成肌调节因子MyoD和Myf-5在人体失神经骨骼肌中的表达及其临床意义

目的 研究人体骨骼肌失神经支配后成肌调节因子MyoD和Myf 5蛋白的表达变化 ,了解骨骼肌的再生状态。方法 2 0例不同时间人体失神经骨骼肌与 3例正常骨骼肌标本 ,HE染色和透射电镜观察肌卫星细胞形态变化 ;抗MyoD和Myf 5多克隆抗体免疫组织化学染色 (ABC法 ) ,统计阳性染色细胞核数。 结果 抗MyoD和Myf 5抗体阳性染色细胞核数在人体骨骼肌失神经 1～ 2月时的肌卫星细胞中最多 ;3个月后急剧下降 ,并维持在一低水平 ;1年后几乎无表达。结论 人体骨骼肌失神经支配后早期肌卫星细胞通过MyoD和 (或 )Myf 5途径激活。

成肌调节因子MyoD与myogenin在肌肉损伤修复过程的动态变化

目的探讨成肌调节因子MyoD与myogenin在肌肉损伤修复过程中的动态表达。方法用盐酸布比卡因局部注射制作肌肉损伤模型,在损伤后不同时间点取腓肠肌行冰冻切片,HE染色显示损伤肌肉的病理变化,用SABC法检测MyoD与myogenin的表达。结果MyoD在肌肉损伤后18 h开始表达,48 h达高峰;myogenin在肌肉损伤后24 h开始表达,72 h达高峰。结论MyoD与myogenin在肌肉损伤后的再生修复过程中起作用,可作为鉴定肌肉前体细胞和反映肌肉再生的指标。

蛋白酶体抑制剂MG-132对大鼠骨骼肌成肌调节因子MyoD基因表达的实验研究

泛素-蛋白酶体通路是失神经骨骼肌分解代谢的主要途径，其对蛋白底物的水解作用，可以被蛋白酶体抑制剂所阻断，从而影响细胞的一系列生理功能。Grace等研究表明，损伤后的骨骼肌再生及发育都受成肌调节因子（myogenic regulatory factors，MRFs）家族的调节。包括MyoD、Myogenin、Myf5、MRF4。其中，MyoD基因是决定骨骼肌细胞分化的决定性基因。

鳜鱼生肌调节因子MyoD的克隆及其发育表达分析

生肌调节因子是肌肉形成的关键控制因素.通过RT-PCR方法克隆得到鳜鱼主要生肌调节因子MyoD序列.鳜鱼MyoD基因cDNA长度为813 bp,编码270个氨基酸,推导的氨基酸序列含有1个bHLH结构.经与其他动物MyoD氨基酸序列比对发现不同动物MyoD的bHLH结构域保守性高.通过合成地高辛标记的反义RNA探针对鳜鱼不同发育阶段的胚胎进行整体胚胎原位杂交,结果发现:MyoD最早在肌节早期被检测到信号.伴随着鳜鱼体节从头部往后发育,MyoD也从头部往尾部表达.在体节期,MyoD在中后部表达.尾芽期MyoD的表达量达到最大值.然而,尾芽期过后,头部MyoD的表达量急剧减少,但尾部仍然有强烈的信号.在血流期仍然能在鳜鱼尾部检测到MyoD的微弱信号.到孵出期在鳜鱼鱼眼的后方和胸部腹侧检测到MyoD的强信号,而身体其他地方检测不到信号.仔鱼期没有检测到MyoD表达的信号.

电针对兔腰肌急性钝挫伤后组织修复与碱性成纤维细胞生长因子/细胞外信号调节激酶信号通路的影响

目的观察电针对兔腰肌急性钝挫伤后碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、结蛋白(Desmin)以及细胞外信号调节激酶(ERK1/2)表达的影响,探讨电针对兔腰肌损伤后组织再生修复影响的可能机制。方法 40只雄性新西兰大耳兔随机分为空白组、模型组、电针委中组、电针局部组,每组10只。采用钝挫伤方法造成兔腰肌损伤模型并对各组动物进行外表观察评分。造模后电针治疗2周,HE染色观察腰肌组织形态改变,免疫组化染色观察腰肌bFGF的表达,Western blotting法检测腰肌Desmin与ERK1/2蛋白表达。结果模型组、电针委中组与电针局部组外表观察评分均明显高于空白组(P<0.01)。组织形态学评分由高到低依次为模型组、电针局部组、电针委中组、空白组(P<0.05),腰肌bFGF的表达依次为电针局部组、电针委中组、模型组、空白组,Desmin的表达为电针局部组=电针委中组、空白组=模型组(P<0.05),ERK1/2的表达为电针局部组=电针委中组、模型组、空白组(P<0.05)。结论电针可能通过上调bFGF/ERK信号通路的表达,促进兔腰肌急性钝挫伤后的组织修复。

成肌调节因子Myf-5在失神经骨骼肌萎缩不同时段的表达

背景:成肌调节因子Myf-5是参与肌肉发生过程分子调控、启动和维持骨骼肌细胞生长发育的重要基因,可能与失神经骨骼肌萎缩的发生有关。目的:观察不同部位、不同时段骨骼肌失神经支配后成肌调节因子Myf-5基因的表达情况。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-03/04在山西医科大学完成。材料:选择健康8周龄雄性SD大鼠24只,随机分成4组,即假手术组(有神经支配)、去神经2d组、去神经7d组、去神经28d组,每组6只。方法:假手术组不切断坐骨神经,仅做假手术。去神经组右下肢后部中段切断坐骨神经1cm以上,分别于去神经第2,7,28天用脊椎脱臼法处死大鼠,分离出右小腿的胫骨前肌、比目鱼肌、腓肠肌、跖肌标本。主要观察指标:用反转录-聚合酶链反应技术检测各组肌肉Myf5mRNA表达情况,抗Myf-5多克隆抗体免疫组织化学染色(ABC法),测量灰度值。结果:去神经骨骼肌早期,Myf-5的mRNA在去神经支配后第2,7,28天均表达上调(P<0.05)。Myf-5抗体阳性染色细胞核数在SD大鼠骨骼肌失神经28d时的肌卫星细胞中最多。结论:Myf-5在大鼠失神经骨骼肌萎缩早期不同肌肉表达均为上调。大鼠骨骼肌失神经支配后早期肌卫星细胞中Myf-5表达上调。

肌肉特异性微小RNA和成肌调节因子在C2C12细胞成肌分化过程中的表达

背景:骨骼肌细胞的增殖与分化是由多因素参与的受严格调控的复杂生物学过程,其中,微小RNA和成肌调节因子作为调控基因表达的重要分子在成肌分化过程中起着关键的调控作用。目的:探讨微小RNA-1,133,206在C2C12细胞成肌分化过程中的表达变化及成肌调节因子的调控作用。方法:用含体积分数2%马血清的高糖DMEM培养基诱导C2C12细胞体外成肌分化,分别诱导分化后0,1,2,3,4,6d时提取细胞总RNA,用于real time RT-PCR检测。结果与结论:倒置显微镜观察和免疫荧光染色显示诱导C2C12细胞分化后3d开始有肌管和肌球蛋白重链阳性细胞形成,并随诱导时间延长而增多。Real time RT-PCR检测显示,C2C12细胞成肌分化过程中,微小RNA-1,133,206与成肌调节因子MyoD和myogenin mRNA的表达水平均先上升后又恢复至接近分化前水平,而pax7 mRNA的表达则无明显变化。提示肌肉特异性微小RNA及成肌调节因子可能对C2C12细胞的成肌分化发挥一定的调控作用。

绿色荧光蛋白和成肌调节因子在骨髓基质干细胞中的共表达

目的:研究重组腺病毒(Ad)对骨髓基质干细胞(MSCs)的转染,以及绿色荧光蛋白(GFP)和成肌调节因子MyoD和Myogenin在MSCs中的表达.方法:用差速贴壁法体外培养大鼠MSCs,并用流式细胞仪(FCM)检测其表面标志;对构建有绿色荧光蛋白的重组腺病毒(AdGFP)进行扩增和鉴定,并转染MSCs;用RTPCR检测MyoD和Myogenin在转染后MSCs中的表达;将MSCs与C2C12成肌细胞共培养,诱导前者的分化,并用免疫荧光检测MyoD的表达.结果:FCM检测证实,在MSCs的表面标志中CD11b和CD45阴性,而CD29和CD44阳性;随着AdGFP感染复数(MOI)的增加,转染效率也相应提高,但在MOI大于100后,MSCs开始出现病变;RTPCR结果提示MyoD和Myogenin在转染后的MSCs中有表达;免疫荧光检测证实诱导后的MSCs可以表达MyoD蛋白.结论:MSCs可以被AdGFP有效转染而表达GFP;同时内源性成肌调节因子的激活,可以促进MSCs的成肌分化.

运动性骨骼肌损伤中时钟基因BMAL1与MyoD的作用

背景:一次大负荷运动后会引起肌联蛋白titin降解导致骨骼肌损伤,成肌调节因子家族MyoD参与骨骼肌生成,在骨骼肌损伤修复中发挥重要的作用。目的:观察一次大负荷运动不同时相下骨骼肌MyoD、时钟基因BMAL1与titin表达变化,以期明确BMAL1与MyoD在运动诱导骨骼肌损伤中的作用。方法:24只8周龄SD大鼠随机分为安静对照组(n=4)和运动组(n=20)。运动组大鼠于跑台进行90 min下坡跑,运动后即刻(0 h)及运动后12,24,48,72 h取比目鱼肌。通过实时荧光定量PCR实验检测BMAL1、MyoD的mRNA表达量;透射电镜观察骨骼肌肌纤维超微结构变化;免疫荧光观测MyoD与BMAL1、BMAL1与titin的定位情况。结果与结论:①透射电镜显示:一次大负荷离心运动后,大鼠比目鱼肌部分位置肌节变宽,Z线模糊不清呈水波状,其中运动后12 h损伤最为严重,72 h后基本恢复;②实时荧光定量PCR检测显示:运动组BMAL1的mRNA表达呈现先升高,后趋于正常的状态;MyoD的mRNA表达呈现先下降、后升高的趋势;③免疫荧光观测:运动组可在12,24 h观测到BMAL1和MyoD的共定位;可在0,12,24 h观测到BMAL1和titin的共定位;④结果表明,MyoD与BMAL1共同参与运动性骨骼肌损伤的修复,可能是通过titin进行的。

成肌调节因子在共同性外斜视眼外肌中的表达及与临床病理学关系探讨

目的探讨成肌调节因子在共同性外斜视眼外肌中的表达及与临床病理学之间的关系。方法选取2015年1月至2017年12月于我院收治的共同性外斜视患者45例作为研究对象,根据斜视的发病类分为先天性外斜视组、间歇性外斜视组和恒定外斜视组,每组15例。另取同期进行角膜移植供体眼外肌12例作为对照组。Masson染色和HE染色观察眼外肌标本病理学变化,并测量细胞的横截面积,免疫组化法测量肌细胞Myf-5+、MRF4+表达的平均光密度值。结果HE染色和Masson显示,正常对照组眼外肌肌细胞体积无明显改变,肌纤维排列整齐,肌纤维间质均匀,肌小节结构清晰,仅肌束间见少量蓝色的胶原纤维;共同性斜视弱侧眼外肌肌细胞萎缩明显,肌纤维排列紊乱,肌纤维间质增大,肌小节结构模糊,肌束间可见大量的蓝色的胶原纤维增生。与对照组相比,共同性外斜视组肌纤维横截面积和Myf-5+、MRF4+肌卫星细胞平均光密度明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);先天性外斜视组与恒定性外斜视组上述指标明显低于正常对照组,且恒定性外斜视组下降更明显,差异有统计学意义(P<0.05);而间歇性外斜视组与正常对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。相关性分析显示,共同性斜视组弱侧眼外肌中肌细胞Myf-5+和MRF4+平均光密度与患者病程(r=-0.458,P<0.05),(r=-0892,P<0.05)以及斜视度数(r=-0.258,P<0.05),(r=-0.369,P<0.05)均呈负相关关系。结论同性外斜视患者眼外肌的肌卫星细胞中成肌调节因子Myf-5与MRF4表达降低,这可能是导致共同性外斜视病理改变明显的原因之一。

MyoD转染对横纹肌肉瘤RD细胞分化及生肌调节因子表达的影响

目的:观察MyoD转染后对人横纹肌肉瘤RD细胞分化及生肌调节因子MRF4表达的影响。方法:利用脂质体法将MyoD转染培养中人横纹肌肉瘤RD细胞,原位杂交检测MyoD、MRF4mRNA的表达,观察细胞形态、生长速度变化,免疫细胞化学检测横纹肌肌球蛋白重链及肌动蛋白α-actin表达。结果:转染后RD细胞形态向高分化方向变化,生长受抑制;MyoD、MRF4表达明显增加;细胞肌球蛋白重链和肌动蛋白α-actin表达显著增强。结论:MyoD具有促进RD细胞分化的作用,并可激活另一生肌调节因子MRF4的表达。

生肌调节因子和连接蛋白43基因诱导大鼠成纤维细胞分化为肌细胞实验研究

目的探讨转染生肌调节因子(myoblast determination,MyoD)基因和连接蛋白43(Connexin,Cx43)基因的大鼠真皮成纤维细胞(der-mal fibroblast,DFs)生物学功能的变化及MyoD和Cx43基因转染DFs细胞治疗心力衰竭的可行性。方法采用Gateway技术,构建真核质粒表达载体,利用慢病毒(LV)表达系统,将大鼠MyoD cDNA和Cx43cDNA转入大鼠成纤维细胞中,经Blasticidin筛选培养,通过RT-PCR,Western印迹法等方法检测MyoD及Cx43蛋白及mRNA表达情况,并且通过显微镜观察转染后生长情况,膜片钳技术检测离子电流变化。结果RT-PCR,Western印迹法检测出MyoD及Cx43蛋白及相应mRNA表达,膜片钳检测到转染后钙离子电流,显微镜观察到基因转染筛选后培养1w细胞的融合现象,并有多核肌管形成。结论MyoD和Cx43基因转染使DFs分化为成肌细胞,为进一步研究基因治疗心力衰竭奠定基础。

探讨生肌调节因子和连接蛋白43基因在大鼠成纤维细胞中的表达

目的通过观察转染生肌调节因子(myoblast determination,MyoD)基因和连接蛋白43(Connexin)基因的大鼠真皮成纤维细胞(dermal fibroblast,DFs)生物学功能的变化,探讨Myo和Cx43基因转染DFs细胞的意义。方法采用Gateway技术,构建真核质粒表达载体,利用慢病毒(LV)表达系统,将大鼠MyoDcDNA和Cx43 cDNA转入大鼠成纤维细胞中,经Blasticidin筛选培养,通过RT-PCR,Western blot及膜片钳技术等方法检测MyoD及Cx43 mRNA及蛋白表达,并检测离子电流变化,通过显微镜观察转染后生长情况,免疫组织化学检测肌动蛋白和结蛋白的表达。结果RT-PCR,Western blot检测出MyoD及Cx43的mRNA及相应蛋白表达,膜片钳检测到转染后钙离子电流,显微镜观察到基因转染筛选后,培养1周细胞的融合现象,并有多核肌管形成。免疫组织化学检测可见其下游蛋白Desmin及α-actin呈现阳性表达。结论MyoD和Cx43基因转染使DFs分化为成肌细胞,为进一步研究基因治疗心力衰竭奠定基础。

下坡跑后大鼠腓肠肌成肌调节因子的变化

目的:探讨成肌调节因子(MyoD)在肌肉损伤修复过程中的动态表达,为促进运动肌肉损伤的再生修复提供实验依据。方法:将健康雄性2月龄SD大鼠80只,随机分为对照组(n=10)和下坡运动组(n=70),下坡运动组再分为运动后即刻组、12h、24h、48h、72h、7d和14d组,各运动组动物均进行持续性下坡跑,分别在运动结束后8个时间点麻醉,下腔静脉取血,分离血清,取双侧腓肠肌。常规检测CK、LDH的活性。采用免疫组织化学染色法以及计算机图像分析技术定量统计MyoD因子表达情况。结果:血清CK、LDH在运动后即刻显著上升,后逐渐下降至正常水平。成肌调节因子MyoD在正常骨骼肌中即有表达,各运动组大鼠腓肠肌MyoD因子表达较对照组均有增加,48h组大鼠腓肠肌MyoD免疫阳性细胞核数明显多于对照组(P<0.05),后随时间逐渐下降。结论:离心运动后即刻MyoD的表达水平开始上升,48h达到峰值,随后逐渐下降至正常水平。提示成年早期大鼠(2月龄)已具备较成熟的肌肉再生修复能力。

推拿手法对家兔骨骼肌失神经支配后成肌调节因子Myf-5、Myogenin表达的影响

目的观察推拿手法对家兔失神经支配骨骼肌干预后肌湿重、成肌调节因子中生肌因子5(Myogenic factor 5,Myf-5)、肌细胞生成素(Myogenin)表达的影响。方法普通级新西兰雄性家兔随机分为正常对照组、模型对照组、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)治疗组和手法治疗组,每组30只。每组再随机分为2周、3周、1个月、2个月和4个月五个亚组,每组6只。模型对照组、NGF治疗组及手法治疗组家兔建立腓肠肌失神经支配模型,NGF治疗组给予肌注注射用鼠神经生长因子,手法干预组进行推拿干预,模型对照组及正常对照组不进行其他操作。分别干预后处死取材,称量腓肠肌肌湿重,计算术侧与健侧的腓肠肌肌湿重比值;检测腓肠肌组织Myf-5 mRNA、Myogenin mRNA表达水平。结果(1)腓肠肌肌湿重比:NGF治疗组在2周(0.79±0.03)%、3周(0.70±0.06)%、1个月(0.58±0.04)%、2个月(0.44±0.05)%,手法治疗组在2周(0.72±0.05)%、3周(0.55±0.04)%、1个月(0.55±0.09)%、2个月(0.49±0.03)%、4个月(0.50±0.03)%高于模型对照组同期[2周(0.53±0.01)%、3周(0.41±0.03)%、1个月(0.40±0.03)%、2个月(0.38±0.05)%、4个月(0.38±0.05)%,P<0.05]。手法治疗组在2周(0.72±0.05)%、3周(0.55±0.04)%低于NGF治疗组[2周(0.79±0.03)%、3周(0.70±0.06)%],4个月(0.50±0.03)%时则高于NGF治疗组(0.42±0.02)%(P<0.05)。(2)腓肠肌Myf-5 mRNA表达:NGF治疗组在2周(18.50±1.79)、3周(12.52±0.58)、1个月(5.30±1.76)、2个月(2.82±0.23),手法治疗组在2周(20.48±2.20)低于模型对照组同期[2周(40.91±10.31)、3周(25.25±1.27)、1个月(13.91±1.40)、2个月(8.83±0.86),P<0.05],手法治疗组在1个月(16.50±1.17)、2个月(12.20±0.84)、4个月(5.32±0.60)高于模型对照组[1个月(13.91±1.40)、2个月(8.83±0.86)、4个月(3.82±0.54),P<0.05]。手法治疗组在3周(37.21±9.10)、1个月(16.50±1.17)、2个月(12.20±0.84)、4个月(5.32±0.60)时高于NGF治疗组[3周(12.52±0.58)、1个月(5.30±1.76)、2个月(2.82±0.23)、4个月(3.88±0.57),P<0.05]。(3)腓肠肌Myogenin mRNA表达:NGF治疗组在2周(94.31±23.87)、3周(165.95±29.58)、1个月(156.59±64.76)、4个月(4.05±0.51),手法治疗组在4个月(5.74±1.35)低于模型对照组同期[2周(185.92±48.71)、3周(359.21±116.88)、1个月(597.50±146.66)、4个月(63.13±12.24),P<0.05],手法治疗组在2个月(1026.75±132.63)高于模型对照组(168.84±31.85),P<0.05。手法治疗组在2周(209.80±91.25)、3周(482.37±97.95)、1个月(667.73±97.95)、2个月(1026.75±132.63)均高于NGF治疗组[2周(94.31±23.87)、3周(165.95±29.58)、1个月(156.59±64.76)、2个月(140.63±40.18),P<0.05]。结论推拿手法可能通过改善成肌调节因子Myf-5、Myogenin表达来延缓失神经支配后骨骼肌的萎缩,远期疗效较NGF良好。

运动对成肌调节因子的影响

本文通过对目前有关文献资料的分析,研究了运动及低氧运动对骨骼肌成肌调节因子MyoD和myogenin基因表达的影响,对揭示肌肉收缩蛋白性能的变化机制具有一定的意义和作用。

MyoD基因诱导大鼠成纤维细胞转化为成肌细胞的研究

目的探讨MyoD在体外诱导大鼠成纤维细胞分化为成肌细胞中的作用。方法将大鼠成纤维细胞分成2组:未转染组(N组)和MyoD基因转染组(M组);利用慢病毒表达系统,将大鼠MyoD基因转入大鼠成纤维细胞中,Blasticidin筛选;用RT-PCR和Western blot检测MyoD的表达;免疫组织化学检测MyoD、desmin及-αactin的表达;电子显微镜观察转染前后细胞形态的变化。结果RT-PCR和Western blot可检测出MyoD基因转染后细胞表达MyoD mRNA及蛋白质;免疫细胞化学检测MyoD表达在基因转染的细胞中为阳性,desmin、α-actin阳性表达只出现在M组;电子显微镜观察转染后的细胞胞浆中有微丝以及微管等结构。结论MyoD基因可诱导大鼠成纤维细胞分化成的细胞具有成肌细胞特征,为进一步研究MyoD基因诱导的成肌细胞及在大鼠心梗损伤修复中的作用提供了实验基础。

炎性因子对C_2C_(12)细胞、MC-3T3-E1细胞成骨、成肌相关基因表达的影响

目的:探讨炎性因子对成肌和成骨细胞成肌、成骨相关基因表达的影响。方法:小鼠腹腔巨噬细胞上清液及白介素(IL)1β处理C2C12细胞及MC-3T3-E1细胞,观察炎性因子对两种细胞成骨、成肌相关基因的表达的影响。结果:小鼠腹腔巨噬细胞上清液促进C2C12细胞MyoD、Myogenin的表达,差别均有统计学意义(P<0.001);促进MC-3T3-E1细胞碱性磷酸酶(ALP)的表达,吸光度比值上升为原来的3倍多,差别有统计学意义(P<0.001)。IL-1β单独对C2C12细胞和MC-3T3-E1细胞的成肌、成骨因子的表达影响无统计学意义(P>0.05)。结论:巨噬细胞上清液可上调MC-3T3-E1细胞的成骨相关基因表达;上调C2C12细胞的成肌相关基因表达。IL-1β单独不能对C2C12细胞和MC-3T3-E1细胞的成肌、成骨基因的表达产生影响。