碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体转染骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病

背景:研究证实骨髓间充质干细胞可以明显提高糖尿病大鼠胰岛功能恢复及改善高血糖状态,可能与自体胰腺干细胞分化能力增强有关。目的:验证碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体(PEGFP-C3-BFGF)转染骨髓间充质干细胞并移植入糖尿病大鼠体内后,对大鼠糖尿病的治疗效果。方法:通过重组腺病毒(Ad.a FGF)介导PEGFP-C3-BFGF转染入骨髓间充质干细胞,利用荧光显微镜观察PEGFP-C3-BFGF的表达。将80只SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组、移植组及基因转染组,每组20只,采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立大鼠糖尿病模型,模型建立后于对照组给予门静脉注射生理盐水,糖尿病组门静脉注射PBS液,移植组门静脉注射骨髓间充质干细胞悬液1 mL,基因转染组门静脉注射等量转染PEGFP-C3-BFGF的骨髓间充质干细胞悬液。利用RT-PCR法检测各组大鼠胰岛组织中基质金属蛋白酶的m RNA表达差异;检测移植后24 h,3 d,7 d,14 d,21 d各组大鼠血糖水平;移植后3周利用ELISA法检测各组大鼠血浆胰岛素分泌水平;苏木精-伊红染色观察大鼠胰腺组织病理变化。结果与结论:(1)荧光显微镜观察到PEGFP-C3-BFGF转染入骨髓间充质干细胞48 h后,呈现出明显的特异性绿色荧光;(2)移植后2周与对照组比较,糖尿病组的基质金属蛋白酶m RNA表达明显增加(P<0.05),移植组及基因转染组基质金属蛋白酶m RNA的表达较糖尿病组明显下降(P<0.05);(3)移植后不同时间点各组大鼠血糖比较,基因转染组<移植组<糖尿病组,但基因转染组仍>对照组(均P<0.05);(4)移植后不同时间点各组大鼠血浆胰岛素分泌水平比较,基因转染组>移植组>糖尿病组,但基因转染组仍<对照组(均P<0.05);(5)各组大鼠胰腺组织病理情况比较,移植组优于糖尿病组,基因转染组又优于移植组,接近于对照组。(6)结果说明,PEGFP-C3-BFGF转染骨髓间充质干细胞移植入糖尿病大鼠体内,可以改善大鼠血糖水平,促进胰岛素的分泌,其可能是通过下调基质金属蛋白酶mR NA的表达从而改善大鼠糖尿病病变程度。

脂质体介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞条件的优化

通过脂质体(FuGENE-6)介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的表达随DNA、脂质体量的增加而增加,延长细胞暴露时间反而使转染效率下降,转染细胞数适当才能得到较高的转化率。

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对间充质干细胞生物学行为的调控

为探讨碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)基因转染对间充质干细胞 (MSCs)增殖、定向分化等生物学行为的调控作用 ,本文将体外具有促进 MSCs增殖分化及毛细血管增殖等多重生物学效应的 b FGF基因转入骨组织工程首选种子细胞—— MSCs,通过免疫组化 SABC法检测其瞬时与稳定表达 ,并检测转基因细胞增殖活力及碱性磷酸酶 (AL P)与骨钙素 (OC)合成情况。结果表明 ,b FGF基因能被转入 MSCs并得到稳定表达 ,转基因细胞增殖与OC合成明显增强 ,AL P活性无明显变化。因此 ,转基因 MSCs可使 b FGF持续高效发挥作用 ,克服了使用外源性b FGF半衰期短 ,需反复大剂量给药的缺点 ;b FGF基因转染可促进 MSCs增殖并调控其定向分化 ,使其获得良好的生物学活性 ;从而为把组织工程学与分子生物学有机结合 ,用分子组织工程学技术高质量地修复骨缺损奠定了良好的基础。

hBMP_2基因转染对人牙龈成纤维细胞生物学特性的影响

目的 :分析hBMP2 基因转染人牙龈成纤维细胞的生物学特性。方法 :用脂质体转染法将hBMP2 基因转入人牙龈成纤维细胞内 ,经G4 18筛选后 ,获得阳性克隆。以原位杂交和免疫组化对转染细胞进行鉴定 ;进一步观察细胞形态、生长特性、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成以及体外形成矿化结节的能力。结果 :hBMP2 基因转染后 ,人牙龈成纤维细胞有hBMP2 mRNA的转录和蛋白表达 ;部分细胞由原来的长梭形转化为多角形 ,碱性磷酸酶活性和骨钙素合成均明显高于对照组 (两组均P <0 .0 1) ;在矿化液作用下 ,能形成体外矿化结节。但细胞的增殖特性无明显变化。结论 :外源性hBMP2 基因能够在人牙龈成纤维细胞表达 ,并促进其向成骨细胞方向转化 ,而对细胞的生长特性无明显影响。

骨形成蛋白2基因转染的人牙周膜成纤维细胞的骨诱导作用

目的 建立表达骨形成蛋白 2 (BMP_2 )的人牙周膜成纤维细胞 (HPDLFs) ,观察其体内成骨作用 ,为牙周缺损修复基因疗法的建立提供实验依据。方法 采用脂质体载体将人BMP_2噬菌粒表达载体pBK_B2转染至HPDLFs。利用免疫组化ABC法检测转染细胞内BMP_2蛋白的表达 ,并于无菌条件下将转染细胞注射于裸鼠股部肌肉内 ,2 1d后取材 ,苏木精—伊红染色观察肌肉组织内骨形成情况。结果 BMP_2基因转染后HPDLFs内有BMP_2蛋白的表达。在注射BMP_2基因转染细胞的肌肉组织内可见明显的新骨形成。结论 BMP_2基因成功转入HP DLFs中并得到有效表达 。

人转化生长因子β1基因转染人牙龈成纤维细胞及其稳定表达

目的 :探讨人转化生长因子 - β1(hTGF - β1)基因转染人牙龈成纤维细胞 (GF)的表达能力。 方法 :体外培养人GF ,传代培养后以阳离子脂质体 (Lipofectamine) :pcDNA3-hTGF - β1为 3μL∶1μg的比例转染。通过免疫组织化学染色的方法及图像分析检测hTGF - β1表达水平 ;利用水貂肺上皮细胞生长抑制法检测TGF - β1的生物学活性。结果 :转染后的GF呈强阳性表达 ,并持续 4周以上。图像分析显示转染细胞hTGF - β1表达显著增强 ,与对照组比较差异显著 (P <0 .0 1)。转染后细胞上清可有效的抑制水貂肺上皮细胞的生长。结论 :hTGF - β1基因转染可使牙龈成纤维细胞有效而稳定的表达活性hTGF -

慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究

目的观察慢病毒载体转染豚鼠巩膜成纤维细胞的有效性及对细胞活性的影响。方法转染组用慢病毒携带绿色荧光蛋白(lentiviral mediated green fluorescent protein,Lenti-GFP)转染豚鼠巩膜成纤维细胞,对照组加入空白培养液,转染组按最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50、100、200、400加入Lenti-GFP,转染2d、3d、4d、5d、6d和7d后,在倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测病毒对细胞增殖的影响。结果 Lenti-GFP转染细胞后48h可以看见绿色荧光;在同一MOI值下,随时间延长转染效率增高,第5天达到高峰;在MOI为400,转染5d时转染效率达82.86%;转染5d行MTT检测显示:MOI为50～400时,同一转染时间各组IOD值与对照组比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论慢病毒载体可以在体外稳定而有效地转染豚鼠巩膜成纤维细胞,且不影响细胞活性,是巩膜成纤维细胞理想的基因转染载体。

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的:观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导入正常真皮成纤维细胞后,能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子,为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。方法:实验于2001-06/2005-06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3.0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3.0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3.0-hVEGF165质粒大量制备(碱裂解法)→质粒纯化→质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只,无菌条件下取新生兔皮肤,尽量去除皮下组织,切成宽0.3cm小条块,Ⅰ型胶原酶消化,进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞,经G418筛选,获得阳性转染细胞克隆,并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平;原位杂交显示转基因细胞内VEGF165mRNA的表达情况;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况;透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。结果:①质粒酶切鉴定结果:提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5.4kb和0.57kb两个片段,与原质粒图谱符合,表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3.0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况:共进行15次转染试验,35孔(皿)均有G418抗性集落形成,表明pcDNA3.0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达:pcDNA3.0-hVEGF165转染成纤维细胞后,24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋白表达,高达(3280±2054)ng/L,并于48,72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果:转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGFmRNA。G418应用2～4周后,可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆,筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEGFmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测:转染后成纤维细胞S期细胞比例增加,G1和G2期细胞减少,表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高,转染前为1.26%,转染后2d为2.64%,至12代时高达17.35%。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察:细胞表面有较多微绒毛,核呈不规则形,胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体,沿膜可见一些膜包被颗粒。结论:真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165成功导入家兔皮肤成纤维细胞,在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子,在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。

碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞在失神经肌肉萎缩中的应用

背景:如何避免失神经性肌萎缩是提高外周神经损伤疗效的关键因素。目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞预防失神经支配肌肉萎缩的作用。方法:通过病毒转染的方法将碱性成纤维细胞生长因子基因转染入大鼠骨髓间充质干细胞,应用MTT法、免疫组化、苏木精-伊红染色光镜观察、RT-PCR、Western blotting及ELISA法检测碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞的效果及产物的表达。取32只SD大鼠建立坐骨神经损伤模型,实验组肌肉多点注射碱性成纤维细胞生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞,对照组注射细胞培养液,移植后2,4,6,8周腓肠肌取材,检测腓肠肌动作电位、残余湿质量、肌纤维横截面积等指标。结果与结论:(1)通过病毒转染的方法,成功将碱性成纤维细胞生长因子基因转染入骨髓间充质干细胞。(2)检测腓肠肌肌肉湿质量残存率、腓肠肌横截面积及肌细胞直径残存率、残存腓肠肌动作电位等指标,实验组均优于对照组(P<0.05)。(3)结果表明碱性成纤维细胞生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞植入失神经肌肉中,可减缓肌肉萎缩速度。

电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的初步研究

目的采用电穿孔方法，介导质粒载体pEGFP-cl转入兔成体成纤维细胞，探讨建立电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的基本条件。方法电穿孔介导质粒载体pEGFP—cl转入7．10代兔耳成体成纤维细胞系GG，研究不同电压、电容、DNA剂量，孵育温度的条件下，观察细胞存活数，流式细胞仪测试GFP的含量。结果以PBS作为电击基础液、细胞浓度2×10^6个／ml，电压250V、电容700μF，DNA用量30μg时，兔耳成纤维细胞的转染率和存活率最佳。且电击前冰浴10min，电转染后37℃孵育10min有利于提高细胞的转染率和存活率。结论在合适电压、电容、DNA剂量条件下，电转染提供了外源基因转染兔耳成体成纤维细胞适用性；电转染前的一定时间冰浴和电转染后一定温度孵育可使电转染效率得到改善。

血管内皮细胞生长因子基因转染皮肤成纤维细胞的实验研究

为改善人工复合皮在临床上的应用效果 ,构建人血管内皮细胞生长因子 16 5 (hVEGF165)基因重组载体pcDNA3,并转染成纤维细胞。检测转基因细胞培养上清液VEGF浓度 ;用转基因细胞培养上清液刺激人脐静脉血管内皮细胞 ,观察内皮细胞增殖速度 ;通过Miles实验检测VEGF的生物学活性。结果显示 ,转基因成纤维细胞能够表达一定浓度的VEGF,且具有加速体外培养人脐静脉血管内皮细胞 (HUVEC)生长和增强血管通透性的生物学活性。提示转hVEGF165基因成纤维细胞可修饰人工皮的真皮面。

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长、定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点。目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序。利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆。采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Western-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期。结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位主要位于胞浆。转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05)。提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖。

人釉原蛋白基因转染对人牙龈成纤维细胞生物学活性的影响

分析釉原蛋白基因转染对牙龈成纤维细胞生物学活性的影响,为其进一步应用于基因增强牙周组织工程奠定实验基础。[方法]脂质体转染法将人釉原蛋白基因转入人牙龈成纤维细胞内,Zeoin筛选获得阳性克隆。以ELISA法检测重组釉原蛋白在转染细胞内以及培养上清液中的表达;进一步以MTT比色法分析基因转染对细胞增殖和分化的影响。[结果]釉原蛋白基因转染后,人牙龈成纤维细胞可以在胞内合成重组人釉原蛋白并将其分泌至胞外,表达浓度分别为0.277μg/mL和0.147μg/mL;与未转染组相比,釉原蛋白基因转染可显著促进牙龈成纤维细胞增殖(P<0.05),并且差异随时间增大。转染后的牙龈成纤维细胞碱性磷酸酶活性也较对照组有显著提高(P<0.05)。[结论]外源性釉原蛋白基因能够在人牙龈成纤维细胞获得表达,并显著促进其增殖以及向成骨细胞方向转化,可以应用于基因增强牙周组织工程。

FADD-DN基因转染对氦氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的影响(英文)

目的探讨氦氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的分子机制。方法将培养瘢痕成纤维细胞随机分为转染组、转染对照组和非转染组,转染组细胞与绿色荧光蛋白(GFP)质粒cDNA、含目的基因片段的表达载体质粒pcDNA3-FADD-DNcDNA共转染,转染对照组细胞与GFP质粒cD-NA、空载体质粒pcDNA3共转染,非转染组细胞没有进行转染,转染后24h分别对各组细胞进行氦氖激光照射(100mW/cm2照射30min),1次/d,连续照射3d,然后采用TUNEL技术检测细胞凋亡。结果转染组、转染对照组与非转染组细胞凋亡率分别为9.27%,15.73%和12.87%,转染组细胞凋亡率明显小于转染对照组(q=4.55,P<0.01)和非转染组(q=4.14,P<0.05)。结论FADD-DN基因转染能减少氦氖激光诱导的瘢痕成纤维细胞凋亡,FADD可能是氦氖激光激活死亡信号途径的基本元件之一。

核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞成骨表型转化

目的:观察细胞因子诱导成骨的共同信号分子核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞,其成骨表型转变的可能性。方法:实验于2003-10/2004-10在解放军第三军医大学新桥医院骨科中心实验室完成。采用脂质体转染技术行核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞,成骨标志基因I型胶原、骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶、核心结合因子α1mRNA的表达采用反转录-聚合酶链反应检测,骨钙素的表达采用免疫细胞化学染色检测,Cbfa蛋白的表达采用Westernblot检测。结果:①NIH3T3成纤维细胞经核心结合因子α1基因转染后出现骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶的表达,I型胶原表达增强,说明在转录水平有成骨标志基因的表达。②免疫细胞化学染色检测到了骨钙素的表达,显示NIH3T3细胞已发展为成骨细胞。③Westernblot检测到了核心结合因子α1蛋白的表达,证实了成纤维细胞发生了表型的改变。结论:核心结合因子α1基因转移NIH3T3成纤维细胞改变了成纤维细胞向成骨表型转化,增加了成骨细胞数量,使成骨能力增强成为可能。

Fas基因转染瘢痕疙瘩成纤维细胞并诱导其凋亡的实验研究

目的探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞抗Fas单克隆抗体(mAb)诱导的凋亡,是否能通过正常Fas基因转染使凋亡率得以提高。方法利用分子克隆技术将人Fas cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1多克隆位点之间,以脂质体介导法将目的基因导入瘢痕疙瘩成纤维细胞,Fas mAb诱导凋亡;通过琼脂糖凝胶电泳、HE染色和流式细胞仪检测瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的情况。结果转基因的瘢痕疙瘩成纤维细胞经Fas mAb作用后,在形态学上出现典型的细胞核固缩、碎裂;琼脂糖凝胶电泳显现特征性的“梯状”带;流式细胞仪检测凋亡率明显增加。对照组未见上述结果。结论瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas诱导的凋亡异常,是由于Fas凋亡通道的“上游事件”无功能Fas蛋白造成,与通道下游无关。瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡异常可能是Fas基因突变引起,其与瘢痕疙瘩形成有密切关系。

人血小板源性生长因子-B基因转染犬牙龈成纤维细胞的瞬时表达检测

目的检测携带人血小板源性生长因子-B（hPDGF-B）基因的真核表达质粒在Beagle犬牙龈成纤维细胞内的表达。方法扩增和鉴定携带hPDGF-B基因的质粒EX-A0380-M03,脂质体介导的方法转染Bealge犬牙龈成纤维细胞,RT-PCR、免疫细胞化学、ELISA以及Western blot检测hPDGF-BB的表达。结果 EX-A0380-M03所携带的目的基因为hPDGF-B基因,转染牙龈成纤维细胞24 h后可观察到细胞内的绿色荧光蛋白,48 h转染效率可达18%~38%。RT-PCR、免疫细胞化学、ELISA均能检测到细胞表达hPDGF-B。Western blot证实所表达的蛋白为融合蛋白。结论携带hPDGF-B基因的真核表达载体EX-A0380-M03能被转入牙龈成纤维细胞,并成功表达一种融合蛋白。

TIMP-2基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞基质金属蛋白酶2及其抑制剂表达

目的观察转染基质金属蛋白酶2抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase2,TIMP-2)基因的豚鼠巩膜成纤维细胞不同时间增生能力及基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2,MMP-2)和TIMP-2的表达,探讨基因治疗近视的可行性。方法随机选取三色健康豚鼠,组织块法体外培养原代巩膜成纤维细胞,免疫组织化学法进行波形蛋白的鉴定,取第3～6代细胞进行实验。分子克隆构建携带TIMP-2基因的真核表达载体,转染豚鼠巩膜成纤维细胞,MTT法观察转染后12h、24h、48h、3d、5d、7d细胞增生能力。提取总RNA,二步法逆转录-聚合酶链反应检测MMP-2mRNA及TIMP-2mRNA的表达水平。结果豚鼠巩膜成纤维细胞原代、传代培养生长良好,波形蛋白鉴定阳性。转染3d、5d、7d TIMP-2基因转染组成纤维细胞的增生速度分别为0.6724±0.0092、0.7963±0.0060、0.8462±0.0064,明显快于正常对照组成纤维细胞(0.5810±0.0120、0.6525±0.0072、0.7129±0.0132),差异均具有显著统计学意义(均为P<0.01)。转染48h MMP-2mRNA表达即开始减少,转染3d时表达明显减少,达到最低,除转染12h与24h之间外,转染组与正常对照组、各转染不同时间组间MMP-2mRNA表达差异均有统计学意义(均为P<0.05)。TIMP-2mRNA表达在转染48h时即开始增加,除12h与24h外,转染组与正常对照组、各转染不同时间组间TIMP-2mRNA表达差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论转染TIMP-2基因对豚鼠巩膜成纤维细胞有促增生作用,TIMP-2基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞抑制MMP-2mRNA的表达,可在一定程度上阻止近视发展中巩膜组织的丢失与重塑。

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠眼外肌成肌细胞生物学行为的影响(英文)

背景:实验证明外源性的碱性成纤维细胞生长因子可以增强骨骼肌成肌细胞的生长及成活,内源性碱性成纤维细胞生长因子对肌肉修复也有明显作用。但如将其基因转染到眼外肌中也有相同的效果吗?目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠眼外肌成肌细胞生物学行为的影响。设计:单一样本观察。单位:青岛大学医学院附属医院眼科。材料:原代大鼠眼外肌成肌细胞为前期培养得到,纯度大于90%,并成功构建人PEGFP-N3-bFGF真核表达载体(另文发表)。方法:实验于2005-09/2006-12在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①实验干预及分组:实验分为试验组:用重组PEGFP-N3-bFGF转染的细胞;对照组1:空载PEGFP-N3转染的细胞;对照组2:培养皿中只加入F-10培养基(体积分数为0.1的胎牛血清)培养的细胞。采用脂质体转染技术,将重组PEGFP-N3-bFGF质粒转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞中。③实验评估:用免疫组织化学法观察碱性成纤维细胞生长因子表达;用荧光显微镜检测转染效率;在培养的第1,3,5,7,9,11,13,15,21,28天采用ABC-ELISA法检测各组成肌细胞碱性成纤维细胞生长因子蛋白的分泌;采用四甲基偶氮唑盐法检测各组眼外肌成肌细胞增殖情况;根据已知一定浓度标准品的A值计算各组细胞肌酸激酶活性。主要观察指标:①观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞的效率;转染后的表达情况。②转染后碱性成纤维细胞生长因子蛋白的分泌情况;对大鼠眼外肌肌原细胞生长和分化的影响。结果:①碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞的转染率达(42.8±1.2)%。②免疫组织化学检测试验组呈现阳性反应。③转染细胞能够分泌碱性成纤维细胞生长因子蛋白,第5天最高达662.935ng/L。④转染细胞增殖活性明显提高,其A值均比同一时相点的对照组明显增高(P<0.05)。⑤转染后细胞从第5天始至终,肌酸激酶值高于对照组(P<0.01)。结论:碱性成纤维细胞生长因子基因转入大鼠眼外肌的成肌细胞中,能够使大鼠眼外肌的成肌细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子,具有促进细胞增殖,提高其成活率,促进其分化能力。

人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞后的细胞增殖

背景:利用重组腺病毒载体转染外源性基因到组织工程骨的种子细胞是骨缺损基因治疗研究的热点。目的:用人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞,以探讨基因转染对人骨髓基质干细胞增殖的影响。方法:将Ad-hBMP2-IRES-hFGF2转染至人骨髓基质干细胞中,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR方法观察人骨形态发生蛋白2cNDA和人成纤维细胞生长因子2cNDA在人骨髓基质干细胞中的转录情况,Westerblot方法检测人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2蛋白表达情况,锥虫蓝测定细胞活力,流式细胞仪分析其对细胞增殖的影响。结果与结论:转染后人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达,细胞活力无明显变化,流式细胞仪分析细胞周期中增殖细胞比例明显增加。说明该双基因可高效转染人骨髓基质干细胞,且促进细胞增殖。