系统性红斑狼疮小鼠骨髓间充质干细胞的成骨、成脂分化能力下降

背景:系统性红斑狼疮患者的骨髓间充质干细胞与正常人相比是否有不同,相关报道较少。目的:对比系统性红斑狼疮模型小鼠与正常小鼠的骨髓间充质干细胞多向分化能力的差别。方法:分离培养系统性红斑狼疮模型小鼠与C57BL小鼠的骨髓间充质干细胞(对照组),分别进行成骨、成脂诱导分化,观察两种小鼠的骨髓间充质干细胞的分化能力。结果与结论:C57BL小鼠的骨髓间充质干细胞经传代后,为长梭形,呈均匀分布生长;系统性红斑狼疮模型小鼠的骨髓间充质干细胞表现为生长缓慢,细胞相对C57BL小鼠要少一些。经过成骨诱导显示系统性红斑狼疮模型小鼠的钙结节和钙盐明显少于对照组,PCR检测成骨基因Runx2,碱性磷酸酶,骨钙素表达也明显下降。经过成脂诱导显示系统性红斑狼疮模型小鼠的脂滴明显少于对照组,PCR检测成脂基因PPARγ2,脂蛋白酯酶表达也明显下降。说明系统性红斑狼疮模型小鼠的骨髓间充质干细胞成骨与成脂能力都低于C57BL小鼠,系统性红斑狼疮模型小鼠的骨髓间充质干细胞的多向分化能力受损。

银杏叶提取物对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化能力的影响

目的:探讨银杏叶提取物(GBE)对大鼠的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)成脂分化能力的影响,阐明GBE在细胞水平上对骨质疏松治疗及预防的意义。方法:将50、100、150、200和400mg·L-1 GBE与成脂诱导液加入到已纯化的第3代BMMSCs中(50、100、150、200和400mg·L-1 GBE组),不加药的BMMSCs为对照组,共培养7d,观察BMMSCs的形态学和表面抗原CD44、CD105和CD34的表达;采用油红O染色观察BMMSCs中脂滴形成情况,并对BMMSCs的成脂能力进行定量分析;采用RT-PCR法检测BMMSCs中脂肪组织脂肪酸结合蛋白(AP2)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)的亚型(PPAR-γ)mRNA的表达水平。结果:形态学检测,体外培养的原代BMMSCs 3d后可见细胞呈梭形,7d后细胞呈漩涡状生长,同向排列;表面抗原标记物染色,CD44和CD105呈阳性表达,而CD34呈阴性表达,证明其为BMMSCs;油红O染色,约7d后显微镜下见大量脂滴形成,并随着GBE浓度的增大脂滴数量减少;与对照组比较,其他各组BMMSCs的A510值降低(P<0.05);RT-PCR检测,与对照组比较,其他各组细胞中AP2和PPAR-γmRNA表达水平降低(P<0.05)。结论:GBE在体外可抑制BMMSCs的成脂分化能力,且抑制能力随着GBE浓度的增高而逐渐增强。

不同方法分离的大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性和成脂分化能力的比较

目的:通过比较密度梯度离心和贴壁筛选两种方法所获MSCs的增殖活性和成脂分化能力,探索MSCs体外分离和纯化的较好方法。方法:应用密度梯度离心和贴壁筛选两种方法分离纯化骨髓MSCs,并通过MTT法检测其增殖活性,用第三代MSCs进行成脂诱导,以观察两种方法所获MSCs的成脂分化能力。结果:密度梯度离心法所获MSCs纯度高,呈纺缍形或小三角形,增殖快,约7～10天融合;贴壁筛选法分离的原代细胞中红细胞。破骨细胞等杂质细胞较多,增殖速度相对较慢,且经数次传代仍有较多杂质细胞存在,经成脂诱导后,两种方法所获MSCs表现出相似的成脂能力,油红O染色细胞计数值与光密度值比较两组无显著差异(P值>0.05)。结论:密度梯度离心法是体外分离和纯化MSCs较好的方法,所获细胞增殖活性高,与贴壁筛选法所获MSCs具有相似的成脂分化能力。

miR-3077-5P对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化能力的影响

目的观察miR-3077-5P对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化能力的影响。方法通过细胞转染技术分别上调和下调3T3-L1前脂肪细胞中的miR-3077-5P表达,将其分为对照(control)组、模拟物(mimics)组及抑制物(inhibitor)组;将各组3T3-L1前脂肪细胞成脂诱导10 d,以逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测其相关成脂基因PPAR-γ和LPL mRNA表达水平,用免疫蛋白印迹(Western Blot,WB)法检测其相关成脂基因PPAR-γ和FABP4蛋白水平;采用油红O染色观察脂滴形成情况并作定量分析。结果成脂诱导10 d,miR-3077-5P mimics组成脂基因PPAR-γ和LPL mRNA的表达水平及PPAR-γ和FABP4蛋白水平均升高,而miR-3077-5P inhibitor组则相反(P均<0. 05);成脂诱导10 d,miR-3077-5P mimics组脂滴形成最大,脂滴形成量存在升高现象,miR-3077-5P inhibitor组脂滴较小且形成量较少(P均<0. 05)。结论 miR-3077-5P对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程具有促进作用。

MicroRNA-146b-5p对小鼠骨片来源的间充质干细胞成脂分化能力的影响

目的:探讨MicroRNA-146b-5p(miR-146b-5p)对小鼠骨片来源间充质干细胞(MSC)成脂分化能力的影响。方法:从C57BL/6小鼠骨片中分离培养MSC,应用q-PCR检测成脂诱导过程中miR-146b-5p表达量的变化。将miR-146b-5p mimic或inhibitor及其阴性对照转染细胞,应用q-PCR检测转染后细胞中miR-146b-5p的表达量及转染效率;并于转染培养14 d后进行油红染色,应用q-PCR检测成脂分化因子C/EBPα和PPARγ的表达量,Western blot检测PPARγ的表达量。结果:成功分离出小鼠骨片来源的MSC,miR-146b-5p在成脂诱导过程中随诱导天数的增加呈现上升趋势。转染miR-146b-5p mimic可上调miR-146b-5p表达(P<0.001),而转染miR-146b-5p inhibitor可显著下调miR-146b-5p表达(P<0.01)。培养14 d后油红染色结果表明,转染miR-146b-5p inhibitor可以抑制成脂分化,而转染miR-146b-5p mimic可促进成脂分化。诱导14 d后,与对照组相比,mimic组高表达PPARγ、C/EBPα(P<0.01);与诱导组相比,inhibitor组低表达PPARγ、C/EBPα(P<0.05)。mimic组PPARγ的表达量升高,而Inhibitor组则相反。结论:miR-146b-5p在小鼠MSC成脂肪分化过程中高表达,并可促进小鼠骨片来源的MSC向脂肪细胞分化。

幼龄1型糖尿病模型小鼠脂肪来源干细胞的鉴定及其成脂分化能力

目的比较幼龄1型糖尿病(T1DM)模型小鼠和幼龄正常小鼠脂肪来源干细胞(ADSC)的成脂分化能力,为阐明T1DM发病机制提供理论基础和实验依据。方法3周龄C57BL/6J小鼠,连续5 d ip给予小剂量(50 mg·kg^(-1))链脲佐菌素(STZ)制备幼龄T1DM小鼠模型;正常对照组ip给予等体积柠檬酸缓冲液;7 d后连续3 d小鼠尾静脉采血检测空腹血糖水平,空腹血糖均值≥16.7 mmol·L^(-1)认为幼龄小鼠T1DM建模成功。建模成功14 d后,取皮下脂肪和性腺周围脂肪组织,用组织酶消化法培养小鼠ADSC,倒置显微镜下观察细胞形态;用流式细胞术检测细胞表面标志物Sca-1、CD29、CD90、CD31、CD34、CD45、主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ和CD11b。选取第3代(P3代)ADSC进行成骨和成脂诱导分化,分别用油红O染色和碱性磷酸酶染色检测细胞的成骨和成脂诱导分化能力,实时荧光定量PCR检测ADSC成骨关键转录因子骨钙素(Ost)和Runt相关转录因子2(Runx2)及成脂关键转录因子CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)mRNA表达。结果成功建立幼龄T1DM小鼠模型,并从T1DM模型小鼠脂肪组织分离获得ADSC,细胞形态呈成纤维样、贴壁生长,高表达CD29,CD90和Sca-1,低表达CD45,CD34,MHCⅡ,CD11b和CD31。幼龄T1DM模型小鼠P3代ADSC成骨诱导分化后,碱性磷酸酶染色阳性,Ost和Runx2 mRNA表达显著增高(P<0.01);成脂诱导分化后,油红O染色可见ADSC脂滴明显增多(P<0.01),PPARγ和CEBPαmRNA表达显著增高(P<0.01)。与正常对照组相比,幼龄T1DM模型小鼠ADSC脂滴数增多(P<0.01)且增大,PPARγ和CEBPαmRNA表达亦显著增高(P<0.01)。结论幼龄T1DM模型小鼠ADSC体外成脂分化能力增强。

CD54^+和CD54^-脂肪干细胞的成脂分化能力

背景:研究表明,脂肪干细胞具有多向分化潜能,但是其向成熟脂肪细胞分化的效率仍较低,只有30%-40%。因此,如何提高脂肪干细胞的成脂分化能力是软组织再生研究过程中需要解决的关键科学问题。目的:观察兔脂肪干细胞表面标志物CD54的表达与其成脂分化能力的关系,并探讨同一诱导剂对CD54^+和CD54^-兔脂肪干细胞成脂分化的影响。方法:取新西兰大白兔(8-12周龄)腹股沟皮下脂肪垫3 mL,采用贴壁法体外分离培养兔脂肪干细胞并行多向分化诱导及细胞表型标志物鉴定。取第3代细胞经免疫磁珠分选得到CD54^+兔脂肪干细胞和CD54^-兔脂肪干细胞,经成脂诱导14d后行油红O染色,检测成熟脂肪细胞的密度及细胞内脂滴含量。RT-PCR检测脂肪干细胞成脂分化相关基因表达水平。结果与结论:(1)兔脂肪干细胞具有间充质干细胞特性,可向成熟脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞表型分化,细胞表面标志物CD29、CD44、CD49d、CD54、CD73、CD90和CD105表达均为阳性,而CD31、CD34和CD45表达阴性;(2)成脂诱导第14天,CD54^+兔脂肪干细胞分化为成熟脂肪细胞的密度和细胞内脂滴含量均高于CD54^-兔脂肪干细胞,差异均有显著性意义(P<0.05);(3)成脂诱导14 d后,CD54^+兔脂肪干细胞成脂相关基因ADD1、C/EBPα、PPARγ的mRNA表达水平明显高于CD54^-兔脂肪干细胞,差异均有显著性意义(P<0.05);(4)结果表明,CD54^+脂肪干细胞具有高成脂分化能力。

PAMM不影响人脂肪干细胞的成脂分化能力

目的PAMM(peroxiredoxin-like 2 activated in M-CSF stimulated monocytes)是近年来发现的一种在脂肪组织中高表达的分泌因子,但其生物学功能尚不完全清楚。为了给PAMM功能研究提供新线索,本文探讨了PAMM在白色脂肪生成中的可能作用及PAMM调节的下游基因。方法利用成脂分化液或“成脂分化液+IL-1α”建立人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的成脂分化和成脂抑制模型。用si RNA干扰和过表达质粒转染的方法抑制或上调PAMM表达水平。采用基因芯片、m RNA测序及定量RT-PCR检测基因的m RNA表达水平,采用蛋白质印迹法评价蛋白质表达水平,用油红O染色检测脂滴沉积。结果随着ADSCs向白色脂肪分化,PAMM表达水平明显上升,而随着成脂抑制,PAMM表达明显下降。在ADSCs中沉默或过表达PAMM后,再进行成脂分化。结果发现,上调或下调PAMM对脂滴形成及成脂相关基因的表达均无明显影响。类似地,在高度分化的脂肪细胞中敲低PAMM表达,对细胞形态及脂滴含量亦无明显影响。本文进一步利用si RNA干扰、m RNA测序及q RT-PCR,筛选和验证了一批受PAMM调节的下游基因及功能性基因集,包括SULF1、A2M基因及调节P53稳定性的基因集等。结论PAMM可作为白色成脂分化的标志基因,但其自身对白色脂肪细胞生成无明显影响,本研究筛选出来的PAMM下游基因及基因集,可为进一步研究PAMM的功能提供新线索。

猪肌内脂肪前体细胞成脂分化中miRNA差异分析

miRNA在成脂分化的过程中发挥着重要的调控作用,本研究旨在探究miRNA在猪肌内脂肪(Intramuscular Fat,IMF)前体细胞成脂分化过程中的表达模式,并对其潜在的调控功能进行分析。通过SmallRNA-seq、实时荧光定量PCR、miRanda、RNAhybird等技术和软件,对猪IMF前体细胞成脂诱导分化过程中miRNA的表达模式及靶基因进行了生物信息学分析。结果显示:猪IMF前体细胞诱导4 d后出现脂滴,在诱导0 d和4 d的猪IMF前体细胞中共鉴定到617个miRNAs,其中22个miRNAs诱导4 d表达显著上调,27个miRNAs表达下调;差异miRNAs共预测到13 869个靶基因,GO分析和KEGG分析发现靶基因主要富集到细胞分泌、细胞分解代谢、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等。此外,对miR-30家族的ssc-miR-30a-5p和ssc-miR-30c-3p进行定量验证,验证结果与测序结果一致。本研究揭示了miRNAs在猪IMF前体细胞成脂分化过程中的表达模式及潜在调控网络,为研究猪IMF沉积的调控机制奠定了前期基础。

精氨酸甲基转移酶(PRMT)7通过IGF-1信号通路调控人骨髓间充质干细胞成脂分化的研究

目的本研究旨在明确精氨酸甲基转移酶(PRMT)7在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成脂分化过程中的变化以及是否调控hBMSCs成脂分化,进而探索相应的调控机制。方法通过定量反转录PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测hBMSCs成脂分化过程中PRMT7的变化;通过qRT-PCR和Western blot实验证明PRMT7稳定敲低细胞系构建成功。进行油红O染色和定量分析,以及qRT-PCR和Western blot实验检测PRMT7稳定敲低细胞系成脂分化水平的变化;通过裸鼠体内异位成脂实验,油红O染色检测PRMT7稳定敲低细胞系体内异位成脂的效果;通过qRT-PCR和Western blot证明PRMT7稳定过表达细胞系构建成功。进行油红O染色和定量分析以及qRT-PCR和Western blot实验检测PRMT7稳定过表达细胞系成脂分化水平的变化;通过q RT-PCR和Western blot实验检测敲低PRMT7和过表达PRMT7的细胞中IGF-1表达水平的变化。在PRMT7稳定敲低细胞系中转染siIGF-1并通过qRT-PCR和Western blot检测IGF-1的表达水平验证敲低效率。通过油红O染色和定量分析,qRT-PCR实验检测转染siIGF-1的敲低组hBMSCs成脂分化水平的变化。结果本文发现:在hBMSCs成脂过程中,PRMT7表达水平明显降低(P<0.01);敲低PRMT7后hBMSCs的成脂分化能力增强(P<0.001);敲低PRMT7后hBMSCs的体内异位成脂分化能力增强;过表达PRMT7后hBMSCs的成脂分化能力减弱(P<0.01);PRMT7敲低后IGF-1表达水平增加(P<0.0001);PRMT7过表达后IGF-1表达水平降低(P<0.0001);转染siIGF-1后,各细胞系IGF-1表达水平明显降低(P<0.001);敲低组转染siIGF-1后成脂分化能力明显降低(P<0.01)。结论本研究通过细胞水平和裸鼠皮下移植实验发现PRMT7显著抑制hBMSCs成脂分化,机制研究发现PRMT7对hBMSCs成脂分化的调控作用依赖IGF-1信号通路。上述研究表明,PRMT7可能是治疗相关疾病的潜在分子靶点,为PRMT7和hBMSCs应用于相关疾病治疗提供了新思路。

鸽脂肪前体细胞的分离培养及成脂诱导分化研究

旨在建立鸽脂肪前体细胞的体外分离、培养、鉴定和成脂诱导分化的方法。本研究采集3只健康的1日龄银王鸽皮下脂肪组织,利用I型胶原酶进行消化以分离脂肪前体细胞,在脂肪前体细胞常规分离法基础上进行分离方法改良,对获得的脂肪前体细胞进行原代和传代培养,并观察细胞形态,通过免疫荧光鉴定特异性标记DLK1,确认脂肪前体细胞。通过在培养基中添加胰岛素和油酸钠进行成脂诱导分化,使用BODIPY493/503染色观察细胞中的脂滴分布情况,通过甘油三酯测定试剂盒检测细胞中甘油三酯的含量,采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测脂肪前体细胞成脂分化过程中分化相关基因的表达。研究结果表明,鸽脂肪前体细胞呈梭形,改良分离法比常规分离法能够获得更多的脂肪前体细胞;与37℃相比,在41℃培养温度下,获得的脂肪前体细胞数目显著增加(P<0.001)。免疫荧光结果表明,DLK1表达为阳性,说明获得的是脂肪前体细胞。BODIPY493/503染色结果显示,分化6 d的细胞中产生大量的脂滴。且随着分化时间的增加,细胞中甘油三酯的相对含量也显著增加(P<0.01)。qPCR结果显示,在添加诱导剂2 d时,PPARγ、SCD、DGAT2、PLIN2、FASN、AFABP、LPL基因的表达量显著上调(P<0.05),之后随分化时间的增加表达逐渐上调;SREBF 1基因在分化2 d时表达量显著上调(P<0.05),之后表达量不变;ACACA基因在分化2 d时,表达量显著增加(P<0.05),在分化4 d时表达量达到高峰。Western blot结果表明,在分化2 d时,PPARγ、LPL和PLIN2的表达量显著上调(P<0.05),之后随着分化时间的延长,表达量进一步升高。综上所述,本研究改良了脂肪前体细胞常规分离法,成功分离获得鸽脂肪前体细胞,且筛选出最适培养温度。获得的鸽脂肪前体细胞经胰岛素和油酸钠诱导后能高效地分化为成熟的脂肪细胞。本研究为鸽脂肪代谢分子调控机制的研究提供了良好的细胞模型,同时也为鸽生物培育肉的制备提供种子细胞和技术指导。

METTL3通过YTHDF2/AKT1/PPARγ调控人骨髓间充质干细胞成脂分化的机制研究

目的:探讨N^(6)-甲基腺苷(m^(6)A)甲基化酶甲基转移酶样蛋白3(METTL3)在体外调控人骨髓间充质干细胞(MSCs)向脂肪细胞分化的作用机制。方法:构建METTL3、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和YTH m^(6)A RNA结合蛋白F2(YTHDF2)慢病毒载体,包装慢病毒并感染MSCs;采用成脂分化试剂盒诱导各组MSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色检测各组的脂肪细胞形成情况;采用分子克隆技术构建METTL3突变重组载体以证实METTL3的m^(6)A关键位点对靶基因的调控作用;利用放线菌素D作用于YTHDF2过表达的MSCs以探究阅读蛋白YTHDF2对AKT1 mRNA和蛋白表达的影响;采用RNA pull-down结合银染和Western blot实验检测可能发生甲基化修饰的片段与识别蛋白的结合情况。结果:m^(6)A甲基化酶METTL3以PPARγ/AKT1依赖的方式抑制骨髓MSCs的脂肪形成,并且以m^(6)A修饰阅读蛋白YTHDF2依赖的方式抑制AKT1的蛋白表达。YTHDF2可识别并结合发生m^(6)A修饰的AKT1编码序列(CDS),降低其表达水平,抑制MSCs脂肪形成过程。结论:m^(6)A甲基化酶METTL3通过YTHDF2/AKT1/PPARγ通路调控人骨髓MSCs成脂分化过程。本研究为从肿瘤微环境角度寻找急性髓系白血病治疗新靶点提供了理论依据。

北京黑猪脂肪前体细胞的分离培养及成脂诱导分化研究

旨在建立北京黑猪脂肪前体细胞的分离培养及成脂诱导分化培养体系,为研究猪脂肪沉积的分子机制提供试验材料,为生物培育肉的制备提供技术指导。本研究采集1头7日龄健康的北京黑猪公猪的颈部皮下脂肪组织,使用机械法联合I型胶原酶消化法分离脂肪前体细胞。对获得的脂肪前体细胞进行形态观察、生长曲线绘制、免疫荧光鉴定、成脂诱导分化、油红O染色、BODIPY染色、甘油三酯含量测定及使用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测成脂分化相关基因的表达。结果表明,分离的北京黑猪脂肪前体细胞贴壁后呈长梭形,细胞生长曲线呈S型。免疫荧光结果表明,PREF1表达为阳性,表明分离的细胞的确为脂肪前体细胞。在相同的诱导试剂组合条件下,使用10%FBS比2%FBS成脂诱导分化效果更好。在相同血清浓度的情况下,鸡尾酒法与油酸钠、罗格列酮共同联用的细胞分化效果较好。分化8 d的细胞中出现大量的脂滴,脂滴经油红O染色呈红色,经BODIPY染色呈绿色。且分化8 d的细胞中甘油三酯的含量显著升高(P<0.001)。qPCR结果显示,PPARγ、CEBPα、ACCα、LPL、SCD和FABP4在分化2 d时表达量均显著升高(P<0.05),4~6 d达到高峰,8 d时表达量降低。Western blot结果表明,PPARγ、CEBPα、FABP4、APN在细胞分化过程中表达逐渐上调。PREF1在细胞分化过程中表达逐渐下调。在三维培养情况下,使用10%FBS,鸡尾酒法与油酸钠、罗格列酮共同联用也能使脂肪前体细胞分化为成熟的脂肪细胞,分化8 d的细胞中脂滴经BODIPY和油红O染色后分别呈绿色和红色,且PPARγ、CEBPα、ACCα、LPL、SCD和FABP4在分化8 d的细胞中的表达量显著上调(P<0.001)。综上所述,本研究成功建立了北京黑猪脂肪前体细胞的分离与培养体系,并筛选出适合二维和三维培养的成脂诱导分化方法,为进一步研究猪脂肪沉积的分子机制和改善肉品质奠定基础,也为细胞培育肉的制备提供技术指导。

骨痹通消颗粒对激素型股骨头坏死人骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化的影响

目的 探究骨痹通消颗粒对激素性股骨头坏死人骨髓间充质干细胞(h BMMSC)成骨与成脂分化的影响。方法 取激素性股骨头坏死患者骨髓,体外进行h BMMSC的培养,通过细胞形态学观察、成骨及成脂分化潜能来鉴定h BMMSC。以完培组(基础培养基+10%的胎牛血清)作为对照,采用CCK-8法测定1%、2%、5%、8%、10%体积分数的骨痹通消含药血清A组作用24 h后对细胞增殖的影响。细胞在96孔板的培养过程中,每孔加入地塞米松溶液0.52μl,以完培组(基础培养基+10%的胎牛血清)和损伤组(基础培养组+10%的胎牛血清+0.52μl地塞米松溶液)作为对照,采用CCK-8法测定2%、5%、8%体积分数的骨痹通消含药血清B组对激素环境中细胞活力的影响。以无激素诱导细胞作为对照组(基础培养基+10%的胎牛血清),将体外激素诱导的h BMMSC细胞分为模型组(基础培养基+10%的胎牛血清+10-5mol/L地塞米松溶液)、实验组(基础培养基+5%的骨痹通消含药血清+10-5mol/L地塞米松溶液)。茜素红染色试剂盒测定各组成骨分化后矿化结节的形成;油红O染色试剂盒测定各组成脂分化后脂滴的形成;RT-q PCR测定成脂相关标志基因PPARγ、C/EBP-α与Fabp4中m RNA的表达,Western blot检测成骨相关蛋白BMP-2、Runx2及β-catenin的蛋白表达含量。结果 原代细胞培养7 d后,可见梭形、纺锤形或多角形的贴壁细胞。第三代细胞生长均匀,平行排列,透光率好。成骨诱导21 d,细胞发生改变,局部细胞聚集,并有矿化结节产生,茜素红染色呈阳性;成脂诱导21 d,脂滴与油红O染液结合变为红色,油红O染色呈阳性。与完培组比较,10%体积分数的含药血清A组细胞活力下降(P<0.05)。与完培组比较,损伤组细胞活力下降(P<0.05);与损伤组比较,2%、5%、8%体积分数的含药血清B组细胞活力升高(P<0.05)。与对照组比较,模型组染色面积降低(P<0.05);与模型组比较,实验组中矿化结节与沉积升高,染色范围也更广(P<0.05)。与对照组比较,模型组细胞内脂质积累增多(P<0.05);与模型组比较,实验组较细胞内脂质积累降低(P<0.05)。与对照组比较,模型组PPARγ、C/EBP-α和Fabp4的表达量升高(P<0.01),与模型组比较,实验组PPARγ、C/EBP-α和Fabp4的表达量降低(P<0.05)。与对照组比较,模型组BMP-2、Runx2及β-catenin蛋白表达含量升高(P<0.01),与模型组比较,实验组BMP-2、Runx2及β-catenin蛋白表达含量降低(P<0.05)。结论 骨痹通消颗粒能够促进激素性股骨头坏死h BMMSC的增殖及其向成骨分化的能力,抑制成脂分化,为临床上防治激素性股骨头坏死提供了理论基础。

雷公藤红素抑制前体脂肪细胞成脂分化的作用及机制研究

目的研究雷公藤红素(celastrol,Cela)对前体脂肪细胞(3T3-L1)成脂分化的抑制作用及其具体机制。方法采用CCK-8法确定雷公藤红素处理3T3-L1细胞的最佳浓度;油红O染色及免疫荧光法(脂肪细胞标志蛋白Perilipin1,Adiponectin)检测雷公藤红素对3T3-L1成脂分化不同时期的抑制作用;Western Blot(WB)检测不同浓度雷公藤红素处理后3T3-L1细胞中调控脂代谢以及分化相关蛋白的表达;对未分化(Con)、分化第1天(MDI)、分化第1天同时给药250 nmol·L^(-1)雷公藤红素(MCT)的3T3-L1细胞进行WB检测以及microRNA(miRNA)测序,qPCR验证筛选得到的miRNA,进行KEGG与GO富集分析;过表达mmu-miR-5121 mimics和inhibitor,WB检测相关蛋白的变化,油红O染色检测分化结果。结果Cela处理3T3-L1细胞的最佳浓度为250 nmol·L^(-1)和500 nmol·L^(-1);油红O染色及免疫荧光结果表明250 nmol·L^(-1)与500 nmol·L^(-1)Cela对3T3-L1成脂分化均有显著抑制作用,250 nmol·L^(-1)在3T3-L1成脂分化早期(第1天)便能显著抑制3T3-L1成脂分化;250 nmol·L^(-1)Cela处理3T3-L124 h后,能显著抑制3T3-L1中DFCP1、FAS、ACC、PPARγ等蛋白的表达;分化第1天FAS与ACC表达升高,采用250 nmol·L^(-1)Cela处理后,ACC、FAS蛋白表达显著降低;miRNA测序筛选后q PCR验证结果表明mmumiR-5121在分化第1天减少,但Cela处理后含量增加。转染5121 inhibitor提高了FAS与ACC的含量,5121 mimics则呈现相反作用。单独转染5121 inhibitor可使得3T3-L1分化成熟,而分化同时添加5121 mimics可以有效抑制分化。并且250nmol·L^(-1)Cela可以抑制5121 inhibitor引起的分化。结论250 nmol·L^(-1)雷公藤红素作用于3T3-L1成脂分化早期可显著抑制3T3-L1分化,其可能通过上调mmu-miR-5121的含量,抑制FAS与ACC的表达发挥作用。

天山茶藨对脂肪间充质干细胞成脂成骨分化的影响

目的探究天山茶藨(Ribes meyeri)对脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)成脂成骨分化的影响。方法对p9和p17代次的ADSCs进行成脂成骨的定向分化,通过β-半乳糖苷酶染色、荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)测定细胞中P16 INK4a、P53基因表达来检测细胞衰老情况;采用CCK-8法检测天山茶藨对ADSCs的细胞毒性,并利用细胞内活性氧类(reactive oxygen species,ROS)试剂盒检测天山茶藨对细胞内ROS含量的影响;将天山茶藨处理的衰老细胞进行成脂定向分化,年轻细胞进行成骨定向分化,并检测细胞中成脂标志基因LPL、PPARγ和成骨标志基因OCN、RUNX2、ALP的基因表达量;利用未分化、成脂成骨分化和天山茶藨处理的成脂成骨分化细胞构建加权基因共表达网络图谱(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA);对天山茶藨处理的衰老细胞成脂分化和年轻细胞成骨分化中差异表达基因进行KEGG富集。结果p17代次较之p9代次ADSCs细胞衰老程度加重,且衰老的ADSCs更易向成脂细胞分化,年轻的ADSCs则更易向成骨细胞分化;0.1 pg/μL天山茶藨促进ADSCs的细胞增殖,1 ng/mL和100 pg/mL天山茶藨降低ADSCs中ROS水平;天山茶藨抑制衰老ADSCs的成脂分化,促进年轻ADSCs的成骨分化;衰老和年轻ADSCs具有不同的基因表达模式,天山茶藨在成脂分化过程中改变衰老ADSCs的表达模式;天山茶藨对ADSCs成脂成骨分化的影响与TGF-β、精氨酸生物合成信号通路相关。结论天山茶藨促进年轻ADSCs的成骨分化,抑制衰老ADSCs的成脂细胞。

东紫苏精油对间充质干细胞C3H10T1/2成脂分化的影响及机制

为探讨东紫苏精油对小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2成脂分化的作用及降脂机制,利用噻唑蓝[the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测细胞成活率,以界定浓度的适宜范围;用油红O染色法对东紫苏精油作用后的细胞成脂分化作用进行分析;甘油磷酸氧化酶—过氧化物酶(glycerol phosphate oxidase-p-aminophenazone,GPO-PAP)法、胆固醇氧化酶、过氧化物酶和4-氨基安替比林苯酚(cholesterol oxidase,peroxidase and 4-aminoantipyrine phenol,COD-PAP)酶法检测东紫苏精油处理后细胞内甘油三酯、胆固醇含量的变化;荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和蛋白质印迹(western blot)分别检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxide proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding proteinsα,C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein4,FABP4)mRNA和相关蛋白在成脂分化中的表达水平。结果表明:与空白对照组相比,高脂模型组的总胆固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triacylglyceride,TG)含量显著增加(P<0.05),小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中PPARγ、C/EBPα、FABP4 mRNA和蛋白表达明显增加。与高脂模型组相比,中剂量(50μg/mL)和高剂量(100μg/mL)精油组TC和TG含量明显下降,小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中PPARγ、C/EBPα、FABP4 mRNA和蛋白表达明显下降。试验结果表明,东紫苏精油可能通过调控PPARγ/C/EBPα/FABP4信号通路发挥对C3H10T1/2细胞成脂分化的抑制作用,达到减脂目的。

复方补肾活血颗粒含药血清经β-catenin/TRIB3调控人骨髓间充质干细胞成骨成脂分化

目的探讨复方补肾活血颗粒(Compound Kidney-invigorating Granule,CKG)含药血清基于β-catenin/tribbles假激酶3(tribbles pseudokinas 3,TRIB3)调控人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨成脂分化的作用机制。方法纯化原代BMSCs;BMSCs转染β-catenin-siRNA,成骨诱导后,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、茜素红染色观察BMSCs成骨分化情况,qPCR法、Western blot法分别检测β-catenin、TRIB3、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、ALP mRNA及蛋白表达水平;Western blot法检测CKG对BMSCs中β-catenin及TRIB3蛋白表达水平的影响;BMSCs转染β-catenin-siRNA,CKG含药血清培养后,ALP染色、茜素红染色及油红O染色观察BMSCs成骨成脂分化情况,qPCR法、Western blot法分别检测β-catenin、TRIB3、OPN、RUNX2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、adiponectin mRNA及蛋白表达水平。结果BMSCs转染β-catenin-siRNA后,ALP活力金氏单位值显著降低(P<0.05),矿化结节生成减少,TRIB3、OPN、RUNX2、ALP mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05);CKG能促进BMSCs中β-catenin、TRIB3蛋白的表达(P<0.05)。BMSCs转染β-catenin-siRNA并用CKG含药血清干预后,5%含药血清+siRNA组细胞中钙钴染色结块与红色钙化结节数量多于0%含药血清组,低于5%含药血清组;5%含药血清+siRNA组细胞中脂肪粒数量多于5%含药血清组,低于0%含药血清组;5%含药血清+siRNA组TRIB3、OPN、RUNX2 mRNA和蛋白表达水平,ALP活力金氏单位值显著高于0%含药血清组(P<0.05),低于5%含药血清组和5%含药血清+阴性对照组(P<0.05);5%含药血清+siRNA组中PPARγ、adiponectin mRNA和蛋白表达水平低于0%含药血清组(P<0.05),高于5%含药血清组和5%含药血清+阴性对照组(P<0.05)。结论内源性敲低β-catenin抑制BMSCs的成骨分化能力,降低TRIB3的表达;CKG含药血清促进BMSCs中β-catenin与TRIB3的表达;CKG含药血清可以调控BMSCs成骨成脂分化,其作用机制可能与β-catenin/TRIB3通路相关。

猪微小RNA⁃15b前体突变对其生物学加工过程及前体脂肪细胞分化的影响

基于在猪微小RNA⁃15b(miR⁃15b)前体(pre⁃miR⁃15b)基因位点第58位碱基上发现了1个C>T突变(+58C>T),本试验旨在探究此突变对微小RNA(miRNA)生物学加工过程以及对猪前体脂肪细胞分化的影响。试验通过构建野生型(pmR⁃miR⁃15bW)和突变型(pmR⁃miR⁃15bM)miR⁃15b过表达载体,分别转染猪原代前体脂肪细胞进行miR⁃15b的过表达试验,然后利用实时荧光定量PCR对比2组细胞pre⁃miR⁃15b和miR⁃15b成熟体的表达量,在体外细胞水平明确+58C>T对miR⁃15b生物学加工过程的影响;随后,诱导转染了不同基因型miR⁃15b过表达载体(pmR⁃miR⁃15bW和pmR⁃miR⁃15bM)的猪前体脂肪细胞成脂分化,利用实时荧光定量PCR对比2组细胞miR⁃15b靶基因叉头框蛋白O1(FOXO1)(可抑制脂肪细胞分化)以及成脂分化相关基因的相对表达量,同时结合油红O染色,明确此突变对猪前体脂肪细胞分化的影响。结果表明:2组细胞miR⁃15b初级转录本(pri⁃miR⁃15b)的表达量没有显著差异(P>0.05),而突变组pre⁃miR⁃15b、miR⁃15b和微小RNA⁃16(miR⁃16)表达量极显著低于野生组(P<0.01);突变组分化前FOXO1相对表达量极显著高于野生组(P<0.01),分化后成脂分化相关基因固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP⁃1c)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)相对表达量极显著低于野生组(P<0.01),脂肪细胞蛋白2(aP2)相对表达量低于野生组(P>0.05);油红O染色结果表明突变组细胞脂滴含量明显低于野生组。综上可知,+58C>T阻碍了pri⁃miR⁃15b到pre⁃miR⁃15b的生物学加工过程,导致miR⁃15b成熟体表达量下降,其靶基因FOXO1相对表达量增高,从而抑制猪前体脂肪细胞分化。

lncRNA2099对猪前脂肪细胞增殖、分化标志基因的影响

为了探究lncRNA2099对猪前脂肪细胞增殖分化的影响,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测lncRNA2099在猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背肌和背脂及离体培养的前体脂肪细胞增殖和分化阶段的表达水平;利用核质分离技术确定lncRNA2099在脂肪细胞中的表达位置;构建真核表达载体pcDNA3.1-lncRNA2099,采用qRT-PCR技术检测在脂肪细胞内过表达该lncRNA后对脂肪细胞增殖、分化相关标志基因表达的影响。结果显示:lncRNA2099存在明显组织表达特异性,且在肾脏和背脂中高表达,在背肌中不表达;lncRNA2099在猪前脂肪细胞增殖阶段12 h表达量最高,随后逐渐降低。在分化阶段第2天表达量最高,随后逐渐降低。核质定位结果表明,lncRNA2099在细胞核与细胞质中均有表达;在脂肪细胞内过表达lncRNA2099后,增殖标志基因P21与成脂分化标志基因LPL表达量极显著升高。lncRNA2099可能作为转录调节因子抑制猪前脂肪细胞增殖、促进成脂分化。