北京黑猪脂肪前体细胞的分离培养及成脂诱导分化研究

旨在建立北京黑猪脂肪前体细胞的分离培养及成脂诱导分化培养体系,为研究猪脂肪沉积的分子机制提供试验材料,为生物培育肉的制备提供技术指导。本研究采集1头7日龄健康的北京黑猪公猪的颈部皮下脂肪组织,使用机械法联合I型胶原酶消化法分离脂肪前体细胞。对获得的脂肪前体细胞进行形态观察、生长曲线绘制、免疫荧光鉴定、成脂诱导分化、油红O染色、BODIPY染色、甘油三酯含量测定及使用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测成脂分化相关基因的表达。结果表明,分离的北京黑猪脂肪前体细胞贴壁后呈长梭形,细胞生长曲线呈S型。免疫荧光结果表明,PREF1表达为阳性,表明分离的细胞的确为脂肪前体细胞。在相同的诱导试剂组合条件下,使用10%FBS比2%FBS成脂诱导分化效果更好。在相同血清浓度的情况下,鸡尾酒法与油酸钠、罗格列酮共同联用的细胞分化效果较好。分化8 d的细胞中出现大量的脂滴,脂滴经油红O染色呈红色,经BODIPY染色呈绿色。且分化8 d的细胞中甘油三酯的含量显著升高(P<0.001)。qPCR结果显示,PPARγ、CEBPα、ACCα、LPL、SCD和FABP4在分化2 d时表达量均显著升高(P<0.05),4~6 d达到高峰,8 d时表达量降低。Western blot结果表明,PPARγ、CEBPα、FABP4、APN在细胞分化过程中表达逐渐上调。PREF1在细胞分化过程中表达逐渐下调。在三维培养情况下,使用10%FBS,鸡尾酒法与油酸钠、罗格列酮共同联用也能使脂肪前体细胞分化为成熟的脂肪细胞,分化8 d的细胞中脂滴经BODIPY和油红O染色后分别呈绿色和红色,且PPARγ、CEBPα、ACCα、LPL、SCD和FABP4在分化8 d的细胞中的表达量显著上调(P<0.001)。综上所述,本研究成功建立了北京黑猪脂肪前体细胞的分离与培养体系,并筛选出适合二维和三维培养的成脂诱导分化方法,为进一步研究猪脂肪沉积的分子机制和改善肉品质奠定基础,也为细胞培育肉的制备提供技术指导。

成脂诱导剂通过PP2Ac调控人肝星状细胞活化的体外研究

目的:研究成脂诱导剂MDI对活化的人肝星状细胞的作用及其机制。方法:体外培养人肝星状细胞系LX-2细胞,实验分为4组,即空白对照组、溶剂对照组、重组人转化生长因子β1(TGF-β1)组、TGF-β1+MDI组。油红O染色法检测细胞内脂滴变化,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测肝纤维化标志物肌动蛋白α2(ACTA2)、Ⅰ型胶原蛋白α1(COL1A1)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)基因相对表达量。线粒体特异性荧光探针检测TGF-β1/MDI干预后LX-2细胞内线粒体数量的变化。采用western blotting法检测各组蛋白磷酸酶2A催化性C亚基(PP2Ac)蛋白表达。结果:与空白对照组和溶剂对照组比较,TGF-β1组LX-2细胞胞体增大、呈多边形且胞质增多、未见明显脂滴、线粒体数量增加,肝纤维化标志物ACTA2、COL1A1和TIMP-1mRNA表达水平以及PP2Ac去甲基化蛋白表达水平升高(均P<0.01)。与TGF-β1组比较,TGF-β1+MDI组细胞变小、胞质内小脂滴数量增加、线粒体数量减少,ACTA2、COL1A1和TIMP-1 m RNA表达水平以及PP2Ac去甲基化蛋白表达水平降低(均P<0.05)。结论:TGF-β1和MDI可能通过调控肝星状细胞的PP2Ac去甲基化水平调控人肝星状细胞活化,且与脂质生成以及线粒体数量有关。

大鼠毛囊干细胞的成骨及成脂诱导

目的毛囊干细胞在体外培养下可向软骨、骨骼、脂肪等细胞分化。文中研究毛囊干细胞的培养方法及其成脂和成骨分化的能力。方法采用显微分离技术联合两步酶消化法获得毛囊干细胞,差速贴壁法对毛囊干细胞进行提纯,利用体积分数10%胎牛血清的角质细胞无血清培养基进行培养,应用流式技术对干细胞进行CD34、β1整合素、CK15检测。第3代毛囊干细胞分别使用成骨及成脂诱导液进行培养。结果培养后的毛囊干细胞形态均匀一致,折光性强,呈典型的"铺路石"状,流式细胞仪检测CD34、β1整合素、CK15分别表达为59.6%、97.2%、61.1%,第3代细胞生长曲线显示细胞生长情况良好。经成骨诱导21 d后茜素红染色可见钙结节形成,成脂诱导14 d后油红O染色后可见脂滴形成。结论培养的毛囊干细胞具有很强的生长活性,并具有多向分化的潜能。

人牙周膜干细胞的成脂诱导实验研究

目的体外分离培养成人的牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSC),并进行成脂诱导实验。方法取新鲜拔除正畸牙的牙周膜为材料制成组织块,加入培养液分离培养,免疫磁珠法筛选人牙周膜干细胞,加入成脂诱导液诱导牙周膜干细胞向脂肪细胞转化。结果成功筛选人牙周膜干细胞,成脂诱导成功。结论免疫磁珠法是筛选人牙周膜干细胞的有效方法,人牙周膜干细胞可以向脂肪细胞分化。

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。

人脂肪干细胞的分离和成脂诱导及鉴定

人的脂肪干细胞是来源于脂肪组织的干细胞,具有自我更新及多向分化的能力,在适宜诱导条件下可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等。目的:从人脂肪组织中分离出脂肪干细胞,检测人脂肪干细胞的分化能力。方法:分离出的脂肪干细胞经成脂诱导后,用油红O染色和流式细胞术对已分化脂肪细胞进行鉴定。结果:检测细胞表面抗原CD34-和CD90+的比例,油红O染色鉴定脂肪细胞。

过表达Fad24对猪DFAT细胞在Dex成脂诱导条件下对胞内受体及辅助分子表达的影响

旨在探讨过表达Fad24对猪去分化脂肪细胞(DFAT)在成脂诱导条件下对胞内地塞米松(Dex)受体GR及其高亲和性辅助分子Hsp90和FKBPs表达的影响。用过表达载体pcDNA-Fad24和空载体pcDNA瞬时转染猪DFAT细胞,并在高浓度Dex(1μmol/L)成脂诱导液中诱导成脂分化,然后根据形态学观察检测诱导分化情况,用Real-time PCR和Western blot技术检测对GR及Hsp90和FKBPs表达的影响。结果显示,pcDNA空载体组在诱导5 d时可诱导出成脂细胞,而pcDNA-Fad24过表达组完全抑制成脂分化,细胞积聚形成多个小结节,诱导7 d后形成典型的成骨样结节,茜素红染色证实结节表面有矿化物质沉积。Real-time PCR检测证实,过表达组GRαmRNA的表达量在成脂诱导48 h显著上调(P<0.01),而GRβmRNA的表达量在成脂诱导12 h显著上调(P<0.01);GR的高亲和性辅助分子Hsp90 mRNA的表达量在成脂诱导48 h显著上调(P<0.01);FKBP 51 mRNA的表达量在成脂诱导24 h显著上调(P<0.01),而FKBP 52 mRNA的表达量在成脂诱导48 h显著上调(P<0.01)。Western blot检测证实,上述各因子的蛋白质表达谱与mRNA表达谱基本一致。过表达Fad24对猪DFAT细胞由成脂分化向成骨分化转化作用,与成脂诱导48 h时调控GRα及其Hsp90和FKBP 52表达的上调,以及GRβ和FKBP 51表达下调相关。

不同浓度胰岛素样生长因子-1对人脐带间充质干细胞诱导成脂后生长状态的影响

目的探讨不同浓度胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)诱导成脂后生长状态的影响。方法培养hUCMSCs并传代,将第3代hUCMSCs随机分为5组,成脂肪诱导24h后,分别加入40、60、80、100、120 ng/mL的IGF-1,对5组样本进行四甲基偶氮唑盐检测,测量光密度。于第9天行油红O染色。结果各组细胞生长趋势一致,光密度值之间的差异无统计学意义。5组细胞均有红色脂滴形成,80、100、120 ng/mL组成脂数量明显多于40和60 ng/mL组(P<0.01);80、100、120 ng/mL组3组之间成脂数量上的差异无统计学意义。结论不同浓度IGF-1对hUCMSCs诱导成脂后的生长状态无明显影响,但较高浓度的IGF-1能明显促进hUCMSCs向脂肪细胞分化,且以80 ng/mL为最适宜浓度。

左归丸、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导的影响

目的:研究左归丸、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)成脂诱导的影响,并探讨其相关的作用机制。方法:将90只SD雌性大鼠,随机选取10只作为正常组,其余80只再随机选取10只经双侧腰背部切口切除卵巢周围少量脂肪组织作为假手术组,其余70只以相同切口切除双侧卵巢作为模型组,分别以正常组,假手术组,模型组,左归丸组(18.9 g·kg^(-1)),右归丸组(20.52 g·kg^(-1)),共同药组(15.12 g·kg^(-1)),滋阴药组(12.96 g·kg^(-1)),补阳药组(8.1 g·kg^(-1))和戊酸雌二醇片组(0.36 mg·kg^(-1))共9组,对BMSCs进行干预,流式细胞仪鉴定BMSCs,用油红O检测脂滴的形成;采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ),脂蛋白脂肪酶(lipoprotein,LPL),脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)mRNA的表达;采用蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ)蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组BMSCs明显向脂肪细胞分化,PPARγ,LPL,FABP4 mRNA表达及C/EBPβ蛋白的表达明显升高(P<0.05);与模型组比较,左归丸、右归丸及其拆方均可抑制BMSCs向脂肪细胞分化,其中右归丸组可明显下调PPARγ,LPL,FABP4 mRNA,降低C/EBPβ的蛋白的表达(P<0.05)。结论:左归丸、右归丸及其拆方均能抑制BMSCs的成脂分化,且右归丸抑制成脂分化的作用优于左归丸,以及补阳药及二者的共同药组。

壳多糖酶3样蛋白1对人脐带来源间充质干细胞成脂和成骨分化的调控作用

目的探讨壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)对人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSC)成脂和成骨分化的调控作用。方法复苏并培养hUC-MSC,流式细胞术检测细胞表面标志物CD14,CD34,CD45,CD73,CD90和CD105;成脂和成骨诱导分化后,油红O染色和碱性磷酸酶(ALP)染色检测体外成脂和成骨分化能力,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测成脂和成骨关键转录因子mRNA表达,即脂肪酶(ADI)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)mRNA表达及ALP和骨桥蛋白(OPN)mRNA表达。利用慢病毒载体构建稳定敲低CHI3L1的hUC-MSC(shCHI3L1-MSC)和对照hUC-MSC(shNC-MSC),同上鉴定其生物学特征。shCHI3L1-MSC和shNC-MSC体外成脂诱导分化后,油红O染色检测细胞内脂滴数目,RT-qPCR检测ADI和PPAR-γmRNA表达;成骨诱导分化后,ALP染色检测ALP染色面积,RT-qPCR检测ALP和OPN mRNA表达。结果培养的hUC-MSC高表达CD73,CD90和CD105,低表达或不表达CD14,CD34和CD45;成骨诱导分化后,与未诱导组相比,诱导组ALP活性增加,ALP和OPN mRNA表达显著增加(P<0.01);成脂诱导分化后,经油红O染色,诱导组出现大量红色脂滴,ADI和PPAR-γmRNA表达显著增加(P<0.01)。敲低CHI3L1基因,hUC-MSC表面标志物、成脂和成骨分化能力生物学特性未发生改变。shNC-MSC和shCHI3L1-MSC成脂和成骨诱导分化后,shCHI3L1-MSC诱导组脂滴数及ADI和PPAR-γmRNA表达均显著高于shNC-MSC(P<0.01),ALP活性及ALP和OPN mRNA表达均显著低于shNC-MSC(P<0.01),提示hUC-MSC敲低CHI3L1基因后成脂分化能力增强,成骨分化能力降低。结论CHI3L1参与hUC-MSC体外成脂和成骨分化调控。

雌激素受体alpha对大鼠骨髓基质细胞诱导分化成脂的调控作用

目的:研究雌激素受体-α(ER-α)与脂肪代谢的相关性。方法:培养大鼠骨髓基质细胞(rBMSC)并传代,将第3代rBMSC随机分为3组,一组为对照组,一组用脂质体转染法转入体外构建的ER-α高表达的重组质粒,一组加入10-6mol/L的雌激素受体的抑制剂枸橼酸他莫西芬(Tamoxifen citrate),Western blot检测转染前后及加入抑制剂前后2组细胞中ER-α的表达变化;对以上3组细胞进行成脂肪诱导;10 d后对3组细胞进行油红O染色,计算红色脂滴的数量,通过多个样本均数的方差分析比较3组之间的差别。结果:Western blot检测到转染后,ER-α的条带表达增强;加入抑制剂后,ER-α的条带表达减弱。3组不同处理的细胞形成脂滴数量的差异有显著统计学意义,P值均<0.01。3组细胞形成脂滴的数量为:ER-α低表达组>对照组>ER-α高表达组。结论:大鼠骨髓基质细胞成脂肪分化过程中,ER-α的表达影响脂肪细胞的形成与分化,推测ER-α抑制脂肪细胞形成。

不同浓度枸橼酸他莫西芬对大鼠骨髓基质干细胞诱导成脂后生长状态的影响

目的:通过观察在不同浓度枸橼酸他莫昔芬处理下,大鼠骨髓基质干细胞(rBMSCs)诱导成脂后生长状态的变化,初步探讨用于促进骨髓基质干细胞诱导成脂的最适枸橼酸他莫西芬浓度。方法:培养大鼠骨髓基质干细胞并传代,将第三代的骨髓基质干细胞随机分为三组,分别在加入10-6mol/L,10-7mol/L,10-8mol/L的枸橼酸他莫西芬24h后,进行成脂肪的诱导。分别对三组样本进行四甲基偶氮唑盐检测(MTT检测),测量其光密度值(opticaldensity,OD值)。取第8天的样本进行油红-O染色,计算红色脂滴的数量,并通过多个样本均数的方差分析比较三组之间的差别。结果:①各组OD值之间的差异没有统计学意义(P>0.05);②10-6mol/L组成脂数量明显多于10-7mol/L组和10-8mol/L组,P值均小于0.01;而10-7mol/L和10-8mol/L两组之间在成脂数量上的差异没有显著统计学意义(P>0.05)。结论:10-6mol/L为枸橼酸他莫西芬促进大鼠骨髓基质干细胞诱导成脂的适宜浓度。

树鼩骨髓间充质干细胞体外分离培养及成脂成骨诱导

目的探讨树鼩骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的体外分离、传代及定向诱导为脂肪细和成骨细胞的可行性。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法对树鼩骨髓间充质干细胞进行体外分离、扩增、纯化,倒置相差显微镜进行形态学观察。用成脂诱导液(DMEM/F12+10%FBS+100 U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+1.0μmol/L地塞米松+0.2 mmol/L吲哚美辛+0.01 mg/mL胰岛素+0.5 mmol/L IBMX)和成骨诱导液(高糖DMEM+10%FBS+100 U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+50 ng/mL BMP-2)对分离的树鼩BM-MSCs分别定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结果原代和传代细胞为梭形或三角形,可增殖形成克隆。BM-MSCs成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色可观察到矿化结节。结论密度梯度离心联合贴壁培养法分离培养树鼩BM-MSCs简便可行,获得的BM-MSCs可体外诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。

膜联蛋白A1在兔骨髓间充质干细胞体外诱导成骨和成脂早期的表达

背景:骨髓间充质干细胞分化过程中膜联蛋白A1表达变化的研究报道各有不同看法。目的:分析兔骨髓间充质干细胞在体外诱导成骨和成脂过程中膜联蛋白A1基因的表达变化。方法:应用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,分别加入含成骨诱导剂、成脂诱导剂及不添加任何诱导剂的培养基进行培养。结果与结论:膜联蛋白A1基因在成骨诱导过程中与未诱导细胞相比有明显下调趋势,差异有显著性意义(P<0.01),而在成脂诱导剂中则为上升(P<0.01)。成骨诱导剂对细胞生长存在抑制作用并增加细胞凋亡(P<0.01),而成脂诱导剂对细胞生长与凋亡作用较小(P>0.05)。因此排除了诱导剂对细胞的作用之后,推测膜联蛋白A1基因可能与骨髓间充质干细胞体外向脂肪细胞分化存在一定关系,但尚不能肯定其在成骨分化中的作用。

兔脂肪干细胞的多向诱导分化

背景:研究表明脂肪干细胞体外特定诱导条件下实现了向骨、软骨、脂肪、肌肉、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞以及肝细胞方向分化。目的:进一步验证脂肪干细胞的分离培养方法及其基本生物学特性,并对细胞表型进行鉴定。方法:从成年日本大耳白兔的颈背部分离脂肪组织,通过Ⅰ型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞并培养,待细胞生长至约80%融合时传代,用倒置显微镜逐日观察细胞生长情况和形态特征,描绘其生长曲线;流式细胞技术检测细胞表面标记物;将脂肪干细胞行成骨和成脂诱导,分别通过碱性磷酸酶、茜素红、VonKossa(钙结节)染色和油红O染色检测脂肪干细胞成骨分化潜能和成脂分化潜能,以未诱导细胞作为对照组。结果与结论:体外培养的脂肪干细胞呈梭形纤维样细胞形态,增殖活跃,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈"S"型。流式细胞仪检测第3,6代脂肪干细胞均高表达CD29、CD44,阳性率超过90%;低表达CD34、CD45阳性率不超过5%,且CD29、CD44随着传代表达逐渐增高,CD34、CD45随细胞培养时间延长表达逐渐降低。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、vonKossa染色阳性,成脂诱导实验组油红O染色阳性,对照组均为阴性。结果证实,兔脂肪干细胞在体外易于分离培养,保持稳定增殖,并表达间充质干细胞相关的表型,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。

维甲酸和睾酮单独与联合诱导脂肪源干细胞周期的变化

背景:目前关于维甲酸对干细胞增殖作用的研究较少见,对睾酮的研究主要集中于其抑制细胞衰老的作用方面。目的:探索维甲酸和睾酮单独和联合诱导对脂肪源干细胞细胞周期的影响。方法:分离培养2月龄SD雌性大鼠脂肪源干细胞,传至第3代进行成脂、成骨诱导和表面标记鉴定。将其分为6组:1对照组。210-5 mol/L维甲酸组。310-6 mol/L维甲酸组。410-5 mol/L维甲酸+睾酮组。510-6 mol/L维甲酸+睾酮组。6睾酮组。对照组应用DMEM+体积分数10%胎牛血清培养液,其余各组均在对照组的基础上加相应剂量维甲酸或睾酮或二者联合诱导剂。各组培养36 h后行流式细胞仪检测各细胞分期的变化。结果与结论:与对照组相比,10-5 mol/L维甲酸组和10-6 mol/L维甲酸组G1期细胞数比例明显升高,S期细胞数比例明显降低。与对照组相比,睾酮组G1期细胞数比例明显下降,S期细胞数比例为明显上升。10-5 mol/L维甲酸+睾酮组与10-5 mol/L维甲酸组比较,10-6 mol/L维甲酸+睾酮组与10-6 mol/L维甲酸组比较,G1期细胞数比例有所下降,S期细胞数比例为明显上升。结果表明,维甲酸可将脂肪源干细胞周期阻滞于G1期,延缓细胞周期由G1期向S期的进程;睾酮可加速脂肪源干细胞周期由G1期向S期的进程;联合诱导可加速脂肪源干细胞的细胞周期由G1期向S期的进程。

3种人类间充质干细胞体外增殖能力和成脂能力的比较

目的:从人足月胎儿的脐带组织和胎盘组织中分离、培养间充质干细胞(MSCs),观察人脐带组织MSCs(UC-MSCs)、胎盘组织MSCs(PL-MSCs)和胚胎组织MSCs(FT-MSCs)体外增殖能力和成脂分化潜能,为干细胞进一步应用于临床提供实验依据。方法:无菌条件下获取人足月胎儿脐带组织和胎盘组织,通过Ⅰ型胶原酶酶解法分离出UC-MSCs和PL-MSCs,FT-MSCs由中科生物工程有限公司提供,取第3或4代MSCs进行检测。倒置显微镜观察细胞形态;活细胞计数法检测细胞增殖能力;流式细胞术测定UC-MSCs、PL-MSCs和FT-MSCs细胞周期并鉴定细胞表面标志物的表达阳性率。取3种组织来源的第3代MSCs进行成脂诱导,诱导18d进行油红O染色,观察并比较3种不同组织来源MSCs的成脂能力。结果:从3种不同组织中均可获取梭形贴壁的MSCs,表面标记物CD44、CD73、CD90和CD105均呈阳性表达,CD14、CD34和CD45均为阴性表达;FT-MSCs增殖能力明显强于UC-MSCs和PL-MSCs(P<0.01),FT-MSCs、UC-MSCs和PL-MSCs的增殖指数(PI)分别为(36.66±1.30)%、(18.23±1.10)%和(10.03±1.20)%,3种MSCs的PI比较差异均有统计学意义(P<0.01)。3种MSCs经过成脂诱导液诱导后,油红O染色结果均为阳性,但是UC-MSCs体外成脂能力(油红O染色阳性率)明显强于FT-MSCs和PL-MSCs(P<0.01)。结论:3种不同组织来源MSCs在形态和细胞表面标记物等方面相似,FT-MSCs具有更强的增殖能力和增殖活性,UC-MSCs具有更强的体外成脂潜能。

左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响

目的研究左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)PPARγ、LPL、FABP4mRNA的影响。方法分别以空白对照组(CON)、模型组(OVX)、假手术组(SHAM)、左归丸组(ZGW)、右归丸组(YGW)、共同药组(GTY)、滋阴药组(ZYY)、补阳药组(BYY)和补佳乐组(BJL)共9组对BMSCs进行干预,MTT法检测各组BMSCs增殖情况;流式细胞仪鉴定BMSCs;用Q-PCR法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome Proliferator-Activated Receptorγ,PPARγ),脂蛋白脂肪酶(lipoprotein,LPL),脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)mRNA的表达。结果左、右归丸及其拆方均可显著下调BMSCs PPARγ、LPL、FABP4mRNA的表达,其中YGW组可显著下调PPARγ、LPL、FABP4的mRNA(P<0.05)。结论左、右归丸及其拆方均能抑制BMSCs的成脂分化,且"右归丸"抑制成脂分化的作用优于"左归丸",以及纯阳药及二者的共同药组。

CRISPR系统促进脂肪干细胞成骨分化与抑制成脂分化的研究

本研究旨在优化组织培养法分离小鼠脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs),为研究成骨分化和成脂分化在间充质干细胞分化过程中的相互影响奠定基础。通过细胞形态学观察、细胞生长曲线和流式仪器检测所分离获得的间充质干细胞的特性,利用CRISPR-dCas9系统在快速促进间充质干细胞成骨分化的前提下观察其对成脂分化的影响,并通过生化染色、实时荧光定量PCR和免疫细胞学等手段进行分析。结果显示,接种3~5 d后可见细胞从组织块周围爬出,光镜下可见细胞形态多为成纤维细胞样的梭形细胞,且形态单一均匀,具有较高的爬出率,可以大大提高脂肪间充质干细胞的分离效率;通过CRISPR-dCas9系统激活Runx 2和Osterix基因后可以促进间充质干细胞的成骨分化,实时荧光定量PCR及油红O染色结果显示,CRISPR-dCas9系统可以同时抑制间充质干细胞的成脂分化;通过CRISPR-dCas9-KRAB系统同时抑制成骨相关基因Runx 2和Osterix后可以促进成脂分化。本研究利用组织贴壁法成功获得了高纯度的脂肪间充质干细胞,具有间充质干细胞的特性和分化能力;利用CRISPR系统可以同时过表达Runx 2和Osterix两个基因,可以在进成骨分化的同时抑制成脂分化,表明成脂分化和成骨分化的相关性,为基因编辑在间充质干细胞诱导分化和临床应用方面提供了新的思路和方法。

不同成脂条件下人骨髓间充质干细胞的早期成脂特性

背景:目前骨髓间充质干细胞的成脂诱导方法众多,其主要诱导成分包含吲哚美辛或罗格列酮。各种方法均能诱导骨髓间充质干细胞成脂分化,但其成脂诱导效率和机制尚缺少相互对比。目的:比较不同成脂诱导方法对人骨髓间充质干细胞的早期成脂效果,并探讨其成脂诱导差异的可能机制。方法:分离培养人骨髓间充质干细胞,通过油红O染色和成脂相关基因检测,比较3种不同诱导方法对人骨髓间充质干细胞的成脂效果。在诱导早期不同时间点(0,1,3,7 d)检测成脂相关基因PPARγ,C/EBPα,Adiponectin,Leptin mR NA表达。Western blot检测成脂诱导第7天时PPARγ、C/EBPβ蛋白表达,并比较DIMI,DIMR对PPARγ-Ser273位点磷酸化作用。结果与结论:(1)油红O染色和成脂相关基因检测结果显示,在骨髓间充质干细胞成脂诱导分化第7天,DIMR组成脂效果明显强于DIM组和DIMI组;(2)Western blot检测结果显示在成脂第7天,DIMI组PPARγ、C/EBPβ蛋白表达量高于其他组,差异有显著性意义;(3)DIMR组PPARγ-Ser273位点磷酸化比例低于DIMI组;(4)结果表明,含罗格列酮的成脂培养基DIMR对人骨髓间充质干细胞的早期成脂诱导作用最强,且该作用可能与减少PPARγ-Ser273位点磷酸化有关。