大鼠成釉器细胞的分离纯化

目的：寻找一种大鼠成釉器细胞分离纯化的简捷方法。方法：分离出生后6dSD大鼠上下颌第一和第二磨牙完整牙胚，剥离牙囊和成釉器，酶消化法原代混合培养。采用多次差别消化法去除成纤维样细胞，纯化上皮样细胞，并进行抗角蛋白染色和RT—PCR检测釉原蛋白、成釉蛋白mRNA表达。结果：原代细胞为混杂细胞，经2～3次差别消化可完全去除成纤维样细胞。上皮样细胞呈多角形，铺路石样生长，抗角蛋白染色阳性，表达釉原蛋白、成釉蛋白mRNA。结论：本研究通过多次差别消化获得了纯化的大鼠成釉器细胞。

改良组织块法原代培养大鼠成釉器细胞及其鉴定

目的建立改良组织块法体外培养成釉器细胞的方法,为成釉器细胞的体外培养提供新的实验方法。方法剥离出生4d的SD大鼠下颌磨牙牙胚,胶原酶消化1h,胰酶再消化5min,种植组织块于培养皿中。细胞长出组织块后,细胞刮刮除成纤维样细胞,继续培养,观察形态并应用免疫细胞化学法及RT-PCR法鉴定细胞。结果种植48h后即有细胞长出组织块,细胞主要为铺路石样的、边界整齐的上皮样细胞和梭形的成纤维样细胞。细胞刮刮除成纤维样细胞后,残留上皮样细胞和少量梭形细胞。角蛋白14免疫细胞化学检测显示,上皮样细胞染色阳性,梭形细胞染色阴性。RT-PCR结果显示,所培养的铺路石样上皮细胞釉原蛋白、成釉蛋白mRNA均有特异性表达。结论酶消化组织块法可用于成釉器细胞体外培养,为成釉器细胞的体外培养提供了新的实验方法。

机械损伤对小鼠切牙成釉器细胞Notch表达的影响

目的:研究机械损伤后小鼠切牙成釉器细胞中Notch信号的表达及变化。方法:通过磨除小鼠下颌切牙牙冠的1/2部分建立小鼠下颌切牙的机械损伤模型,并将其随机分为损伤后3、5、7 d组,同时以不做切牙磨除处理的小鼠作为正常对照;用免疫组织化学染色方法观察各组成釉器细胞中Notch1、Notch2的表达变化情况。结果:对照组中,Notch1、Notch2仅在中间层和星网状层细胞中微弱表达;损伤后3 d组,Notch1、Notch2在成釉细胞和中间层细胞均呈密集的阳性表达,在星网状层细胞有散在阳性表达;损伤后5 d组,Notch1、Notch2在成釉细胞、中间层、星网状层细胞仍呈明显的阳性表达;损伤后7 d组,Notch1、Notch2在各层细胞中的表达均较损伤后3、5 d组有所减弱。结论:机械损伤可激活小鼠切牙成釉器细胞中Notch信号的表达,从而参与调控切牙的损伤修复。

二氧化硫体内衍生物通过ROS/JNK/AP-1通路诱导大鼠切牙成釉器细胞AE2蛋白表达上调

探究二氧化硫体内衍生物混合液(亚硫酸钠与亚硫酸氢钠物质的量比为3∶1)对雄性大鼠切牙组织抗氧化防御系统及切牙成釉器细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号转导通路关键蛋白与阴离子交换蛋白2(anion exchanger 2,AE2)表达的影响。30只雄性Wistar大鼠按体质量随机分为高(100 mg·kg^(-1)·d^(-1))、中(50 mg·kg^(-1)·d^(-1))、低(25 mg·kg^(-1)·d^(-1))二氧化硫衍生物混合液染毒组、高剂量二氧化硫衍生物混合液+N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)染毒组及生理盐水对照组(0.9%氯化钠注射液)。各组均以2 mL·kg^(-1)每日行腹腔注射一次,高剂量+NAC组每次腹腔注射前30 min予200 mg·kg^(-1)NAC水溶液灌胃再施予高剂量组相同染毒操作,连续4周。取大鼠下颌骨切牙组织进行超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平测定。剥离包绕切牙根部的下颌骨分离成釉器细胞,以Western blot法检测成釉器细胞MAPKs信号通路关键蛋白及AE2蛋白表达情况。结果显示,低剂量染毒组与对照组比较,大鼠切牙组织多类抗氧化指标及过氧化产物含量的改变均不具统计学意义。中、高剂量染毒组较对照组大鼠切牙组织SOD活性、GSH-Px活性及GSH含量下降、MDA、ROS水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,随二氧化硫衍生物剂量升高,各组大鼠成釉器细胞p-p38 MAPK/p38 MAPK及p-ERK/ERK水平较对照组未见明显变化,而中、高剂量组p-JNK/JNK水平明显升高,AP-1蛋白发生核转位分布,AE2蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);而ROS抑制剂NAC能使高剂量下AP-1蛋白核转位情况得到改善,并能在一定程度上逆转高剂量二氧化硫衍生物暴露下引起的p-JNK/JNK水平升高及AE2蛋白表达上调。以上结果提示,二氧化硫体内衍生物混合液可造成大鼠切牙组织氧化应激水平升高并通过ROS/JNK/AP-1通路诱导切牙成釉细胞AE2表达上调,具有干扰成釉器细胞成釉功能的潜在毒性。

细胞外基质磷酸糖蛋白在牙齿组织中的表达

目的细胞外基质磷酸糖蛋白(matrix extracellular phosphoglycoprotein,MEPE)是新近在骨和牙齿组织中发现的蛋白。检测MEPE在牙齿组织中的表达以及随着组织分化MEPE表达的变化。方法通过免疫组化染色对MEPE蛋白在人牙胚中的表达进行初步定位。分别分离培养人的牙髓细胞和成釉器上皮细胞,应用半定量PCR技术探讨MEPE在这两种细胞中的时序表达变化。结果MEPE在成釉细胞、牙髓和成牙本质细胞中均有表达。MEPE的表达随着牙髓细胞的分化而逐渐下调。随着成釉器上皮细胞培养代次的增加,MEPE表达逐渐下降。结论MEPE的下调提示MEPE可能在牙齿硬组织的形成过程中起到调控作用。