成纤维细胞活化蛋白高表达致结肠癌预后不良的潜在机制分析

目的分析成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)基因在结肠癌中的表达情况,并探究其表达与结肠癌患者预后的相关性及潜在机制,为结肠癌的发病机制、诊断、治疗及预后提供新思路。方法下载基因表达综合数据库和癌症基因组图谱数据库中结肠癌组织样本和癌旁正常组织样本的表达数据,分析FAP基因在结肠癌组织样本和癌旁正常组织样本中的表达情况。对Kaplan-Meier plotter数据库中结肠癌患者的生存资料进行生存分析,探究FAP基因表达与患者总生存率的相关性。使用GEPIA2数据库分析FAP基因在结肠癌患者中的表达及其对预后的作用。下载基因表达综合数据库和癌症基因组图谱数据库中结肠癌的临床相关数据,分析FAP基因在不同临床分期中的表达情况。通过基因集富集分析探索FAP基因与结肠癌发生、发展相关的分子作用通路。免疫相关性分析(CIBERSORT)用于探索FAP基因与免疫细胞浸润、免疫检查点表达的相关性。结果FAP基因在结肠癌组织中的表达较癌旁正常组织上调(P<0.05)。结肠癌患者中FAP基因的表达水平在不同分期之间存在差异(P<0.05)。生存分析结果显示,高表达FAP基因患者的总生存率低于低表达FAP基因患者(P<0.05)。FAP基因通过多种通路影响结肠癌的发生发展。在结肠癌中,FAP基因与CD4^(+)记忆T细胞、浆细胞的浸润水平呈负相关,与常见免疫检查点表达呈正相关。结论FAP基因在结肠癌中高表达,与患者不良预后显著相关。此外,FAP基因可通过多种细胞功能、化学通路以及免疫浸润等方式促进肿瘤的进展,是治疗结肠癌的潜在靶点。

辐射诱导成纤维细胞FAP表达对放射治疗后瘢痕复发的影响

目的探讨成纤维细胞活化蛋白(FAP)的变化水平对电子线照射后瘢痕疙瘩复发的作用,并阐明其相关作用机制。方法将8例患者瘢痕疙瘩术后组织处理成边长为3 mm的正方体组织块,移植到NCG小鼠双侧背部,建立瘢痕疙瘩异种移植模型。照射组为移植后1周,对右侧移植物给予10 Gy电子线照射,左侧为未照射组,观察4周;通过分子生物学和免疫组织化学分析其电子线照射前后的波形蛋白(Vimentin)和FAP的表达水平,对比移植物照射后的血管变化。通过照射前后转录组测序结果,推测FAP对辐射后瘢痕疙瘩复发的作用机制,并分离原代成纤维细胞,进行体外试验加以验证。结果小鼠移植物免疫组织化学检测结果显示,与未照射组比较,照射组照射后4周的组织中FAP表达显著增加,CD31表达下降(P<0.01)。同时荧光定量PCR结果显示,对原代成纤维细胞进行照射后,Vimentin和FAP的mRNA水平明显上调(P<0.01)。CCK8法检测结果,与未照射组比较,照射组在450 nm处吸光度(A)值更高(P<0.05)。流式细胞术分析结果显示,与未照射组比较,照射组照射后4周,能明显促进成纤维细胞进入S期(P<0.05或P<0.01),加速成纤维细胞的细胞周期进程。结论辐照可诱导成纤维细胞FAP表达上调,同时加速其细胞周期进程,可能是放疗后瘢痕疙瘩复发的原因之一。

68Ga标记成纤维细胞活化蛋白抑制剂PET/CT假阳性原因分析

目的 探讨^(68)Ga标记的成纤维细胞活化蛋白抑制剂(^(68)Ga-FAPI-04)PET/CT显像出现假阳性的原因。方法 回顾性收集西南医科大学附属医院核医学科2020年9月至2021年5月547例行^(68)Ga-FAPI-04 PET/CT检查患者的影像学资料,由2名有经验的核医学诊断医师根据患者临床资料、相关影像学检查、实验室检查、病理及随访结果对假阳性病例进行分析。结果 547例^(68)Ga-FAPI-04 PET/CT显像中共发现假阳性99例(18.1%),其中男56例,女43例。13例经术后病理诊断,包括甲状腺炎1例、肺结核2例、骨结核1例、肺炎性假瘤2例、肺结节病1例、肺良性纤维瘤1例、机化性肺炎1例、肾血管平滑肌脂肪瘤2例、肿块型胰腺炎1例及胰腺黏液囊腺瘤1例;86例经病史、相关影像学检查及长期随访证实,其中颈部8例(9.3%)、胸部13例(15.1%)、腹部5例(5.8%)、骨关节57例(66.3%)、皮肤3例(3.5%)。假阳性显像中与炎症有关的摄取83例(83.8%),以关节炎(23例)和骨赘(29例)最多见;与成纤维细胞有关的摄取16例(16.2%)。结论^(68)Ga-FAPI-04 PET/CT会出现非恶性肿瘤性假阳性显像,主要与炎症及成纤维细胞有关。

靶向成纤维细胞活化蛋白通过影响肿瘤相关成纤维细胞的外泌体抑制内皮细胞间质转化

目的探讨特异性抑制成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)是否能够通过影响肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)的外泌体(exosomes,exo)抑制内皮细胞间质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)并探究其机制。方法提取原代CAFs和癌旁成纤维细胞(peri-tumor fibroblasts,PTFs),收集CAFs-exo和PTFs-exo,特异性FAP抑制剂(3.3 nmol·L^(-1)SP13786)处理CAFs 24 h后收集的外泌体命名为Anti-FAP-exo。将内皮细胞HMEC-1分别以等体积的RPMI 1640、PTFs-exo、CAFs-exo及Anti-FAP-exo孵育并命名为control组、PTF组、CAF组及Anti-FAP组。划痕实验、Transwell侵袭实验、血管生成实验检测各组HMEC-1细胞的迁移、侵袭及血管生成能力;免疫荧光、免疫组化和Western blot检测EndMT相关蛋白表达水平。结果CAF组HMEC-1细胞的迁移、侵袭及血管生成能力较PTF组明显增强,Anti-FAP组HMEC-1细胞迁移、侵袭及血管生成能力较CAF组明显减弱,与PTF组比较无差异。与PTF组相比,CAF组HMEC-1细胞高表达α-SMA、SM22α、p-Stat3和Snail,低表达CD31和VE-cadherin;与CAF组相比,Anti-FAP组HMEC-1低表达α-SMA、SM22α、p-Stat3和Snail,高表达CD31和VE-cadherin。结论特异性抑制FAP会通过影响CAFs外泌体间接抑制血管内皮细胞的迁移侵袭与成管能力,Stat3-Snail-EndMT可能是其潜在机制。

心血管成纤维细胞显像的现状和展望

心肌纤维化是众多心血管疾病共同的基础病理改变,与心脏不良预后密切相关。目前临床上评价心肌纤维化的技术存在有创、特异性欠佳、无法早期诊断等不足。近年来,靶向活化成纤维细胞的核素显像因其在检测心肌纤维化以及在评估疾病进展和治疗反应方面的潜力而受到人们的关注。本文结合现有研究,重点介绍其应用现状、优势和局限性,探讨其在心血管疾病中的前景,旨在为进一步推动靶向活化成纤维细胞的核素显像在心血管疾病中的应用提供参考和启示。

成纤维细胞活化蛋白(FAP)的研究进展

成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein,FAP)存在于肿瘤基质成纤维细胞中,在细胞表面发挥作用,是一种膜丝氨酸肽酶,是II型丝氨酸蛋白酶家族成员之一,具有二肽肽酶及胶原酶活性,在肿瘤的生长中具有双重功能。FAP的蛋白水解酶活性可以增强肿瘤细胞对细胞外基质的侵袭力,同样也能促进肿瘤的生长和增殖。故以FAP作为靶点的分子成像以及作为肿瘤基质标志物的病理诊断、肿瘤基因治疗或免疫治疗将成为可能。近年来对FAP的研究进展进行如下综述。

miR-27a-3p激活MAPK信号通路促进人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖

背景:目前多项研究证实了丝裂原活化蛋白激酶信号通路参与了细胞的增殖过程,且miRNA参与增生性瘢痕的发生发展,因此深入探讨了miR-27a-3p和丝裂原活化蛋白激酶信号通路在病理性瘢痕形成中的作用。目的:探究miR-27a-3p通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法:收集皮肤标本并分别分离出原代成纤维细胞,倒置显微镜观察原代细胞,免疫荧光予以验证;采用qRT-PCR检测miR-27a-3p在组织中的相对表达水平;利用数据库预测miR-27a-3p的靶基因,再将预测的靶基因进行基因本体功能富集分析及京都基因与基因组百科全书生物通路富集分析;设置分组为:空白对照组、阴性对照组、miR-27a-3p过表达组、miR-27a-3p抑制组、miR-27a-3p过表达+p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂组、miR-27a-3p过表达+细胞外信号调节蛋白激酶抑制剂组、miR-27a-3p过表达+c-Jun氨基末端激酶抑制剂组,Western blot检测细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38激酶总量及其磷酸化水平,采用CCK-8法和EdU检测细胞增殖情况。结果与结论:①与正常皮肤成纤维细胞相比,增生性瘢痕成纤维细胞的增殖活性更强(P<0.05),增殖速度也更快(P<0.001);②与正常皮肤相比,miR-27a-3p在增生性瘢痕中呈高表达(P<0.001);③与阴性对照组相比,过表达miR-27a-3p能促进细胞的增殖活性(P<0.001)和增殖水平(P<0.001);④与阴性对照组相比,敲低miR-27a-3p能抑制细胞的增殖活性(P<0.05)和增殖水平(P<0.001);⑤与阴性对照组相比,过表达miR-27a-3p促进细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平(P<0.05);与阴性对照组相比,敲减miR-27a-3p能抑制细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平(P<0.05);⑥与miR-27a-3p过表达组相比,细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的特异性抑制剂可逆转miR-27a-3p对成纤维细胞的增殖活性(P<0.01)和增殖水平(P<0.001);⑦提示miR-27a-3p通过激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路促进人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。

成纤维细胞活化蛋白在肿瘤诊断及治疗中的研究进展

成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)是肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)的特异性标志物之一,在正常组织和非恶性肿瘤中基本不表达,但在绝大多数的上皮细胞来源的恶性肿瘤CAFs中高表达。FAP具有肿瘤细胞恶性生物学相关表型的功能,可作为特异性的肿瘤标志物,在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、胰腺癌、乳腺癌和口腔癌等肿瘤的临床诊疗方面具有较高的研究价值。针对FAP的靶向治疗策略有FAP抑制剂(FAP inhibition,FAPI)、FAP酶激活式前体药物、FAP疫苗、FAP抗体和嵌合抗原受体T细胞免疫治疗(chimeric antigen receptor T cell immuno-therapy,CAR-T)等,其作用机制主要体现在:1)靶向抑制FAP活性从而抑制肿瘤生长;2)消除基质-肿瘤细胞间的相互作用(尤其在实体瘤中),增加肿瘤内药物传递,促进免疫治疗药物的活性。FAP在肿瘤诊断及治疗中的研究,可为相关的临床研究提供参考价值,并协助提高临床上肿瘤的诊治效率及患者的生活质量,延长总生存期及减少并发症。

p38丝裂素活化蛋白激酶信号传导通路对低氧预处理后心脏成纤维细胞血红素氧化酶-1基因表达的影响

目的:探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号传导对低氧预处理(HPC)的细胞保护作用以及HPC后血红素氧化酶-1(HO-1)mRNA表达的影响。方法:选用新生Wistar大鼠心脏进行成纤维细胞培养,给予HPC及低氧/复氧处理(HR)。药物处理组在HPC和HR处理过程中向培养液中加入SB203580。测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)浓度和细胞HO-1 mRNA表达量。结果:低氧/复氧后,HPC/SB组LDH浓度显著高于HPC/NSB组(P<0.05)。HR组低氧/复氧后各亚组LDH浓度均显著升高(P<0.01,P<0.01);低氧/复氧处理前HPC组中NSB亚组于低氧预处理后HO-1 mRNA表达显著上升(P<0.001),低氧/复氧处理后其表达有所下降;SB亚组其表达也显著上升(P<0.01)。HR组中各亚组于低氧/复氧处理后HO-1 mRNA表达也显著上升(P<0.01)。结论:对培养的心脏成纤维细胞给予低氧预处理能够减轻其后低氧/复氧对细胞的损伤,低氧预处理较低氧/复氧处理更能够显著诱导心脏成纤维细胞HO-1 mRNA的表达。

成纤维细胞活化蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义

目的:检测人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activationprotein,FAP)mRNA的表达,探讨FAP mRNA与NSCLC临床特征及预后之间的关系。方法:2004年6月至2006年12月选取天津医科大学附属肿瘤医院组织库中247例NSCLC患者瘤组织标本和对应的48例癌旁组织标本,患者随访至2011年12月1日。采用实时荧光PCR检测NSCLC组织和正常肺组织中FAP mRNA。临床病理参数与FAP mRNA相对表达量的相关性分析采用Mann-Whitney U检验,以Kaplan-Meier法绘制生存曲线,用log-Rank检验比较患者的生存差异,采用Cox回归模型评估独立的预后因素。结果:FAP mRNA在NSCLC组织中过表达。NSCLC组织中FAP mRNA表达水平与NSCLC患者KPS评分成正相关(P<0.05),而与肿瘤原发部位、肿块大小、淋巴结转移、临床分期、组织学类型等其他病理特征无明显关系(P>0.05)。高表达FAP mRNA的NSCLC患者与低表达者相比,中位总生存时间(overall survival,OS)无明显差异(43 vs 39个月,P>0.05)。进一步以组织学类型分层分析显示,肺腺癌患者FAP mRNA表达量与临床分期成负相关(P=0.031),与KPS评分成正相关(P=0.041)。高表达FAP mRNA的肺腺癌患者与低表达者相比,中位OS时间显著延长(42 vs 26个月,P<0.05),多因素分析进一步证实FAP mRNA表达是影响肺腺癌患者预后的独立因素。结论:FAP在NSCLC组织中高表达,FAP mRNA高表达与肺腺癌的临床分期呈负相关,并与肺腺癌患者的预后密切相关。

成纤维细胞生长因子对烫伤大鼠原癌基因和抑癌基因蛋白的影响

目的 :观察外用碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)对大鼠深 度烫伤创面愈合过程中增殖细胞核抗原 (PCNA)、p5 3、原癌基因 c m yc和 caspase 3的影响 ,初步认识增殖与凋亡活动对创面愈合的作用。方法 :74只 Wistar大鼠随机分为正常对照、单纯烫伤和 b FGF治疗 3组。利用大鼠 30 %总体表面积深 度烫伤模型 ,于伤后 3、6小时及 1、3、7和 14日采取创面皮肤标本 ,采用免疫组织化学染色技术检测创伤组织真皮内成纤维细胞 PCNA、p5 3、c m yc和 caspase 3蛋白的表达变化情况。结果 :烫伤大鼠创面中成纤维细胞的增殖与凋亡活动与 p5 3、c myc蛋白表达有一定的关系 ;局部外用 b FGF对成纤维细胞的增殖等活动产生影响。结论

肌肉转录调节因子和连接蛋白43基因表达对大鼠成纤维细胞分化的生长特性及生物学功能影响

目的通过观察转染肌肉转录调节因子(myoblast determining,MyoD)基因和连接蛋白43(connexin43,Cx43)基因的大鼠成纤维细胞(fibroblast,FB)分化生长及生物学功能的改变,初步探讨MyoD和Cx43基因转染FB治疗缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)的可能机制和途径。方法构建真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-MyoD和pLenti6/V5-DEST-Cx43,利用慢病毒表达系统,将MyoD和Cx43基因转入大鼠RFL-6FB;经终浓度为50μg/ml的Blasticidin进行筛选培养后,通过RT-PCR、Western blot等分子生物学手段确定MyoD和Cx43的转录和表达情况;借助免疫细胞化学、显微镜观察等手段对MyoD的肌肉特异性蛋白和Cx43连接蛋白进行检测,并观察转染后FB的生长情况。结果RT-PCR和Western blot检测出MyoD和Cx43基因转染后FB表达了相应mRNA及其蛋白,免疫细胞化学检测转染的FB细胞中Desmin、α-actin呈阳性表达。经分化培养基诱导,培养1周后,FB出现多细胞融合及肌管形成。结论MyoD及Cx43基因转染可改变FB的生物学特性,转向分化为成肌细胞,并能形成多核肌管及连接蛋白,形态学也得以证实,为进一步研究MyoD和Cx43基因转染FB治疗IHD提供了实验基础。

丝裂原活化蛋白激酶通路对成纤维细胞内游离钙的影响

为观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对离体热烫伤后成纤维细胞内钙离子的作用以及丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)通路对胞内游离钙的影响 ,将培养的人成纤维细胞进行热损伤刺激后分成 4组 :①bFGF处理组 (10ng/ml) ;②预先加入PD980 5 9(10 μmol/L)阻断剂 30min,再行bFGF(10ng/ml)刺激 ;③预先加入SB2 0 35 80 (10 μmol/L)阻断剂 30min ,再行bFGF刺激 (10ng/ml) ;④同时加入PD980 5 9(10 μmol/L)和SB2 0 35 80 (10 μmol/L) 2种阻断剂 30min,再加入bFGF(10ng/ml)。应用特异性Ca2 + 荧光指示剂Fluo 3/AM负载细胞 ,激光共聚焦显微镜检测细胞内游离钙的浓度。结果显示 ,受热刺激的成纤维细胞荧光强度较弱。加入bFGF后可促使成纤维细胞中游离Ca2 +浓度升高 ,分别预先加入PD980 5 9和SB2 0 35 80拮抗剂的成纤维细胞 ,再加入bFGF ,胞内钙离子浓度出现不同的钙振荡现象。同时加入 2种阻断剂后胞内钙离子浓度则迅速降低。表明bFGF引起热损伤后的成纤维细胞中游离Ca2 + 浓度的增加 。

转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株的筛选

为了筛选转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株,本研究参照GenBank上蜘蛛拖丝蛋白基因序列(AY555585和AH015065)设计并人工合成拟蜘蛛基因四聚体(4S),与pcDNA3.1载体(K2.10启动子)相连构建真核表达载体(pcDNA3.1-K2.10-4S),采用脂质体介导法转染绵羊成纤维细胞,通过药物筛选、阳性细胞鉴定及体外培养等方法,获得了转蜘蛛拖丝蛋白基因的绵羊成纤维细胞株。结果,用pcDNA3.1-K2.10-4S表达载体转染冷冻复苏的绵羊成纤维细胞后,利用G418筛选法获得neo基因的抗性细胞,即阳性细胞;采用PCR方法对阳性细胞鉴定显示,所构建的载体整合到了细胞基因组中;对阳性细胞的染色体核型分析显示,阳性细胞核型稳定,与正常细胞的核型无差异;阳性细胞经冷冻复苏后仍能保持原有的特性。该细胞株的建立为进一步开展转拟蜘蛛拖丝蛋白基因的克隆羊研究奠定了基础。

载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化早期血管外膜成纤维细胞增殖活性增强

目的:探讨动脉外膜成纤维细胞增殖与早期动脉粥样硬化病灶形成的关系。方法:选择6周龄载脂蛋白E基因敲除[apoE(-/-)]小鼠和野生型C57BL/6小鼠,高脂喂养2、4和10周后,在各个时点处死动物前24 h经腹腔注射5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU),后选取升主动脉制备连续切片,通过HE染色观察组织形态学的变化,用免疫组化方法观察不同时点血管外膜及内膜BrdU的表达变化。体外培养高脂喂养2周的apoE(-/-)小鼠和C57BL/6小鼠动脉外膜成纤维细胞,通过BrdU掺入法测定细胞增殖活性,流式细胞术测定细胞周期。结果:体内实验发现apoE(-/-)小鼠高脂喂养2周后,在无可见内膜病灶形成之前,首先在主动脉外膜发现BrdU标记的阳性细胞,之后才在损伤内膜观察到BrdU标记细胞。而C57BL/6小鼠在任何时点都未检测到BrdU标记的细胞。体外实验观察到apoE(-/-)小鼠血管外膜成纤维细胞BrdU标记的细胞数显著多于C57BL/6小鼠(P<0.01),apoE(-/-)小鼠血管外膜成纤维细胞S期及G2/M期所占百分比明显高于对照组(P<0.05)。结论:血管外膜成纤维细胞增殖可能参与早期动脉粥样硬化病灶形成。

骨形成蛋白2基因转染的人牙周膜成纤维细胞的骨诱导作用

目的 建立表达骨形成蛋白 2 (BMP_2 )的人牙周膜成纤维细胞 (HPDLFs) ,观察其体内成骨作用 ,为牙周缺损修复基因疗法的建立提供实验依据。方法 采用脂质体载体将人BMP_2噬菌粒表达载体pBK_B2转染至HPDLFs。利用免疫组化ABC法检测转染细胞内BMP_2蛋白的表达 ,并于无菌条件下将转染细胞注射于裸鼠股部肌肉内 ,2 1d后取材 ,苏木精—伊红染色观察肌肉组织内骨形成情况。结果 BMP_2基因转染后HPDLFs内有BMP_2蛋白的表达。在注射BMP_2基因转染细胞的肌肉组织内可见明显的新骨形成。结论 BMP_2基因成功转入HP DLFs中并得到有效表达 。

绿色荧光蛋白转基因成纤维细胞与义齿基托树脂复合生长状况的活体观察

细胞与材料复合生长状况的活体动态监测可能理想地反映材料的体外生物相容性。本研究通过绿色荧光蛋白 (Green fluorescent protein,GFP)转基因技术成功标记了小鼠成纤维细胞 L 92 9。该荧光蛋白标记细胞与义齿基托树脂复合培养过程中 ,通过倒置相差显微镜和荧光显微镜活体动态监测了材料周围和材料表面细胞形态、增殖及其对材料的黏附等状况。结果发现 ,义齿基托树脂制备过程中残留的甲基丙烯酸甲酯单体表现了一过性的细胞毒作用 ,但该细胞毒作用可以通过树脂的短时间浸泡而得以消除。活体动态观察可以发现材料很轻微的毒副作用 ,表明细胞与材料复合生长状况的活体动态监测能更真实。

慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究

目的观察慢病毒载体转染豚鼠巩膜成纤维细胞的有效性及对细胞活性的影响。方法转染组用慢病毒携带绿色荧光蛋白(lentiviral mediated green fluorescent protein,Lenti-GFP)转染豚鼠巩膜成纤维细胞,对照组加入空白培养液,转染组按最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50、100、200、400加入Lenti-GFP,转染2d、3d、4d、5d、6d和7d后,在倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测病毒对细胞增殖的影响。结果 Lenti-GFP转染细胞后48h可以看见绿色荧光;在同一MOI值下,随时间延长转染效率增高,第5天达到高峰;在MOI为400,转染5d时转染效率达82.86%;转染5d行MTT检测显示:MOI为50～400时,同一转染时间各组IOD值与对照组比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论慢病毒载体可以在体外稳定而有效地转染豚鼠巩膜成纤维细胞,且不影响细胞活性,是巩膜成纤维细胞理想的基因转染载体。

无瘢痕愈合中核糖体蛋白s29基因表达产物对皮肤成纤维细胞增生的作用

目的探讨核糖体蛋白s29基因(RPs29gene)表达产物对皮肤成纤维细胞增生的作用。方法采用抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)方法筛选并克隆鼠胚皮肤特异表达的RPs29基因cDNA片段。应用PCR技术扩增RPs29基因ORF全长,构建真核重组表达载体pcDNA3.1/RPs29,体外转染成鼠皮肤成纤维细胞,观察细胞形态结构改变,免疫组织化学方法、RT-PCR分析外源基因表达情况。结果RPs29基因在成纤维细胞中表达,细胞增生能力降低,凋亡加剧。结论核糖体蛋白s29基因表达产物能抑制成纤维细胞增生,促进细胞凋亡,为无瘢痕愈合的研究提供实验材料及实验依据。

稳定表达人骨形成蛋白-2基因的成纤维细胞体内诱导成骨作用

目的 探讨稳定表达人骨形成蛋白 - 2 (h BMP- 2 )基因的成纤维细胞是否具有体内诱导成骨能力。 方法 构建重组真核表达载体 pc DNA3- h BMP- 2 ,在脂质体介导下 ,将其导入 NIH3T3细胞 ,通过 G4 18筛选获得阳性克隆 ,并继续培养 4周 ,用细胞原位杂交和免疫组织化学方法观察 h BMP- 2基因在 NIH3T3细胞内的稳定表达 ,并观察了稳定表达 h BMP- 2的成纤维细胞碱性磷酸酶 (AL P)活性的变化 ,将稳定表达 h BMP- 2的成纤维细胞植入裸鼠肌袋内观察其体内诱导成骨作用。 结果 成功构建重组真核表达载体 pc DNA3- h BMP- 2 ,经细胞原位杂交和免疫组织化学证实 ,转染 pc DNA3- h BMP- 2后的 NIH3T3细胞内有大量 h BMP- 2 m RNA的转录及其蛋白的稳定表达 ,稳定表达 h BMP- 2的成纤维细胞 AL P活性显著上升 ,植入裸鼠肌袋内 4周有大量软骨形成。 结论 稳定表达 h BMP- 2的成纤维细胞具有体内诱导成骨能力。