广州管圆线虫感染的观察与成虫特异性肌蛋白-1基因的扩增

目的 观察广州管圆线虫在非适宜宿主体内的移行过程 ,探寻该病新的更有效的诊断方法 .方法 用广州管圆线虫第三期幼虫 ,经灌胃和腹腔注射两种方式感染小鼠 .分别于感染后第 4、2 0、30天随机抽取小鼠进行解剖 ,观察其脑组织的病理改变 ;并从脑组织分离和计数虫体 ;同时采集小鼠的全血、血清和脑脊液样本待检 .根据广州管圆线虫成虫特异性肌蛋白 - 1基因的序列 ,设计半嵌套式PCR引物扩增成虫DNA和检测感染小鼠样本 .结果 ①小鼠感染以 30条幼虫 /鼠为宜 ,经灌胃与经腹腔注射感染无显著性差异 ;②感染后 30天从小鼠脑组织内检获的虫体数较 2 0天时显著下降 ;③感染后第 30天小鼠脑组织病理改变及其程度类似第 2 0天或略轻 ;④PCR扩增产物经测序证实 :其与广州管圆线虫基因序列完全一致 .结论 ①广州管圆线虫在非正常宿主体内也会出现类似在适宜宿主体内的移行过程 ,只是向脑组织外的移行在时间上明显延迟 .②用PCR方法扩增成虫DNA获得成功 。

IGF-1基因转染促进胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞中IGF-1、肌球蛋白、肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白-T的表达

目的观察胰岛素样生长因子-T(IGF-1)基因转染对胚胎干细胞(ES细胞)诱导分化的心肌细胞中IGF-1、肌球蛋白(myoglobulin)、肌动蛋白(actin)及心肌特异性肌钙蛋白-T(Troponin-T)表达的影响。方法将含有IGF-1基因的真核质粒转染入大鼠胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞中,采用免疫组织化学方法对心肌细胞内上述4种蛋白的表达进行检测。利用HPIAS-2000图像分析系统测定4种蛋白在各组中表达的平均吸光度值和平均阳性面积率。结果IGF-1基因转染后的心肌细胞内上述4种蛋白的表达明显高于未转染的对照组(P<0.05)。结论IGF-1基因转染的心肌细胞较未转染的心肌细胞合成IGF-1、肌球蛋白、肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白-T的能力增强,为IGF-1基因治疗心肌梗死提供了实验依据。

人内皮细胞特异性分子-1的转染及其在ECV304中的表达

目的 构建人内皮细胞特异性分子 1(ESM 1)真核表达载体 ,转染人脐静脉内皮细胞系ECV30 4 ,并在ECV30 4中获得表达。方法 将ESM 1cDNA插入真核载体pIRES的多克隆位点中 ,转染人脐静脉内皮细胞。原位杂交 ,免疫组化检测ESM 1基因的表达。结果 构建的表达载体经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列分析证实 ,转染后发现ESM 1的表达在转录和蛋白水平都明显的增加。结论 成功构建了人ESM 1真核表达载体和转染了人脐静脉内皮细胞系ECV30 4 ,并获得高水平的表达 ,为进一步研究作好准备。

重组人Jo-1自身抗原的克隆、原核表达及抗原特异性鉴定

目的:旨在获得高纯人Jo-1抗原(即组氨酰-tRNA合成酶)。方法:利用RT-PCR从人胎盘总RNA中获得Jo-1的编码基因,并分别用IMPACT-CN和pMAL系统的pTYB11、pMAL-c质粒,构建了表达载体,转化至大肠杆菌ER2566、BL21。结果:经筛选与鉴定,得到阳性重组子诱导表达后均获得Jo-1融合蛋白。Western blot显示,这两种融合蛋白都具有Jo-1抗原特异性,即仅与含Jo-1抗体的多肌炎和皮肌炎自身免疫病患者血清反应,而与正常人以及188例含有其他自身抗体(分别为RNP阳性、Sm阳性、Ro/La阳性和RNP/Ro阳性)的患者血清均为阴性反应。结论:在两种表达载体中,pMAL-c-Jo-1的表达量超过菌体蛋白的50%,而且以可溶性形式存在,有利于分离纯化,为临床检测创造了条件。

MEK转染的内皮细胞表达人内皮细胞特异性分子-1的初步研究

目的 人内皮细胞特异性分子 1(Humanendocellular specificmolecule 1,ESM 1)表达载体的构建及其体外表达 ,表达产物的纯化及多克隆抗体和单克隆抗体的制备。重组MEK基因的真核转染 ,转染的内皮细胞中ESM 1的表达。方法 用PCR方法扩增ESM 1的基因片段 ,扩增产物与T Vector连接 ,构建克隆载体 pGEM T ESM 1。在宿主菌中扩增重组质粒 ,提取质粒并进行酶切纯化 ,将目的基因插入pET 2 8b中构建成表达载体 ,再次转化入大肠杆菌XL1 blue ,蓝白选择、耐药性标记粗筛并挑取阳性克隆 ,经限制性内切酶酶谱分析、DNA序列分析两种方法鉴定。然后提取质粒 ,转化入大肠杆菌BL 2 1,用IPTG诱导表达。表达产物行SDS PAGE ,割下所需条带 ,用电洗脱方法纯化得到所需目的蛋白。免疫新西兰纯种大白兔 ,制备多抗 ,并用免疫双扩散法测定抗体效价 ;免疫BALB/C小鼠 ,制备抗人ESM 1的单克隆抗体。用重组MEK()基因转染人脐静脉内皮细胞ECV30 4 ,加以鉴定 ,并检测转染细胞中ESM 1表达的改变。结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为 pET - 2 8b -ESM - 1重组质粒 ,SDS -PAGE证实获得的融合蛋白分子量为 2 4ku ,表达量约占菌体总蛋白的 2 4 %。所得多抗效价为 1:16 (免疫双扩散 ) ,单抗效价为 1:6 0 0 0

乳癌组织中BCSG1、MMP-2及ETS-1蛋白的表达

目的:检测乳癌组织中BCSG1、MMP-2及ETS-1蛋白的表达。方法:收集人乳腺浸润性导管癌标本40例、癌周不典型增生组织40例及癌周正常乳腺组织40例,采用Westernblot法检测3种组织中BCSG1、MMP-2及ETS-1蛋白的表达情况。结果:3种组织中BCSG1、MMP-2及ETS-1蛋白的表达差异有统计学意义(FBCSG1=105.032,FETS-1=81.343,FMMP-2=112.570,P均<0.001),且乳癌组织中以上3种蛋白的表达均高于癌周不典型增生组织及癌周正常乳腺组织(P<0.05)。有淋巴结转移的乳癌组织中3者的表达均高于无淋巴结转移的乳癌组织(P<0.05)。乳癌组织中BCSG1的表达与ETS-1及MMP-2的表达呈正相关(r=0.664、0.810,P<0.05)。结论:BCSG1、MMP-2及ETS-1与乳癌的浸润转移密切相关。

遵义地区汉族HLA-DRB1、DQB1等位基因多态性的研究

目的:从基因水平调查遵义地区汉族人群HLA-DRB1、DQB1等位基因频率,并了解其多态性分布状况。方法:应用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法对遵义汉族200名健康个体进行HLA-DRB1、DQB1等位基因分型。结果:遵义地区汉族HLA-DRB1、DQB1等位基因频率分布,在中低分辨水平,共检出13个DRB1基因,7个DQB1基因,DRB1*09、DRB1*08及DQB1*05基因频率相对较高;DRB1*10及DQB1*04基因频率相对较低。与我国北方、南方汉族比较,更接近南方汉族人群。结论:遵义汉族人群HLA-DRB1、DQB1基因具有较为丰富的多态性,其分布符合南方汉族的特点,可能与重庆汉族人群有较为密切的民族融合。

51例安徽汉族免疫性不育症患者与HLA-DQA1基因相关性及免不Ⅲ号的治疗

目的探讨抗精子抗体阳性的免疫性不育症患者与人类白细胞抗原-DQA1(human leucocyte anti-gen-DQA1,HLA-DQA1)基因的相关性及中医药治疗与HLA-DQA1基因型的关系。方法 采用聚合酶链反应-序列特异性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP)技术,对51例抗精子抗体阳性的免疫性不育症患者和60名正常健康人的HLA-DQA1基因进行分型研究,并对患者用中医免疫方免不Ⅲ号(生地、白芍、山萸肉、山药、枸杞子、丹皮、麦冬)治疗3个月。结果 免疫性不育症组HLA-DQA1*0401等位基因频率明显高于正常对照组(χ2=29.869,P<0.01),免不Ⅲ治疗后,27例HLA-DQA1*0401转阴22例(81.5%),差异有统计学意义(χ2=5.24,P=0.022)。结论 HLA-DQA1*0401等位基因可能是抗精子抗体阳性的免疫性不育症的易感基因,HLA-DQA1*0401等位基因的患者经中药治疗有效。

基于环介导等温扩增快速检测转基因大豆SHZD32-1成分

转基因大豆SHZD32-1是由我国自主研发的耐除草剂抗性品系。为给该品系转基因生物安全监管提供技术支撑,本研究开发其转基因成分的快速便捷式检测方法,主要基于环介导等温扩增技术,设计并筛选该转化体最佳特异性LAMP引物组,优化扩增温度和时间,并分析灵敏度、特异性及稳定性,建立SHZD32-1的LAMP检测体系。结果显示:在62~64℃条件下反应40~60 min扩增效果最佳;灵敏度标准达到质量分数0.05%,高于普通PCR(0.1%);特异性和稳定性较高,检测结果同普通PCR扩增一致。转基因大豆SHZD32-1成分LAMP技术不需要特殊仪器,检测时间短,结果可视化,灵敏度、特异性和稳定性高,有望用于转基因耐草甘膦大豆SHZD32-1的现场快速检测。

8-羟基鸟嘌呤糖苷酶1基因多态性与食管癌关系

目的研究8-羟基鸟嘌呤糖苷酶1(hOGG1)基因Ser326Cys多态与淮安食管癌易感性的关系.方法采用配对病例-对照的流行病学方法,运用人工修饰双等位基因特异性引物扩增(diASA-AMP)技术分析了106对正常对照和食管癌患者hOGG1基因第326位Ser/Ser、Ser/Cys和Cys/Cys基因型分布,并比较不同基因型与食管癌发病风险的关系.结果对照人群的Ser/Ser、Ser/Cys和Cys/Cys基因型频率分别为19.8%,47.2%和33.0%,与现有的中国人群资料结果相近,等位基因型的测序结果与diASA-AMP结果相符.食管癌病例组、对照组的hOGG1 3种基因型分布的差异无统计学意义(χ2=1.439,P=0.696).携带至少一个hOGG1 326Cys突变基因(Ser/Cys和Cys/Cys)与食管癌危险性无明显相关(OR=1.385;95%CI=0.678～2.823),亦未见hOGG1 Ser 326Cys基因多态与吸烟之间的交互作用.结论 hOGG1 Ser326Cys基因多态与淮安地区食管癌易感性无相关性,在食管癌发病风险上该位点多态与吸烟无明显交互作用;diASA-AMP是特异性较高的单核苷酸多态(SNP)快速检测方法,在人群肿瘤易感基因快速筛检方面有较好的应用前景.

FAE1启动子的克隆和转γ-TMT基因大豆的获得

脂肪酸链延长酶组分1(FAE1)是广泛存在于植物中催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶,该反应是脂肪酸碳链延长的限速步骤,在油料种子胚中特异性表达.以拟南芥基因组DNA为模板,设计引物,扩增到该基因的启动子片段.序列分析表明,该片段长度为943 bp,与GenBank注册序列AF355982达99.5%同源,并含有与之完全相同的种子特异性表达元件,据此认定它具有种子特异性启动活性.将其与甘蓝型油菜γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因连接,构建成表达载体pFAE1-TMT,通过农杆菌介导的方法转化大豆胚尖,获得28株卡那霉素抗性筛选植株,进一步PCR检测获得2株转γ-TMT基因植株.

血清p16基因甲基化联合CYFRA21-1检测在肺癌诊断中的应用

目的:通过联合检测血清DNA中p16基因的异常甲基化以及血清细胞角蛋白CYFRA21-1的含量,以探讨两者联合检测在肺癌早期诊断中的临床意义。方法:分离提取53例肺癌患者的外周血血清DNA,采用巢式甲基化特异性PCR方法检测p16基因的甲基化状态,同时应用放射免疫法测定血清CYFRA21-1的含量,并与18例肺部良性疾病患者(BLD)和25例健康体检者作对照,分析两者联合应用的临床诊断价值。结果:在38例肺癌患者血清中检测到了p16基因的甲基化,阳性率为71.7%,而CYFRA21-1的阳性率为64.2%;平行联合检测时敏感性增至89.4%。BLD组中p16基因甲基化与CYFRA21-1阳性率分别为22.2%和11.1%;健康对照者血清中p16基因均无异常甲基化。结论:联合检测血清p16基因甲基化与CYFRA21-1含量可提高肺癌诊断的敏感性和特异性,对于肺癌的早期诊断具有重要意义。

广西地区壮、汉族系统性红斑狼疮与HLA-DRB1等位基因相关性研究

目的:探讨广西地区壮、汉族系统性红斑狼疮(SLE)与HLA-DRB1等位基因的相关性。方法:用聚合酶链式反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法,分别对52例SLE壮族患者和70名壮族健康人,45例SLE汉族患者和60名汉族健康人的HLA-DRB1等位基因进行研究。结果:壮族SLE患者HLA-DRB11401及DRB116两个等位基因的频率低于正常对照组(RR=0.2813,χ2=5.0024,P=0.0252及RR=0.3889,χ2=3.9527,P=0.0466),患者组和对照组均未检出HLA-DRB108、DRB111和DRB113等位基因;汉族SLE患者HLA-DRB115等位基因的频率高于正常对照组(RR=2.5333,χ2=8.4006,P=0.0037),患者组未检出HLA-DRB111、DRB113等位基因,对照组亦未检出HLA-DRB113等位基因。结论:提示HLA-DRB11401及DRB116等位基因可能是广西地区壮族人SLE的保护基因,未发现易感基因。提示HLA-DRB115等位基因可能是广西地区汉族人SLE的易感基因。

广东地区汉族人HLA-DQB_1基因对胃溃疡患者的遗传易感性研究

目的探讨广东地区汉族人人类白细胞抗原-DQB1(HLA-DQB1)基因与胃溃疡(GU)的遗传关联。方法应用HLA基因的聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)核苷酸分型技术,对135例GU患者和105例正常人的HLA-DQB1等位基因进行分析。结果GU患者HLA-DQB1*0602等位基因频率与正常对照组比较明显增高,差异有显著性(P=0.001,RR=0.115,Pc=0.014),而GU患者HLA-DQB1*0604等位基因频率与正常对照组比较明显降低,差异有显著性(P=0.001,RR=17.290,Pc=0.014)。结论HLA-DQB1*0602基因对GU患者有遗传易感作用,而HLA-DQB1*0604基因对GU患者有遗传抵抗作用,GU患者与正常人之间存在着免疫遗传异质性的差异。

转基因番木瓜55-1品系的环介导等温扩增检测方法的建立

根据55-1的品系特异性序列设计了5套LAMP引物,筛选扩增效率高的引物。对筛选到的LAMP引物的反应温度和反应体系进行了优化,并进行了特异性、灵敏度和稳定性的实验。结果表明,该套LAMP引物的特异性和稳定性良好,灵敏度为0.05%,最快能在30 min内得到检测结果。建立的LAMP检测方法能有效地检测转基因番木瓜55-1品系,既简化了检测步骤,又缩短了检测时间,为转基因番木瓜的快速检测提供了技术支撑。

安徽汉族51例免疫性不育症中医证型与HLA-DQA1基因型的关系

目的:探讨抗精子抗体阳性的免疫性不育症患者与人类白细胞抗原-DQA1(Human LeococyteAntigen-DQA1,HLA-DQA1)基因的相关性及不同中医证型与HLA-DQAl等位基因的相关性。方法:采用聚合酶链反应序列特异性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP)技术,将51例抗精子抗体阳性的免疫性不育症中医分型为肾阴不足型、湿热内蕴型和瘀血阻滞型的患者与60名正常健康人的HLA-DQA1基因进行分型研究。结果:免疫性不育症组HLA-DQA1*0401等位基因频率明显高于正常对照组(χ2=29.869,P<0.01),免疫性不育症组DQA1*0301等位基因频率较正常对照组显著降低(P<0.01)。肾阴不足型免疫性不育症组HLA-DQA1*0301基因频率较正常对照组显著降低(P<0.01)。HLA-DQA1*0401基因频率较正常对照组显著升高(P<0.01)。结论:HLA-DQA1*0401等位基因可能是抗精子抗体阳性的免疫性不育症的易感基因,DQA1*0301可能是安徽汉族免疫性不育症的保护基因;免疫性不育症患者的中医证型肾阴不足型可能与DQA1*0401有关。

湖南汉族人群HLA-DRB1位点等位基因多态性与鼻咽癌的相关性研究

目的 探讨湖南汉族人群HLA -DRB1位点基因多态性与鼻咽癌遗传易感性之间关系。 方法 用多聚酶链反应 -序列特异性寡核苷酸探针斑点杂交方法 ,对 93例湖南汉族鼻咽癌患者与 93例健康对照作HLA -DRB1位点基因分型 ,采用 χ2 检验比较两组各位点等位基因频率分布差异。 结果 鼻咽癌组DRB1 0 80 1较对照组高 (χ2 =4.2 2 ,P =0 .0 4 ,RR =1 .95) ,DRB1 1 1 0 1较对照组降低 (χ2 =5 .2 8,p =0 .0 2 ,RR =0 .33) ,但P值经Bonferoni校正后 ,差异无显著性(Pc >0 .0 5)。 结论 本研究结果未能证实HLA

广西籍汉族SLE患者与HLA-DQA1等位基因的相关性研究

目的探讨广西籍汉族系统性红斑狼疮(SLE)及狼疮性肾炎(LN)患者与人类白细胞抗原-DQA1(HLA-DQA1)等位基因的相关性。方法用聚合酶链式反应-序列特异性引物法(PCR-SSP)对64例广西籍汉族SLE患者及60例汉族健康人群的HLA-DQA1频率进行检测和相关分析。结果在广西籍汉族人群中检出HLA-DQA1*0101、0102、0103、0104、0201、0301、0302、0401、0501、0601共10个亚型;SLE组HLA-DQA1*0101、0102等位基因频率较正常对照组显著升高(χ2=8.627,P=0.003,RR=3.421及χ2=8.965,P=0.003,RR=3.314);LN组HLA-DQA1*0102等位基因频率较无LN表现的SLE组显著升高(χ2=6.418,P=0.011,RR=4.688);LN组HLA-DQA1*0501等位基因频率较无LN表现的SLE组显著降低(χ2=6.130,P=0.013,RR=0.172);未发现与LN病理类型显著相关的HLA-DQA1等位基因。结论DQA1*0101、0102可能是广西汉族SLE的易感基因;DQA1*0102可能是广西汉族LN的易感基因,HLA-DQA1*0501可能是广西汉族LN的保护基因。

HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的 设计并合成人8 羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerheadribozyme)基因并构建其真核表达载体。鉴定含有核酶靶基因HOGG1cDNA保守序列的真核表达载体。方法 运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ) ,将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3 1中,重组子由BamHI和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。含有HOGG1基因cDNA保守序列的真核表达载体经BamHI和EcoRI酶切电泳鉴定。结果 RZ人工合成后与pcDNA 3 1连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI位点之间,命名为pcDNA 3 1 RZ。1 3kb的HOGG1基因cDNA保守序列准确克隆于pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI酶切位点之间,命名为pcDNA 3 1 HOGG1。结论 成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的真核表达载体。