绵羊成纤维细胞OAR-L1高效转染方法的探索

为了在绵羊肺成纤维细胞OAR-L1中高效表达外源蛋白,探索适合该细胞的转染方法,本研究比较了聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)、脂质体2000转染试剂(Lipofectamine^(TM) 2000 transfection reagent,Lipo 2000)、成纤维细胞转染试剂盒(Cytofect^(TM) fibroblast transfection kit,CF2)以及慢病毒介导的细胞转染方法在OAR-L1细胞中表达外源蛋白的效果。结果显示:以pLentiCMV-EGFP-Puro或pLentiCMV-mCherry-Puro荧光质粒转染OAR-L1细胞时,细胞密度和转染试剂用量均可影响PEI、Lipo 2000和CF2介导的细胞转染效率,且三者最佳转染效率均不超过30%,而慢病毒介导的细胞侵染不受细胞密度和病毒液用量的限制,获得的荧光细胞数目也显著高于前三者。包装好的病毒液可以在4或-80℃条件下至少保存15 d而侵染效果不受影响。在OAR-L1细胞中共表达2种外源蛋白时,包装获得的2种慢病毒液等比例混合后再侵染的方式能获得更高的共转率。综上所述,慢病毒侵染是一种能够实现在OAR-L1细胞中高效表达外源蛋白的细胞转染方式,本研究结果为其他难转染细胞系转染方式的选择提供了一定的参考。

靶向成纤维细胞生长因子受体1信号改善类风湿关节炎的骨破坏

背景:尽管科研人员已注意到成纤维细胞生长因子受体1在类风湿关节炎骨破坏中展现出巨大潜力,但尚未有学者对成纤维细胞生长因子受体1在类风湿关节炎骨破坏中的研究进展作全面综述。目的:通过查阅国内外相关文献,综合分析成纤维细胞生长因子受体1在类风湿关节炎骨破坏中的机制。方法:以“成纤维细胞生长因子受体1,类风湿关节炎,骨破坏,骨细胞,成骨细胞,破骨细胞,软骨细胞,巨噬细胞,滑膜成纤维细胞,T细胞,血管内皮细胞”为检索词检索中国知网数据库,以“fibroblast growth factor receptor 1,rheumatoid arthritis,bone destruction,osteocytes,osteoblasts,osteoclasts,chondrocytes,macrophages,synovial fibroblasts,T cells,endothelial cells”为检索词检索PubMed数据库,检索时间范围重点为1992年4月至2024年1月。通过阅读文献题目、摘要及全文,根据纳入与排除标准进行筛选,最后纳入82篇文献进行综述。结果与结论:成纤维细胞生长因子受体1广泛表达于骨组织相关细胞,包括骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等,可以通过调控这些细胞的功能来影响骨重塑过程和维持骨稳态,促进类风湿关节炎骨破坏的发生和发展。成纤维细胞生长因子受体1还可以在滑膜成纤维细胞和巨噬细胞中参与炎症反应,在内皮细胞中调控滑膜血管生成,从多个方面促进骨破坏。成纤维细胞生长因子受体1可能是类风湿关节炎骨破坏的一个重要参与因素,为进一步研究类风湿关节炎治疗靶点提供依据。

成纤维细胞生长因子受体1 抑制剂对胶原诱导关节炎模型大鼠骨破坏的影响

背景:课题组前期的研究表明靶向成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)可能是治疗类风湿性关节炎的有效靶点。目的:探讨FGFR1抑制剂(PD173074)对胶原诱导关节炎模型大鼠骨破坏的影响。方法:将25只雌性SD大鼠随机分为5组,正常对照组、模型组、甲氨蝶呤组、PD173074低剂量组、PD173074高剂量组。除正常对照组外,其余各组大鼠建立Ⅱ型胶原诱导关节炎模型。造模成功后正常组及模型组大鼠腹腔注射无菌PBS,甲氨蝶呤组药物注射剂量为1.04 mg/kg,PD173074低剂量组和高剂量组药物注射剂量分别为5,20 mg/kg,1次/周。给药4周后取材,观察大鼠临床症状以及关节肿胀情况,踝关节Micro-CT三维重建及分析,观察踝关节病理变化,检测关节周围血管生成情况及核因子κB受体活化因子配体的表达,检测关节滑膜中p-FGFR1、血管内皮生长因子A、抗酒石酸酸性磷酸酶的表达,观察肝、脾、肾病理变化并计算肝、脾、肾指数。结果与结论:①PD173074能够减轻模型大鼠踝关节临床症状及关节肿胀,延缓骨质丢失,改善骨结构,减轻关节滑膜侵袭以及软骨骨侵蚀,降低关节周围破骨细胞数量,抑制关节滑膜组织中的血管生成,降低核因子κB受体活化因子配体的表达,抑制FGFR1磷酸化蛋白、抗酒石酸酸性磷酸酶和血管内皮生长因子A的蛋白表达。②大鼠肝、脾、肾病理观察表明经过PD173074治疗后无明显的毒副作用。③研究证明了FGFR1抑制剂能够延缓Ⅱ型胶原诱导关节炎模型大鼠关节炎症及骨破坏的进展,并抑制血管的生成。初步验证了PD173074在Ⅱ型胶原诱导关节炎模型中的治疗作用,其可能是通过抑制FGFR1磷酸化发挥作用,为寻找类风湿性关节炎新的治疗靶点提供了方向。

长链非编码RNA核富集转录本1对瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡和迁移的影响

背景:已有研究阐明核富集转录本1(nuclear enriched abundant transcript 1,NEAT1)下调抑制了瘢痕成纤维细胞的进展,但具体机制尚不完全清楚。目的:探讨长链非编码RNA NEAT1调节miR-136-5p/泛素特异性蛋白酶4(ubiquitin specific protease 4,USP4)轴对瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响。方法:将瘢痕成纤维细胞分为5组:si-NC组、空白对照组、si-NEAT1组、si-NEAT1+miR-136-5p inhibitor组、si-NEAT1+inhibitor-NC组,qRT-PCR检测NEAT1、miR-136-5p表达;CCK-8法及EDU染色检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;划痕愈合实验检测细胞迁移情况;Western blot检测USP4、p27、Bax、基质金属蛋白酶9、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白α1链蛋白表达;双荧光素酶实验检测NEAT1与miR-136-5p、miR-136-5p与USP4的关系。结果与结论:①与si-NC组比较,si-NEAT1组NEAT1表达、A450值、EDU阳性细胞百分比、划痕愈合率以及USP4、基质金属蛋白酶9、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白α1链蛋白表达降低(P<0.05),miR-136-5p表达、细胞凋亡率及p27、Bax蛋白表达升高(P<0.05);②miR-136-5p inhibitor逆转了沉默NEAT1对瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响;③miR-136-5p与NEAT1、miR-136-5p与USP4存在靶向调控关系。结果表明,沉默NEAT1可能通过调控miR-136-5p/USP4轴抑制瘢痕成纤维细胞的增殖和迁移,诱导其凋亡。

外源性碱性成纤维细胞生长因子促进大鼠创面愈合的机制

背景:深入揭示外源性碱性成纤维细胞生长因子促进创面愈合的分子机制。目的:探讨外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠创面修复中巨噬细胞表型转换和肉芽再生的影响。方法:(1)体外细胞实验:分为正常对照组、低剂量碱性成纤维细胞生长因子组、高剂量碱性成纤维细胞生长因子组以及碱性成纤维细胞生长因子+丙戊酸组,其中低、高剂量碱性成纤维细胞生长因子组细胞培养基中分别添加100,200μg/L碱性成纤维细胞生长因子,碱性成纤维细胞生长因子+丙戊酸组细胞培养基中添加200μg/L碱性成纤维细胞生长因子和20 mmol/L Notch1/Jagged1激动剂丙戊酸。通过EdU实验、划痕实验、小管生成实验检测碱性成纤维细胞生长因子对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和血管新生的影响。(2)体内动物实验:SD大鼠按照随机数字表法分为模型组、低剂量碱性成纤维细胞生长因子组、高剂量碱性成纤维细胞生长因子组以及碱性成纤维细胞生长因子+丙戊酸组,构建大鼠全层皮肤缺损开放性创面模型,其中低、高剂量碱性成纤维细胞生长因子组皮下注射100,200μg/L碱性成纤维细胞生长因子,碱性成纤维细胞生长因子+丙戊酸组大鼠皮下注射200μg/L碱性成纤维细胞生长因子的同时腹腔注射10 mg/kg丙戊酸。给药7,14 d检测大鼠创面的愈合率;TUNEL检测创面组织中的细胞凋亡情况;酶联免疫吸附实验检测大鼠血清中丙二醛、超氧化物歧化酶、肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平;免疫荧光检测创面组织中巨噬细胞的表型转换情况;免疫组化检测创面组织中增殖细胞核抗原、CD31和血管内皮生长因子的表达;Western blot法检测创面组织中Notch1、Jagged1的表达。结果与结论:(1)与正常对照组相比,碱性成纤维细胞生长因子能明显促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和血管新生,并且具有剂量依赖性;(2)与模型组相比,碱性成纤维细胞生长因子能明显促进创面的愈合,下调创面组织中的细胞凋亡率;降低大鼠血清中丙二醛和肿瘤坏死因子α水平,升高超氧化物歧化酶和白细胞介素10水平;促使创面组织中巨噬细胞向M2型转换,上调创面组织中增殖细胞核抗原、CD31和血管内皮生长因子的表达;抑制创面组织中Notch1、Jagged1的表达,并且均具有剂量依赖性。丙戊酸可部分逆转碱性成纤维细胞生长因子对创面愈合的促进作用。结果表明,碱性成纤维细胞生长因子能明显促进创面愈合与肉芽再生以及诱导巨噬细胞向M2型转换,这可能与调控Notch1/Jagged1信号有关。

静态磁场通过激活FGFR1/JAK2/STAT3信号通路促进皮肤成纤维细胞的增殖活性和迁移表型

目的:通过体外实验探讨静态磁场(SMF)对皮肤成纤维细胞增殖活性和迁移表型的调控作用与潜在机制。方法:将人皮肤成纤维细胞(HSFs)分为5组,包括对照组、SMF组、SMF+阿魏酸组、SMF+芦可替尼组、SMF+Stattic组。对照组为正常培养的HSFs;SMF组的HSFs细胞暴露于1mT的SMF中。其余三组分别将FGFR1、JAK2、STAT3的抑制剂(3μmoL/L阿魏酸、3nmoL/L芦可替尼、20μmoL/L的Stattic)与HSFs一起预培养,并暴露于1mT的SMF中,所有组均处理24h。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)分析细胞的增殖活性。用ELISA试剂盒法检测人类B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(BAX)的水平。用Western blot检测凋亡标志蛋白cleaved-caspase3及FGFR1、JAK2、STAT3、磷酸化的(p)-FGFR1、p-JAK2、p-STAT3的表达以及细胞迁移相关表型高迁移率组蛋白1(HMGB1)、波形蛋白(vimentin)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2的表达。结果:与对照组比,SMF组的细胞增殖活性增加,BAX的水平减少,cleaved-caspase3的蛋白表达水平下调,p-FGFR1、p-JAK2、p-STAT3、HMGB1、vimentin、VEGFA、MMP-9、MMP-2的表达水平均显著上调(均P<0.05)。与SMF组比,SMF+阿魏酸组的细胞增殖活性降低,BAX的水平增加,cleaved-caspase3的蛋白表达水平上调,而p-FGFR1、p-JAK2、p-STAT3、HMGB1、vimentin、VEGFA、MMP-9、MMP-2的表达均显著下调(均P<0.05)。与SMF组比,SMF+芦可替尼组的细胞增殖活性降低,BAX的水平增加,cleaved-caspase3的蛋白表达水平上调,JAK2、p-JAK2、p-STAT3、HMGB1、vimentin、VEGFA、MMP-9、MMP-2的表达水平均显著下调(均P<0.05)。与SMF组比,SMF+Stattic组的细胞增殖活性降低,BAX的水平增加,cleaved-caspase3的蛋白表达水平上调,STAT3、p-STAT3、HMGB1、vimentin、VEGFA、MMP-9、MMP-2的表达水平均显著下调(均P<0.05)。结论:SMF通过激活FGFR1/JAK2/STAT3信号通路促进皮肤成纤维细胞的增殖活性和迁移表型。

二甲双胍阻断乳腺癌细胞-间质细胞的交互作用:基于抑制肿瘤相关成纤维细胞缺氧诱导因子-1α的表达

目的探讨二甲双胍(Met)对乳腺癌肿瘤-间质细胞交互作用的影响及机制。方法将肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)与乳腺癌细胞共培养,运用二甲双胍进行干预,分为对照组和Met干预组,ELISA及RT-qPCR检测Met对CAFs中HIF-1α、p-AMPK、基质衍生因子-1(SDF-1)和白细胞介素-8(IL-8)等因子的表达变化以及Transwell检测肿瘤细胞侵袭能力的变化。运用外源性SDF-1、IL-8干预后,Transwell检测肿瘤细胞侵袭能力的变化。运用缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)shRNA或过表达质粒调节CAFs-HIF-1α的表达,以及AMPK-shRNA抑制AMPK的表达,并运用OG和2-OXO调节脯氨酸羟化酶的表达,及运用外源性TGF-β1干预后,Western blot及RT-qPCR检测CAFs中p-AMPK、HIF-1α、SDF-1、IL-8的表达,Transwell检测肿瘤细胞侵袭能力的变化。结果相较于对照组,Met干预组中CAFs的p-AMPK、SDF-1和IL-8的表达水平升高(P<0.05),HIF-1α表达水平下降(P<0.05),AMPK的表达水平差异无统计学意义(P>0.05),Met组中乳腺癌细胞侵袭能力下降(P<0.05)。外源性SDF-1、IL-8干预可降低Met对乳腺癌细胞侵袭的抑制作用,增加乳腺癌细胞的侵袭能力(P<0.05)。过表达HIF-1α及运用脯氨酸羟化酶抑制剂OG提高HIF-1α的表达后,可降低Met对CAFs中HIF-1α、SDF-1及IL-8表达的抑制作用,并可降低Met对乳腺癌细胞侵袭的抑制作用(P<0.05);运用HIF-1α-shRNA及运用脯氨酸羟化酶激活剂2-OXO抑制HIF-1α的表达后,降低乳腺癌细胞的侵袭能力(P<0.05);运用AMPK-shRNA抑制p-AMPK的表达后,可降低Met对CAFs中HIF-1α表达的抑制作用,并可降低Met对乳腺癌细胞侵袭的抑制作用(P<0.05);加入外源性TGF-β1后,可部分降低Met对CAFs中HIF-1α表达的抑制作用,并可部分降低Met对乳腺癌细胞侵袭的抑制作用(P<0.05)。结论Met通过抑制CAFs-HIF-1α的表达进而发挥阻断乳腺癌细胞-间质细胞交互作用。

CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用

【目的】探究环形RNA circSLC8A1_005调控心肌成纤维细胞纤维化表型的作用及可能机制。【方法】利用腺病毒介导在小鼠心肌成纤维细胞(mCFs)中过表达circSLC8A1_005,并检测mCFs中纤维化相关因I型胶原α1链(Col1a1)、Ⅲ型胶原α1链(Col3a1)和平滑肌肌动蛋白α2(Acta2)基因表达,通过EdU和划痕实验检测不同干预对mCFs的增殖和迁移能力的影响。双萤光素酶报告基因实验检测circSLC8A1_005包含的潜在核糖体进入序列(IRES)的活性。通过Western blot实验检测circSLC8A1_005翻译蛋白SLC8A1-605aa及其在细胞内分布情况。双萤光素酶报告基因实验检测SLC8A1-605aa对超氧化物歧化酶2(Sod2)的转录激活作用。通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验检测SLC8A1-605aa与Sod2 mRNA的结合作用。放线菌素D实验检测SLC8A1-605aa对Sod2 mRNA稳定性的影响。【结果】利用腺病毒可在mCFs中有效介导过表达circSLC8A1_005,过表达circSLC8A1_005可显著抑制mCFs中纤维化相关基因表达,抑制mCFs的增殖和迁移能力。双萤光素酶报告基因实验结果提示circ⁃SLC8A1_005包含的2个IRES具有活性。Western blot检测结果显示circSLC8A1_005可翻译预期大小为70 ku的SLC8A1-605aa蛋白,并主要分布于细胞核内。过表达SLC8A1-605aa和circSLC8A1_005可一致地抑制mCFs的纤维化表型。SLC8A1-605aa可特异上调超氧化物歧化酶2(Sod2)表达,但并不能转录激活Sod2表达;RIP实验结果显示SLC8A1-605aa与Sod2 mRNA有特异结合作用,而放线菌素D实验结果显示SLC8A1-605aa能够增强Sod2 mRNA的稳定性。【结论】CircSLC8A1_005通过翻译蛋白SLC8A1-605aa发挥抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用,SLC8A1-605aa可能是潜在的用于心肌纤维化治疗的靶点。

LncRNA FEZF1-AS1靶向调控miR-200c-3p对人肺成纤维细胞生物学行为的影响

目的探讨FEZ家族锌指1-反义RNA1(LncRNA FEZF1-AS1)靶向调控miR-200c-3p对人肺成纤维细胞HLF生物学行为的影响。方法采用转化生长因子β1(TGF-β1)诱导HLF向肌成纤维细胞转化,分为空白对照组(Blank组)和造模组(HLF+TGF-β1组),另根据转染质粒不同将细胞分为Blank组、TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC组和TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1组。采用Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)和波形蛋白(Vimentin)蛋白的表达。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测LncRNA FEZF1-AS1和miR-200c-3p的表达。采用CCK-8法检测细胞增殖,细胞划痕实验检测迁移能力,Transwell实验检测侵袭能力;采用双萤光素酶实验检测FEZF1-AS1与miR-200c-3p的靶向作用关系。结果与Blank组比较,HLF+TGF-β1组α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin蛋白表达及LncRNA FEZF1-AS1表达水平升高,miR-200c-3p表达水平降低(P<0.05);与TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC组比较,TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1组细胞增殖、迁移、侵袭能力下降,LncRNA FEZF1-AS1表达及α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin蛋白表达水平降低,miR-200c-3p表达水平升高(P<0.05);FEZF1-AS1与miR-200c-3p基因序列上存在结合位点。结论LncRNA FEZF1-AS1通过抑制miR-200c-3p促进特发性肺间质纤维化的发生、发展。

年轻干细胞抗原-1阳性骨髓干细胞调控年老小鼠心脏成纤维细胞凋亡的分子机制

目的探讨Sca-1骨髓干细胞对小鼠心脏成纤维细胞(CFC)凋亡的影响,阐明年轻Sca-1骨髓干细胞调控心脏成纤维细胞凋亡的潜在分子机制及其优势。方法比较年轻与年老心脏成纤维细胞在缺氧条件下,细胞凋亡及细胞存活率。将Sca-1骨髓干细胞与年老心脏成纤维细胞共培养。通过TUNEL染色、q RT-PCR、Western Blot、CCK8试剂盒分别检测年轻或年老Sca-1骨髓干细胞对年老心脏成纤维细胞凋亡及存活的影响。通过qRT-PCR、ELISA检测年轻与年老小鼠Sca-1骨髓干细胞旁分泌生长因子并鉴定其功能。结果随年龄增加,年老小鼠心脏成纤维细胞凋亡增加,细胞存活减少。与年老细胞相比,年轻Sca-1骨髓干细胞可明显减少年老心脏成纤维细胞凋亡,增加细胞存活。机制研究发现,与年老细胞相比,年轻Sca-1骨髓干细胞可旁分泌更多的生长和分化因子5(GDF5)(P<0.05)。中和GDF5后,使年轻Sca-1骨髓干细胞失去对年老成纤维细胞凋亡及存活的调控作用。结论年轻Sca-1骨髓干细胞可通过旁分泌GDF5减少年老心脏成纤维细胞凋亡。

牛磺熊去氧胆酸通过调节内质网应激抑制转化生长因子β1所诱导的心肌成纤维细胞纤维化

目的探讨牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)对转化生长因子β1(TGF-β1)所诱导的心肌成纤维细胞(CFs)活化的作用及相关机制,为TUDCA治疗糖尿病心肌纤维化提供新的治疗目标。方法提取原代SD乳鼠CFs和心肌细胞,通过免疫荧光法鉴定CFs的纯度。分别将高糖培养下的CFs用不同时间的TGF-β1干预,用Western blot检测内质网应激(ERS)通路相关蛋白和纤维化指标的表达,探讨TGF-β1对CFs活化及ERS相关通路的影响。用Western blot检测CFs和心肌细胞内同型半胱氨酸内质网应激泛素样结构域1(Herpud1)的表达情况。通过沉默Herpud1的表达及用Transwell和Western blot检测沉默Herpud1后CFs纤维化指标的表达,探讨Herpud1在TGF-β1诱导的CFs活化中的作用。用CCK-8检测不同浓度的TUDCA处理下CFs的活力。用免疫荧光和Western blot检测TUDCA对TGF-β1诱导的CFs中Herpud1、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录激活因子6(ATF6)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)和Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)表达的影响。为进一步明确Herpud1在TUDCA抑制CFs活化中的作用,用Western blot检测过表达Herpud1后相关蛋白的表达情况。结果在成功构建CFs纤维化模型的基础上,TGF-β1能够诱导CFs活化及ERS通路相关蛋白的表达;Herpud1在CFs中的表达高于心肌细胞;敲除Herpud1可抑制TGF-β1所诱导的CFs活化;TUDCA能显著降低TGF-β1诱导的CFs中GRP78、ATF6、α-SMA、Vimentin和CollagenⅠ的表达水平;此外,过表达Herpud1还可逆转TUDCA对TGF-β1诱导的CFs活化的抑制。结论下调Herpud1基因的表达是TUDCA抑制TGF-β1诱导的CFs纤维化的机制之一。

圣草酚对TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞增殖、氧化应激反应及TGF-β1/Smad信号通路活化的影响

目的 探讨圣草酚对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人皮肤成纤维细胞(HSF)的增殖、氧化应激反应及TGF-β1/Smad信号通路活化的影响。方法 将HSF分为对照组、模型组、圣草酚低剂量组、圣草酚中剂量组、圣草酚高剂量组、SB-431542组。对照组不做任何处理,模型组用5.0 ng/mL TGF-β1干预24 h,圣草酚低剂量组、圣草酚中剂量组、圣草酚高剂量组分别用40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L圣草酚和5.0 ng/mL TGF-β1同时干预24 h,SB-431542组用10μmol/L SB-431542和5.0 ng/mL TGF-β1同时干预24 h。检测各组HSF细胞活力、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平、活性氧簇(ROS)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性,TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(Co lⅢ)、基质金属蛋白酶2(MMP2)的mRNA表达量及TGF-β1的蛋白表达水平。检测对照组、模型组、圣草酚中剂量组HSF的Smad2、Smad3、磷酸化Smad2 (p-Smad2)、磷酸化Smad3 (p-Smad3)蛋白表达水平。结果 与对照组相比,模型组的HSF细胞活力及α-SMA蛋白表达水平增加,ROS含量增加而SOD活性降低,TGF-β1、α-SMA、ColⅠ、Co lⅢ和MMP2 mRNA表达量上调,TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3的蛋白表达量亦上调(P<0.05)。与模型组相比,圣草酚各剂量组和SB-431542组HSF细胞活力降低、ROS含量降低、SOD活性增强,且α-SMA、ColⅠ、Co lⅢ、MMP2的mRNA表达量和TGF-β1蛋白表达量下调,圣草酚中剂量组、圣草酚高剂量组和SB-431542组HSF细胞中α-SMA蛋白表达水平降低,圣草酚中剂量组及SB-431542组Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达量下调(P<0.05)。圣草酚低剂量组、圣草酚中剂量组、圣草酚高剂量组HSF细胞活力、α-SMA蛋白表达水平、ROS含量依次降低,SOD活性依次增强,α-SMA、ColⅠ、Co lⅢmRNA表达量依次降低(P<0.05)。结论 圣草酚可能通过抑制氧化应激反应及TGF-β1/Smad通路的活化,从而剂量依赖性地抑制TGF-β1诱导的HSF细胞纤维化。

基于成纤维细胞生长因子1的药物治疗肥胖相关并发症

目前,超重和肥胖的发生率已在全球范围内达到流行病的程度,这对慢性代谢性疾病预防和控制造成了巨大挑战。肥胖是包括2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、心血管病、神经退行性疾病、睡眠呼吸暂停和某些类型的癌症等在内的一系列代谢疾病的主要危险因素。然而,治疗肥胖及其相关并发症的药物选择仍然有限,大多数抗肥胖药物因严重不良反应而退出市场,迫切需要开发有效的长期治疗方法来应对肥胖相关并发症。成纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor 1,FGF1)是全身能量稳态、糖脂代谢和胰岛素敏感性的重要调节因子。FGF1对于肥胖及2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、癌症、心脏病等肥胖相关并发症具有一定的治疗益处,但长期使用导致的肿瘤发生风险增加限制了其应用。本综述总结了基于FGF1治疗肥胖相关并发症的生物药物开发的最新进展,强调了临床实施中的主要挑战,并讨论了克服这些障碍的可能策略。

SCRN1在口腔鳞状细胞癌肿瘤相关成纤维细胞中的表达及对HSC3细胞株生物学特性的影响

目的:探究胞吐作用相关蛋白(SCRN1)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)中的表达及对CAFs分泌MMP2功能的影响,进一步研究CAFs对HSC3细胞株迁移、侵袭能力的影响。方法:通过免疫组织化学染色(IHC)检测SCRN1在OSCC组织及癌旁组织中的表达。原代培养、分离、纯化、验证正常成纤维细胞(NFs)和CAFs,用免疫细胞化学染色法(ICC)、蛋白免疫印迹(WB)、qRT-PCR检测NFs、CAFs中SCRN1的表达情况。CCK-8、Transwell实验检测NFs、CAFs及CAFs-shSCRN1增殖、迁移及侵袭能力。收集NFs、CAFs上清并用ELISA和明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶2(MMP2)水平及活性,然后分别与HSC3细胞株共培养,探究两种上清共培养对HSC3细胞株迁移、侵袭能力的影响。沉默CAFs的SCRN1基因后,收集CAFs、CAFs-shSCRN1和CAFs-Vector上清并检测MMP2水平及活性,然后分别与HSC3共培养,探究三种上清培养条件对HSC3细胞株迁移、侵袭能力的影响。结果:SCRN1在OSCC组织中阳性表达率及表达水平较高。成功分离、培养、鉴定NFs和CAFs, CAFs较NFs表达更高水平的SCRN1,且其增殖、迁移、侵袭能力均较NFs强。沉默SCRN1能够降低CAFs增殖、迁移及侵袭能力。CAFs上清分泌更高水平和活性的MMP2,与HSC3细胞株共培养可明显促进HSC3细胞株迁移、侵袭能力。沉默SCRN1后的CAFs上清中MMP2水平和活性降低,其促进HSC3细胞株迁移、侵袭能力也明显减弱。结论:SCRN1可调控CAFs分泌MMP2,在肿瘤微环境中,促进HSC3细胞株迁移和侵袭能力。

激活的肺动脉成纤维细胞Piezo1通道通过活化p38-MAPK促进IL-6分泌诱发肺动脉高压的研究

目的利用大鼠肺动脉成纤维细胞探讨机械敏感Piezo1通道与IL-6分泌的关系,分析Piezo1通道在肺动脉高压(PAH)发展过程中的作用机制。方法利用组织块法获取成年SD大鼠肺动脉组织并分离培养肺动脉成纤维细胞;将细胞分为对照组和流体剪切力组,用流体剪切力系统在12 dyn/cm 2条件下培养流体剪切力组细胞24 h,对照组不做额外处理;利用Western blot和PCR技术分别检测对照组和流体剪切力组细胞Piezo1蛋白和mRNA水平;将肺动脉成纤维细胞分为PBS组、Yoda1组和Yoda1+Dooku1组并分别加入10μM PBS、Yoda1和Yoda1+Dooku1培养24 h,24 h后利用检测各组细胞IL-6蛋白和mRNA水平;取Yoda1组细胞分为PBS组、ERK抑制剂组、JNK抑制剂组和p38MAPK抑制剂组分别加入PBS、ERK抑制剂(PD98059,10μM)、JNK抑制剂(SP600125,10μM)和p38 MAPK抑制剂(SB203580,5μM),培养24 h后检测IL-6 mRNA水平;在PBS组、Yoda1组和Yoda1+Dooku1组细胞进行对应处理10 min后检测磷酸化p38 MAPK蛋白水平。结果成功分离培养大鼠肺动脉成纤维细胞;12 dyn/cm 2流体剪切力环境培养24 h后,相较于对照组,流体剪切力组细胞中Piezo1蛋白和mRNA水平均显著升高(P<0.05)。PBS组、Yoda1组和Yoda1+Dooku1组细胞培养24 h后,相较于PBS组和Yoda1+Dooku1组,Yoda1组细胞IL-6蛋白和mRNA水平均显著增高(P<0.05),相较于PBS组,Yoda1+Dooku1组细胞IL-6蛋白和mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。相较于PBS组、ERK抑制剂组和JNK抑制剂组,p38 MAPK抑制剂组IL-6 mRNA水平受到抑制而显著降低(P<0.05),但PBS组、ERK抑制剂组和JNK抑制剂组IL-6 mRNA水平两两相比差异均无统计学意义(P>0.05)。PBS组、Yoda1组和Yoda1+Dooku1组细胞培养10 min后各组磷酸化p38 MAPK水平显示,相较于PBS组,Yoda1组磷酸化p38水平显著升高(P<0.05),而Yoda1+Dooku1组磷酸化p38水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论血管内流体剪切力改变可上调并激活肺动脉成纤维细胞Piezo1的表达,介导Ca 2+内流活化p38 MAPK通路促进IL-6的分泌,进一步导致血管重塑,加快PAH进程。

TEAD1在小鼠急性心肌梗死后心肌成纤维细胞中的表达

目的观察转录因子TEAD1在小鼠急性心肌梗死后心肌成纤维细胞中的表达情况,为探究其作用机制提供理论基础。方法取40只SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分为急性心肌梗死组(AMI组)和假手术组(Sham组),术后以普通饲料喂养至1、3、7、14 d处死并取材。本研究以实时心电图变化、TTC染色判断造模是否成功,使用蛋白印迹法检测心脏中TEAD1的表达情况,使用TEAD1免疫荧光和麦胚凝集素(WGA)染色双标法检测TEAD1在心肌组织中的表达情况,使用免疫荧光双标法检测TEAD1在心肌成纤维细胞中的表达情况。结果与Sham相比,AMI组第3天和第7天TEAD1在心脏中表达明显增加(P<0.05),AMI组各天数梗死交界区TEAD1表达量明显增加(P<0.05),呈现先增后减的趋势,且第3天表达量最多,各相邻天数TEAD1的表达量之间差异均具有统计学意义(P<0.05);免疫荧光双标结果显示转录因子TEAD1在急性心肌梗死后心肌组织的心肌成纤维细胞中呈现高表达,且相较于Sham组,AMI组表达TEAD1的心肌成纤维细胞数量在急性心肌梗死后明显增加(P<0.05),以第7天和第14天较多,并主要在梗死交界区表达。结论TEAD1在急性心肌梗死后心肌组织中梗死交界区表达明显增加,且在心肌成纤维细胞中呈现高表达。

酸性成纤维细胞生长因子调控Ang1/Tie2信号通路抑制炎症促进血管内皮细胞功能恢复

目的:探讨酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)功能的影响,以及Ang1/Tie2通路在其中的作用。方法:培养HUVEC细胞,不同浓度脂多糖(LPS)和aFGF刺激HUVEC,CCK-8实验确定刺激浓度,并观察生长活性;细胞划痕实验检测aFGF对HUVEC迁移能力的影响;Westernblot实验检测增殖蛋白PCNA,凋亡蛋白Cleavedcaspase3、Bax,抗凋亡蛋白Bcl2,炎症相关蛋白NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4和IL-10,血管生成相关蛋白CD31和通路相关蛋白Ang1、Tie2的表达水平;免疫荧光实验检测PCNA、Cleavedcaspase3、IL-6、IL-10以及CD31的荧光强度。分离小鼠主动脉,离体培养后进行免疫荧光实验,观察PCNA、Cleavedcaspase3、IL-6、IL-10以及CD31蛋白的荧光强度。结果:CCK-8实验显示LPS抑制HUVEC生长活性,5μg/mL为最适刺激浓度(P<0.01);aFGF促进HUVEC生长活性,其中100ng/mL为最适刺激浓度(P<0.01)。细胞划痕实验提示aFGF促进细胞迁移。Westernblot和免疫荧光实验结果显示,aFGF促进增殖蛋白和血管功能蛋白表达,抑制凋亡蛋白和炎症蛋白表达,上调Ang1/Tie2通路蛋白(P<0.05)。离体血管免疫荧光实验显示aFGF上调PCNA、IL-10以及CD31的荧光强度,下调Cleavedcaspase3和IL-6的荧光强度(P<0.05)。结论:aFGF增强HUVEC生长活性和迁移能力,促进其增殖,抑制其凋亡,并通过调控Ang1/Tie2通路抑制炎症反应,促进血管功能修复。

柚皮素通过TGF-β1/Smad通路抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移和胶原合成

目的探讨柚皮素(Nar)对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)增殖、迁移和胶原合成的调控作用和分子机制。方法将KFs分为对照组和Nar组。对照组常规培养,Nar组以10、25、50、100、150μmol/L浓度的Nar对细胞进行干预。利用CCK-8实验分析不同浓度下Nar对KFs增殖的影响;细胞划痕实验检测Nar 50μmol/L组对KFs迁移能力的影响;Western blot检测Nar 10、25、50μmol/L组对KFs表达Col-1、FN、α-SMA、MMP9蛋白表达水平的影响,以及Nar对TGF-β1诱导后KFs表达Smad2/3、p-Smad2/3蛋白水平的影响。结果CCK-8实验结果显示,与对照组相比,给予Nar 50μmol/L以上浓度时,KFs增殖能力受到明显抑制(P<0.05)。细胞划痕实验显示给予Nar 50μmol/L时,KFs迁移能力受到显著抑制(P<0.01)。Western blot显示50μmol/L Nar可下调Col-1、FN、α-SMA、MMP9蛋白表达,并且可下调TGF-β1诱导后p-Smad2/3蛋白表达(均P<0.05)。结论Nar可能通过下调TGF-β1/Smad信号通路抑制KFs增殖、迁移和胶原合成。

微小RNA-199a-3p对小鼠皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制作用及其机制

目的 探讨微小RNA-199a-3p(miR-199a-3p)对小鼠皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞的调控作用及其作用靶基因。方法 构建小鼠皮肤瘢痕疙瘩模型,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-199a-3p、瘢痕疙瘩相关基因和Smad1的mRNA表达。原代分离和体外培养成体C57BL/6小鼠皮肤成纤维细胞;利用脂质体将miR-199a-3p模拟物和Smad1 siRNA转染至小鼠皮肤成纤维细胞中;双荧光素酶报告实验验证miR-199a-3p的靶基因;Cell Counting Kit-8(CCK8)方法验证miR-199a-3p和沉默Smad1对皮肤成纤维细胞增殖的影响;RT-qPCR和Western blot法分别检测过表达miR-199a-3p皮肤成纤维细胞的瘢痕疙瘩相关基因和Smad1的mRNA和蛋白表达;Western blot检测小鼠皮肤成纤维细胞分别转染Smad1 siRNA和miR-199a-3p模拟物后瘢痕疙瘩相关基因、Smad1的蛋白表达。结果 疤痕疙瘩组织中瘢痕疙瘩相关基因Col1a1(t=-3.334,P=0.016)、Col3a1(t=-5.927,P=0.001)和ACTA2(t=-3.673,P=0.010)mRNA表达和Smad1(t=-4.403,P=0.010)表达显著高于正常小鼠皮肤组织,而miR-199a-3p(t=7.059,P<0.001)表达显著下降。在皮肤成纤维细胞中过表达miR-199a-3p可以抑制瘢痕疙瘩的相关基因Col1a1(t=5.514,P=0.005)、Col3a1(t=5.132,P=0.014)和ACTA2(t=4.136,P=0.026)mRNA表达和相关蛋白Col1a1(t=4.643,P=0.001)、Col3a1(t=6.554,P=0.003)和α-SMA(t=4.681,P=0.008)表达。miR-199a-3p与Smad1 3′-UTR有结合作用。过表达miR-199a-3p抑制Smad1 mRNA(t=3.556,P=0.024)和蛋白(t=3.781,P=0.019)的表达。分别转染miR-199a-3p模拟物和Smad1 siRNA后均能同时抑制小鼠皮肤成纤维细胞的增殖(F=18.622,P<0.001、<0.001)和瘢痕疙瘩的相关蛋白Col1a1(F=18.804,P=0.003、0.022)、Col3a1(F=33.212,P=0.001、0.001)和α-SMA(F=10.181,P=0.020、0.028)表达。结论 miR-199a-3p通过靶向Smad1抑制瘢痕疙瘩的形成。

力学拉伸通过STAT3/HIF-1a/PDK1轴介导角膜成纤维细胞糖酵解相关酶的表达

目的圆锥角膜是眼科临床常见的致盲疾病,具体发病机制尚不完全清楚,其中力学微环境变化不可忽略。研究表明圆锥角膜的发生可能和细胞能量代谢异常有关。探讨力学刺激对角膜成纤维细胞糖酵解相关酶表达的影响及其调控途径,可为深入理解圆锥角膜的发生发展机制提供新思路。方法通过FX5000系统对人角膜成纤维细胞施加频率0.1 Hz、幅度为15%的周期性力学牵拉;采用RNA干扰技术敲低STAT3和HIF-1α,用western blotting和q-PCR检测糖酵解相关酶的表达。结果力学拉伸可促进PDK1、糖酵解相关酶(GLUT1、HK2、LDH等)及STAT3、HIF-1α的表达。单独敲低STAT3或HIF-1α可显著下调PDK1、HK2、LDH的表达。敲低STAT3或HIF-1α后联合机械拉伸作用,则可显著上调HIF-1α和PDK1、GLUT1的表达。结论力学刺激通过STAT3/HIF-1α/PDK1途径调控了角膜成纤维细胞糖酵解相关酶的表达,可能会促进圆锥角膜的发生发展。