粒进行BamHI和XhoI双酶切鉴定,鉴定结果与预期结果完全一致;实现了对该质粒编码的融合蛋白His6-FAPαc的表达,表达后的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,表达产量占菌体总蛋白>70%;纯化了该融合蛋白,纯化后的蛋白纯度通过灰度分析>99%;对该融合蛋白进行了复性,复性后该融合蛋白由不溶的包涵体状态变为可溶的水溶状态。结论:成功表达、纯化和复性了FAPα二肽酶催化核心区域FAPαc,为深入开展FAPα的研究奠定基础。

成纤维细胞激活蛋白在胃癌间质中的表达及其意义

成纤维细胞激活蛋白（firoblast activation protein,FAP）是存在于活化的成纤维细胞上的一种蛋白,研究证实能够降解二肽和Ⅰ型胶原,与肿瘤的侵袭和转移有密切关系.本研究分析胃癌肿瘤间质中的FAP的表达,探讨其在不同组织类型中的差异及其在不同侵袭深度时的表达情况.

bFGF、αⅤβ3和NFκB在hOEC中的表达及其与血管生成关系的研究

目的:研究碱性成纤维生长因子(bFGF)、整合素αⅤβ3和核因子κB(NFκB)在人卵巢上皮性癌(OEC)组织中的表达及其与血管生成的关系·方法:原发性人卵巢上皮癌(hOEC)36份、卵巢良性肿瘤及正常卵巢15份,应用免疫组化方法(ABC法)检测bFGF、整合素(integrin)αⅤβ3、NFκB、微血管密度(microvesseldensity,MVD)在OEC、卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织中的表达及其与临床病理特征的关系.结果:bFGF、αⅤβ3、NFκB和MVD在各种组织中的表达,36份OEC中的阳性表达率分别为66·67%、66·67%、72·22%和(43·98±33·73),在良性肿瘤组织中的表达率分别20·00%、6·67%、26·67%和(13·08±9·07);在正常卵巢组织的表达率分别为0·00%、0·00%、13·33%和(7·10±5·42),OEC组各指标的阳性率均显著高于良性卵巢肿瘤组及正常对照组(P<0·05).OEC中bFGF、αⅤβ3、NFκB、MVD随着肿瘤分化程度的降低、FIGO分期的增加、肿瘤转移范围扩大,各指标的表达均逐步增高(P<0·05).OEC中bFGF、αⅤβ3、NFκB与MVD的表达的相关系数分别为0·69、0·67、0·62、各指标与MVD均显著相关(P<0·01).NFκB阳性表达者bFGF、αⅤβ3的阳性表达率分别为92·86%和85·71%,显著高于NFκB阴性表达者bFGF、αⅤβ325%的表达率(P<0·05).结论:bFGF,αⅤβ3,NFκB在OEC中的表达显著增高,与OEC血管生成密切相关.bFGF、αⅤβ3在OEC中的表达与NFκB表达呈正相关,NFκB可能通过对bFGF、αⅤβ3的正向调节作用,进而影响OEC血管生成.

富含T细胞表位的肿瘤成纤维细胞激活蛋白片段克隆表达及纯化

目的：表达并纯化富含T细胞表位的肿瘤成纤维细胞激活蛋白（fibroblas tactivation protein，FAP）片段。方法：利用T细胞表位预测软件及酶切位点预测软件分析FAP全长，选取FAP蛋白内富含T细胞表位又缺少酶切位点的多肽AA264～AA449（NP-032012．1）作为目的表达片段。该多肽所对应的核酸片段为mRNA798～1418（GenBank：BC019190．1）。利用PCR技术从含有FAP基因全长的质粒pCDNA3．1-FAP中扩增目的基因mRNA798～1418，并将该基因与原核表达载体pET-28a（＋）连接，在BL21工程菌中实现重组蛋白His6-FAP的表达，并利用His标签进行纯化。结果：成功构建了富含T细胞表位的FAP原核表达质粒pET-28a（＋）-FAP对该质粒进行BamHl／Xhol双酶切鉴定，鉴定结果与预期完全一致；实现了对该质粒编码的融合蛋白His6-FAP2的表达，表达后的融合蛋白主要以包涵体的形式存在；利用His标签纯化了该融合蛋白，纯化后灰度分析其纯度达95％。结论：成功表达并纯化了富舍细胞表位的FAP片段，为下一步以FAP为靶标的肿瘤免疫治疗策略提供了实验基础。

紫草油对创面组织修复及bFGF mRNA表达的影响

目的通过观察创面组织碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)mRNA的表达和创面愈合率,探讨紫草油促进创面愈合的分子生物学机制。方法对住院患者的皮肤创面用紫草油治疗为观察组,对照组用凡士林纱布治疗,观察两组的创面愈合率。用RT-PCR方法观察两组创面组织的bFGF mRNA表达。结果两组创面组织均存在内源性bFGF mRNA基因表达,观察组创面组织bFGF基因表达在各个时段均明显超过对照组,灰密度值比较,差异有显著性(P<0·05);创面愈合率与创面组织中bFGF mRNA基因表达程度相平行,而观察组的创面愈合率明显高于对照组(P<0·05)。在创面愈合的不同阶段中,作为内参的磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因都有表达,并且各时段GAPDH基因表达量无显著变化(P>0·05)。结论紫草油对创面组织中bFGF有明显的促进作用,这可能是紫草油提高创面愈合率的机理之一。

葡萄糖转运蛋白1在卵巢上皮性癌组织中的表达及其与碱性成纤维生长因子、增殖细胞核抗原表达的关系

目的探讨卵巢上皮性癌组织中葡萄糖转运蛋白1(GLUT1 )的表达及其与碱性成纤维生长因子(bFGF)、增殖细胞核抗原(PCNA)表达的关系。方法采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶连接法(SP法)检测6例正常卵巢、20例卵巢良性肿瘤、7例卵巢交界性肿瘤和44例卵巢上皮性癌组织中GLUT1、bFGF、PCNA的表达,并对GLUT1 与bFGF、PCNA表达的关系进行了相关性分析。结果GLUT1 在正常卵巢、卵巢良性肿瘤组织中不表达,而在卵巢交界性肿瘤及卵巢上皮性癌组织中阳性表达率分别为6 /7、91% (40 /44),卵巢上皮性癌组织中GLUT1 的阳性表达率明显高于卵巢交界性肿瘤组织(P<0 05)。卵巢上皮性癌组织中GLUT1 的阳性表达率与病理分级、手术病理分期、远处转移、淋巴结转移均呈明显正相关(P<0 01),而与病理类型无关(P=0 513)。在卵巢上皮性癌组织中,bFGF阳性表达25例,其中3例GLUT1 染色强度为( ++)、22例( +++);阴性表达19例,其中4例GLUT1 染色强度为( -)、4例( +)、8例( ++)、3例( +++),bFGF阳性表达者GLUT1 染色强度高于bFGF阴性表达者,差异有统计学意义(P<0 01)。GLUT1 染色强度与PCNA标记指数相关,GLUT1 染色强度为( +)、( ++)、( +++)的卵巢上皮性癌组织的PCNA标记指数分别为0 40、0 43、0 69,GLUT1 染色强度为( +++)

甘草酸单铵配伍复方丹参注射液对大鼠盆腔粘连及组织生长因子的影响

目的观察甘草酸单铵盐(MAG,monoammoniumglycyrrhetate)配伍复方丹参注射液对大鼠子宫角粘连的预防作用及其作用机理。方法制备大鼠宫角粘连模型,观察粘连评分,测定粘连组织中血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)的阳性表达率。结果除复方丹参组外,各用药组均明显降低粘连评分和严重粘连百分率。与MAG组比较,MAG+复方丹参组、Dex组严重粘连百分率更低。与粘连组比较,MAG组、复方丹参组、MAG+复方丹参组、Dex组的VEGF、bFGF阳性细胞百分率均显著降低。结论MAG、MAG配伍复方丹参可显著减少大鼠盆腔粘连的形成,尤以MAG配伍复方丹参组显著,二者可能具有协同作用,对粘连形成中晚期血管及纤维组织增生具有抑制作用可能是其作用机理之一。

真皮模板对大鼠创面组织生物力学顺应性的影响

目的 探讨真皮模板对创伤修复过程中创面皮肤组织生物力学顺应性的影响。方法将144只SD大鼠造成全层皮肤组织缺损,根据是否行自体皮移植及移植皮厚度随机分为开放创面组(创面不植皮,包扎后自然愈合)、全厚皮组(创面移植自体全厚皮)、刃厚皮组(创面移植自体刃厚皮)、复合移植组(创面移植脱细胞真皮基质+自体刃厚皮),每组每时相点6只大鼠。分别于术后1、2、4、6、12、20周取创面组织标本,用Instron生物力学测定仪测定各组创面组织的生物力学顺应性;用亲和素生物素复合物(ABC)法检测各组真皮成纤维细胞中α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的表达量。结果 术后4—20周复合移植组创面组织的力学顺应性优于开放创面组和刃厚皮组(P<0 .05), 较全厚皮组差(P<0 .05).术后4周复合移植组αSMA的阳性表达率为(7. 53±0. 98)%,低于开放创面组(26. 99±2. 90)%和刃厚皮组[ (12. 18±2. 79)%,P<0 .01], 高于全厚皮组。 结论 真皮模板可改善组织的力学顺应性, 这可能是其影响创面愈合过程中瘢痕形成、改善愈合质量的机制之一。

高强度聚焦超声对黑色素瘤小鼠局部肿瘤血管生长因子的影响

目的 检测黑色素瘤瘤小鼠高强度聚焦超声(HIFU)治疗前后局部(靶区及边缘)血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF) β1和TGF α等血管生长因子的表达,探讨HIFU治疗对局部肿瘤血管生长因子的影响。方法 采用B16黑色素瘤动物模型,实验分3组,即HIFU组、手术组和假照组。于治疗后第3天取各组靶区肿瘤组织(手术组除外)及边缘皮肤组织。采用免疫组织化学法检测VEGF、bFGF、TGF β1、TGF α的表达。结果 假照组靶区肿瘤组织VEGF、bFGF、TGF β1、TGF α表达阳性率分别为80 .0 %、5 0 .0 %、65 .0 %、80 .0 % ,而HIFU组为阴性表达;假照组边缘皮肤组织为阴性表达,而手术组及HIFU组边缘皮肤组织的上述4种血管生长因子的阳性表达率均为10 0 % ,两组差异无统计学意义(P >0 .0 5 )。结论 HIFU治疗能够破坏VEGF、bFGF、TGF β1、TGF α等血管生长因子在肿瘤组织中的表达。