电针血清对多裂肌卫星细胞增殖及Pax-7、成肌分化抗原、磷酸化蛋白激酶B表达的影响

目的:观察电针血清对大鼠多裂肌卫星细胞增殖及Pax-7、成肌分化抗原(MyoD)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达的影响,从血清学角度探讨电针促进多裂肌损伤修复的部分作用机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、电针委中组、电针肾俞组,每组各8只,采用0.5%布比卡因肌肉注射复制多裂肌损伤模型,各电针组分别选取"委中"穴、"肾俞"穴进行电针治疗,每日1次,每次20min,4d后收集血清。原代培养大鼠腰多裂肌卫星细胞并进行鉴定,随机分为正常血清组、模型血清组、电针委中血清组、电针委中血清+LY 294002组、电针肾俞血清组、电针肾俞血清+LY 294002组,分别以各组血清培养24h,CCK-8、EdU法观察肌卫星细胞的增殖,Western blot法检测肌卫星细胞Pax-7、MyoD、p-Akt蛋白表达。结果:与正常血清组相比,模型血清组多裂肌卫星细胞增殖速度明显加快(P<0.01),两电针血清组又高于模型血清组(P<0.01)。与正常血清组相比,模型血清组MyoD、p-Akt表达明显升高(P<0.05),两电针血清组高于模型血清组(P<0.05,P<0.01)。与电针血清组相比,加LY 294002后,细胞增殖速度及MyoD、p-Akt表达均显著下降(P<0.01,P<0.05)。各组之间Pax-7蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:电针"委中"血清和电针"肾俞"血清均可通过磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B通路促进肌卫星细胞的增殖,且有促进成肌分化的趋势。

电针对失神经大鼠腓肠肌中叉头蛋白转录因子3A/肌萎缩F-box蛋白及成肌分化抗原的影响

目的:观察电针干预对失神经肌萎缩大鼠腓肠肌中叉头蛋白转录因子3A(fork-head protein,FOXO3A)、肌萎缩F-box蛋白(muscle atrophy F-box,MAFbx)和成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,Myod1)蛋白及基因表达的影响,探讨电针延缓大鼠失神经肌萎缩的可能机制。方法:雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、模型组及电针组,每组6只。采用钳夹坐骨神经法制备大鼠失神经腓肠肌萎缩模型。电针组选取大鼠术侧"足三里""环跳"穴进行治疗,每日1次,每次10min,连续干预14d后取材。计算各组大鼠腓肠肌湿重比,HE染色测定大鼠术侧腓肠肌纤维截面积和直径,Western blot检测大鼠术侧腓肠肌中FOXO3A、MAFbx、Myod1蛋白的相对表达量,实时荧光定量PCR检测大鼠术侧腓肠肌中FOXO3A、MAFbx及Myod1mRNA的相对表达量。结果:与假手术组相比,模型组大鼠腓肠肌湿重比、肌纤维截面积和直径均显著下降(P<0.01),电针组高于模型组(P<0.01)。与假手术组相比,模型组大鼠腓肠肌中FOXO3A、MAFbx、Myod1蛋白及mRNA表达量显著升高(P<0.01);与模型组相比,电针干预后FOXO3A、MAFbx蛋白及mRNA表达量显著降低(P<0.01),Myod1蛋白及mRNA表达量显著升高(P<0.01)。结论:电针可能通过抑制FOXO3A、MAFbx的表达同时上调Myod1的表达,影响骨骼肌蛋白水解的速率和肌卫星细胞分化的水平,在延缓失神经肌萎缩的同时促进肌萎缩修复。

电针血清对饥饿条件下肌卫星细胞成肌分化抗原及自噬蛋白Beclin 1表达的影响

目的:观察电针血清对饥饿条件下肌卫星细胞成肌分化抗原(Myod)及自噬相关蛋白Beclin 1表达的影响,探讨电针调控肌卫星细胞增殖及自噬的机制。方法:电针"委中"穴7 d后获取并制备不同浓度电针血清。分别以不同浓度(10%、20%、30%)的电针血清及10%胎牛血清对体外培养的原代肌卫星细胞干预12 h及24 h,CCK-8法检测各组细胞不同时间点的增殖情况,确定促进细胞增殖的最佳血清浓度。以无血清培养基培养原代肌卫星细胞12 h后,将细胞随机分为无血清组、10%胎牛血清组、最佳浓度电针血清组,分别加入相应浓度的血清。Western blot法检测不同血清干预12 h和24 h后原代肌卫星细胞中细胞增殖蛋白Myod及自噬蛋白Beclin 1的表达水平。结果:10%电针血清、20%电针血清、30%电针血清干预24 h后,肌卫星细胞增殖能力均优于10%胎牛血清(P<0. 01),但3个浓度电针血清之间的肌卫星细胞增殖能力无明显差异(P>0. 05),故取10%电针血清作为最佳浓度。Western blot结果显示:血清干预12 h后,无血清组肌卫星细胞中Myod及Beclin 1表达水平与干预前比较差异无统计学意义(P>0. 05),10%胎牛血清组、10%电针血清组Myod表达水平较干预前升高(P<0. 05)、Beclin 1表达水平较干预前降低(P<0. 05);与同时点无血清组比较,10%胎牛血清组、10%电针血清组Myod表达水平升高(P<0. 05)、Beclin 1表达水平降低(P<0. 01)。血清干预24 h后,无血清组Myod及Beclin 1表达水平较12 h时明显降低(P<0. 01),10%胎牛血清组、10%电针血清组Myod表达水平较12 h时升高(P<0. 05)、Beclin 1表达水平较12 h时降低(P<0. 05);与同时点无血清组比较,10%胎牛血清组、10%电针血清组Myod及Beclin 1表达水平均升高(P<0. 01,P<0. 05)。结论:饥饿条件下电针血清可改善肌卫星细胞的营养不良环境,抑制其凋亡趋势,促进肌卫星细胞增殖,这种作用可能是通过改善细胞的过度自噬实现的。

斜刺阿是穴对股四头肌损伤小鼠肌卫星细胞成肌分化抗原/生肌转录因子的影响

目的:观察斜刺阿是穴对股四头肌损伤小鼠自主活动、细胞形态及肌卫星细胞成肌分化抗原(MyoD1)、生肌转录因子(Pax7)的影响。方法:24只C57BL/6雄性小鼠随机分为空白组、模型组、浅刺组、深刺组,每组6只。采用单次肌注0.5%布比卡因制备股四头肌损伤小鼠模型。造模后24 h两治疗组采用斜刺阿是穴干预治疗,浅刺组入针至触碰到受损肌肉表面,深刺组顺着肌纤维穿过股四头肌损伤肌腹,均提插3次,不留针,治疗1次。造模24 h后和治疗24 h后对各组小鼠进行爬杆实验,HE染色法观察小鼠股四头肌组织病理形态变化,免疫组织化学法观察小鼠股四头肌组织中MyoD1、Pax7的阳性表达。结果:与本组治疗前比较,两斜刺组小鼠治疗后爬杆实验得分明显升高(P<0.01)。与空白组比较,模型组小鼠爬杆实验得分明显降低(P<0.01),股四头肌MyoD1、Pax7表达明显升高(P<0.01)。与模型组比较,两斜刺组小鼠爬杆实验得分及股四头肌MyoD1、Pax7表达明显升高(P<0.01)。与浅刺组比较,深刺组爬杆实验得分及股四头肌MyoD1、Pax7表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。模型组出现大面积炎性浸润,肌细胞肿大、萎缩、破裂、变性坏死,细胞大小不一、形态各异,间隔变大,核聚集、深染、固缩,伴出血;两斜刺组有不同程度的改善。结论:斜刺阿是穴能有效促进损伤股四头肌的良性修复,促进小鼠运动能力的恢复,且深刺较浅刺效果更佳,其机制可能与上调MyoD1和Pax7的表达有关。

成肌分化抗原相关长链非编码RNA对肌生成过程作用的研究进展

骨骼肌的分化发育是一个由多种功能性因子参与协同作用的复杂过程,其中成肌分化抗原（MyoD）是较早已经确定的骨骼肌特异转录因子,对肌肉发育有着重要的作用。长链非编码RNA（LncRNA）是具有多种生物学功能但不能编码蛋白质的RNA。近年来,很多研究表明LncRNA在肌肉发育过程中具有重要的调控作用。文章就目前与MyoD共同参与肌细胞增殖、分化、再生过程的相关LncRNA及其相关作用机制进行总结综述,以期为进一步阐明与MyoD相关的LncRNA调控肌肉发育的作用机制提供理论参考。

电针调控miRNA206/HDAC4轴促进损伤多裂肌修复过程中成肌细胞分化的机制

背景:作者前期的动物及细胞实验研究已证明电针可提高损伤腰多裂肌中Pax7 和成肌分化抗原的表达,促进多裂肌的损伤修复。亦有研究证明miRNA206 促进成肌分化主要是通过抑制组蛋白去乙酰化酶4 实现的。目的:观察电针对布比卡因致大鼠腰多裂肌损伤修复过程中miRNA206/组蛋白去乙酰化酶4 表达的影响。方法:实验方案经广东省第二中医院动物实验伦理委员会批准(批准号为048604)。将30 只雄性SD 大鼠随机分为对照组、模型组、电针组,每组10 只。模型组、电针组采用0.5%布比卡因肌内注射复制大鼠多裂肌损伤模型;对照组予注射等量生理盐水。对照组与模型组不进行针刺干预,电针组予针刺双侧委中穴、肾俞穴,针刺后连接电针,波形选用疏密波,电针频率采用2 Hz/10 Hz,电流强度选择1 mA,持续治疗20 min,每天治疗1 次,共治疗7 d。干预7 d 后,通过苏木精-伊红染色观察损伤部位多裂肌形态学变化,采用qRT-PCR检测多裂肌中miRNA206 的表达量,Western-blot 检测多裂肌中成肌分化抗原、Myogenin 及组蛋白去乙酰化酶4 蛋白的表达。结果与结论:①苏木精-伊红染色显示,7 d 后,对照组可见视野中骨骼肌纤维大部分排列整齐,无明显破坏及巨噬细胞浸润;模型组视野内可见大量肌纤维被破坏,但出现部分肌纤维修复,巨噬细胞数量仍较多;电针组新生肌纤维较多,巨噬细胞较模型组减少;②Western-blot 结果显示,7 d 后,模型组成肌分化抗原、Myogenin、组蛋白去乙酰化酶4 蛋白表达均较对照组升高(P < 0.05 或P < 0.01);电针组成肌分化抗原、Myogenin 蛋白表达较模型组升高(P < 0.01),组蛋白去乙酰化酶4 蛋白较模型组降低(P < 0.01);③qRT-PCR结果显示,7 d 后,模型组miRNA206 表达高于对照组(P < 0.01),电针组miRNA206 表达高于模型组(P <0.05);④结果说明,电针可促进多裂肌损伤后成肌分化,其作用可能是通过提高miRNA206 表达抑制组蛋白去乙酰化酶4 活性实现的。

电针干预经TGF-β1/Smad3信号通路对失神经肌萎缩大鼠肌卫星细胞分化的影响

目的:观察电针干预对失神经肌萎缩大鼠腓肠肌中转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad3信号通路以及与肌卫星细胞分化密切相关的成肌分化抗原(Myod1)、组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)、微小RNA206(Mir-206)表达的影响,探讨电针延缓失神经肌萎缩发展的可能机制。方法:将24只雄性SD大鼠随机分为假手术组(n=8)、模型组(n=8)和电针组(n=8)。通过横断坐骨神经制备大鼠右后肢失神经肌萎缩模型。造模后对电针组大鼠术侧足三里、环跳穴进行电针干预,每次10 min,每日1次,每周6次,连续4周;假手术组和模型组大鼠不予电针干预。电针干预结束后计算各组大鼠的腓肠肌湿重比、HE染色测定腓肠肌纤维横截面积,实时荧光定量PCR法检测各组大鼠腓肠肌中肌卫星细胞分化相关因子mRNA的相对表达量。结果:4周后,模型组大鼠腓肠肌湿重比、肌纤维横截面积以及术侧腓肠肌中Smad7 mRNA相对表达量均低于假手术组和电针组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组术侧腓肠肌中HDAC4、TGF-β1、转化生长因子β受体1(TGF-βr1)、TGF-βr2、Smad3 mRNA相对表达量均高于假手术组和电针组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组术侧腓肠肌中Myod1、Mir-206 mRNA相对表达量高于假手术组,但低于电针组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:电针干预可能通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路,下调HDAC4mRNA的表达,并上调Myod1、Mir-206 mRNA的表达促进肌卫星细胞的分化,从而延缓大鼠腓肠肌失神经肌萎缩的发展。

PI3K/Akt/mTOR信号通路在大鼠急性骨骼肌钝挫伤修复中的作用

目的:研究PI3K/Akt/mTOR信号通路在大鼠急性骨骼肌钝挫伤修复中的作用及变化趋势,探讨骨骼肌损伤修复的可能生物学机制。方法:SD大鼠随机分为正常对照组和损伤后1 d组、3 d组、5 d组、7 d组、14 d组,每组各6只,采用自制打击装置建立腓肠肌钝挫伤模型。HE染色观察各组腓肠肌的形态结构;免疫印迹检测各组腓肠肌中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的蛋白激酶B(P-Akt Ser473)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(P-mTORSer2448)的蛋白表达量;逆转录实时定量聚合酶链反应检测腓肠肌中成肌分化抗原(MyoD)、肌细胞生成素(MyoG)的mRNA相对表达量。结果:(1)HE染色结果显示:损伤后1 d可见肌细胞变性坏死,炎性细胞浸润;损伤后3 d和5 d可见新生的成肌细胞和肌管;损伤后7 d和14 d可见新生肌细胞和胶原纤维。(2)免疫印迹结果显示:与正常对照组比较,损伤后1 d、3 d、14 d组的各蛋白表达量升高,差异无统计学意义(P>0.05);损伤后5 d组PI3K、Akt、P-Akt Ser473表达量显著升高(P<0.01),mTOR和P-mTORSer2448表达量显著升高(P<0.05);损伤后7 d组PI3K、P-Akt Ser473、mTOR、P-mTORSer2448表达量显著升高(P<0.05),Akt表达量显著升高(P<0.01)。(3)逆转录实时定量聚合酶链反应结果显示:与正常对照组比较,损伤后1 d组Myo D1和MyoG的mRNA表达量显著升高(P<0.05,P<0.01);损伤后3 d、5 d、7 d各组Myo D1和Myo G的mRNA表达量显著升高(P<0.01);损伤后14 d组MyoG的mRNA表达量显著升高(P<0.05),MyoD1的mRNA表达量升高,但无统计学意义(P>0.05)。结论:PI3K/Akt/mTOR信号通路具有时间规律性地正向调控骨骼肌钝挫伤后的自我修复,可以作为临床治疗及科学研究骨骼肌损伤的靶点。

有氧训练大鼠腓肠肌组织微小RNA-133a和肌细胞增强因子2的表达

背景:研究表明微小RNA-133a、肌细胞增强因子2和成肌分化抗原可调解骨骼肌的分化与重塑。目的:观察有氧训练对腓肠肌微小RNA-133a、肌细胞增强因子2和成肌分化抗原表达的影响。方法:将SD大鼠随机分为对照组和有氧训练组,有氧训练组采用大鼠跑台运动模型,而对照组不进行运动训练。训练4,6周后采集各组大鼠腓肠肌组织,并称取腓肠肌的质量,实时定量PCR检测骨骼肌中肌球蛋白、微小RNA-133a、肌细胞增强因子2与成肌分化抗原mRNA的表达,并采用免疫组织化学的方法检测腓肠肌Ⅱ型肌纤截面积的改变。结果与结论:训练4,6周,有氧训练组大鼠腓肠肌的相对质量以及肌球蛋白重链-Ⅱa的表达水平较对照组显著增加(P<0.05或P<0.01),Ⅱ型肌纤维横截面积即显著增大(P<0.05),其微小RNA-133a和肌细胞增强因子2mRNA的表达较对照组显著升高(P<0.05,P<0.01),而成肌分化抗原mRNA的表达在各组间差异均无显著性意义。证实,有氧训练可上调大鼠腓肠肌组织微小RNA-133a、肌细胞增强因子2mRNA的表达。

电针干预对大鼠腓肠肌适应性肥大及肌卫星细胞增殖分化的影响

目的:观察不同时长电针干预对大鼠腓肠肌适应性肥大及腓肠肌中增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达及配对盒转录因子7(Pax 7)、成肌分化抗原(MyoD 1)、肌细胞生成素(MyoG)、肌球蛋白重链-Ⅰ(Myh 7)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad 3mRNA表达的影响,探讨电针诱导骨骼肌适应性肥大的相关机制。方法:SD大鼠随机分为空白对照组、电针2周组、电针4周组和电针8周组,每组6只。除空白对照组,其余3组大鼠予以右侧"足三里"和"环跳"电针干预10min,每日1次,每周6次,分别持续干预2、4和8周。称重后计算各组大鼠腓肠肌湿重比,HE染色后测定腓肠肌肌纤维截面积及直径,免疫荧光标记法观察腓肠肌中PCNA蛋白的表达改变,实时荧光定量PCR法检测腓肠肌中Pax 7、MyoD 1、MyoG、Myh 7、TGF-β1、Smad 3mRNA相对表达量。结果:与空白对照组相比,腓肠肌中PCNA蛋白表达在电针2周组和电针4周组明显增多;大鼠腓肠肌湿重比、肌纤维截面积和直径及腓肠肌Pax 7、MyoD 1、MyoG、Myh 7、TGF-β1mRNA相对表达量随电针干预时间延长呈现先升高后降低的趋势,与空白对照组比较,Pax 7和TGF-β1mRNA相对表达量在干预2周时到达峰值(P<0.01),肌湿重比、肌纤维截面积和直径及MyoD 1、MyoG、Myh 7mRNA相对表达量在干预4周时到达峰值(P<0.01);腓肠肌中Smad 3mRNA相对表达量随电针干预时间延长呈现先下降后上升的趋势,在电针4周组到达低峰(P<0.01)。结论:电针干预"足三里"和"环跳"诱导大鼠腓肠肌产生时序性适应性肥大的改变可能是通过上调腓肠肌中Pax 7、PCNA、TGF-β1、MyoD 1、MyoG、Myh 7的表达,并下调Smad 3的表达,促进肌卫星细胞的增殖、成肌分化和肌管的终末分化,增加电针侧腓肠肌质量、肌纤维面积和直径而实现的。

黄颡鱼MyoD基因的克隆及其表达

采用RT-PCR和RACE(cDNA末端快速扩增)方法克隆黄颡鱼MyoD(myogenic differentiation antigen,成肌分化抗原)基因的cDNA全长序列,对其进行生物信息学和在雌雄个体组织中的表达差异分析.结果表明,黄颡鱼MyoD基因编码区由810个碱基组成,编码269个氨基酸,其中第1～89个氨基酸为Basic区,第90～141个氨基酸为bHLH结构;黄颡鱼的MyoD基因与斑点叉尾鮰的同源性最高为93%.在雌雄成体组织中的表达分析显示,雄性个体中肌肉和胃组织中的表达量极显著高于雌性个体(p<0.01),雌性个体的肾脏和鳃组织中的表达量显著高于雄性(p<0.05).通过MyoD基因在雌雄个体中表现出的组织表达差异,认为这可能是造成黄颡鱼雌雄生长差异的重要因素之一.