雌激素受体对去势大鼠牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的:营造低雌激素微环境,通过牙周膜干细胞(PDLSCs)提取,来探讨雌激素受体对PDLSCs成骨分化能力的影响。方法:购入SD雌性大鼠16只,将其随机分为去势组与假手术组,分别给予相应的外科手术处理,完成大鼠模型建立;运用实时定量PCR法考察大鼠PDLSCs提取过程中雌激素受体以及成骨指标的变化。结果:去势组大鼠体重显著高于假手术组,雌二醇、股骨骨密度显著低于假手术组(P<0.05);去势组骨诱导培养第3、5、7、9、11天ALP活性检测结果均高于假手术组(P<0.05),第1、13天无差异;去势组ERαmRNA第5、9、11、13天显著低于假手术组;去势组ERβmRNA第5、7、11、13天显著低于假手术组;去势组ALP mRNA、BSP mRNA第5、7、9、11、13天均显著低于假手术组(P<0.05)。结论:去势大鼠牙周膜干细胞的成骨能力也会出现相应的减弱,在雌激素介导中,雌激素受体对牙周膜干细胞成骨分化能力发挥了非常重要的调控作用。

“红色复合体”致病菌裂解液对人牙周膜细胞成骨分化能力的影响

目的:探讨“红色复合体”牙周致病菌裂解液对人牙周膜细胞成骨分化能力的影响。方法:收集因正畸需要而拔除的健康前磨牙,原代培养人牙周膜干细胞(hPDLCs);采用免疫荧光方法和成骨分化诱导实验对培养的原代hPDLCs进行鉴定;体外联合培养牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体和福赛斯坦纳菌,建立“红色复合体”模型,扫描电镜对其进行鉴定;制备“红色复合体”裂解液,通过碱性磷酸酶试剂盒、实时定量PCR、茜素红染色,检测裂解液对hPDLCs碱性磷酸酶活性,成骨分化相关基因表达的影响;以及对hPDLCs成骨矿化能力的影响。结果:在“红色复合体”裂解液的刺激下,hPDLCs碱性磷酸酶活性,成骨分化相关基因ALP、Runx2、OPN、COL1的表达以及成骨矿化水平显著降低。结论:“红色复合体”牙周致病菌能够抑制hPDLCs的成骨分化能力。

炎症微环境下蛋白激酶样内质网激酶通路对牙周膜干细胞成骨分化能力调控机制研究

目的探讨炎症微环境下蛋白激酶样内质网激酶(PERK)通路对牙周膜干细胞成骨分化能力的调控机制。方法选择因正畸拔除的新鲜前磨牙或第三磨牙10例,牙周组织无炎症,完整无龋,患者年龄18~32岁。选择因慢性牙周炎而拔除的离体牙6例,患者年龄20~35岁。健康牙周膜干细胞(H-PDLSCs)和炎症牙周膜干细胞(P-PDLSCs)分别用正常和炎症牙周膜组织制备。采用免疫组织化学检测牙周膜组织中PERK通路相关因子PERK、CHOP、GRP78及ATF4的表达情况。构建稳定干扰PERK的炎症牙周膜细胞系(P-PDLSCs-PERK shRNA),采用RT-qPCR和Western blot检测PERK基因的抑制效率;对构建的稳定干扰PERK细胞系及另外3个对照组细胞P-PDLSCs-Vector、P-PDLSCs和H-PDLSCs进行成骨诱导,RT-qPCR检测成骨相关因子碱性磷酸酶(ALP)、Runx2及OCN的mRNA水平,Westernblot检测Runx2和OCN的蛋白水平,ALP染色鉴定ALP活性,茜素红染色分析细胞成骨能力。结果免疫组织化学结果表明,炎症组织中PERK信号通路相关因子PERK、CHOP、GRP78及ATF4均显著高于正常组织(P<0.05)。RT-qPCR及Westernblot检测结果显示,PERK基因抑制效率达到59%,PERK蛋白表达的抑制效率为54%。成骨相关因子的mRNA水平检测结果显示,诱导后P-PDLSCs和P-PDLSCs-Vector相差无几(P>0.05);诱导后H-PDLSCs中3种成骨相关因子水平显著高于前2种细胞(P<0.05);PERK基因被抑制诱导后P-PDLSCs-PERK shRNA相比未被抑制的PPDLSCs,3种成骨相关因子的基因表达均显著升高(P<0.05);成骨相关因子Runx2及OCN蛋白表达和ALP活性与mRNA水平保持一致。茜素红染色后,诱导后H-PDLSCs中矿化结石数量显著高于另外3种细胞(P<0.05),而诱导后PPDLSCs-Vector和P-PDLSCs差异无统计学意义(P>0.05);而相比诱导后P-PDLSCs,沉默PERK基因后的P-PDLSCs-PERK shRNA中形成矿化结石的数量明显回升(P<0.05)。结论炎症微环境能通过激活PERK信号通路抑制牙周膜干细胞的成骨分化能力,在PERK被沉默时,炎症微环境对牙周膜干细胞成骨分化能力的抑制作用能够得到逆转。

蛇床子素对脂肪干细胞成膜和成骨能力的影响

研究蛇床子素对脂肪干细胞增殖、细胞膜片形成和成骨分化能力的影响。方法 分离培养C57BL/6小鼠脂肪干细胞(ASCs)并鉴定其多向分化能力;根据细胞培养液中加入蛇床子素的含量(0、10-5、10-6、10-7mol/L)将细胞分为空白对照组、10-5组、10-6组和10-7组。CCK-8 法检测各组细胞增殖水平。用含蛇床子素的成膜诱导液诱导7天收获细胞膜片,冰冻包埋切片后焦油紫染色观察各组膜片厚度。用含蛇床子素的成骨诱导液培养ASCs和ASC膜片,成骨诱导7天后行碱性磷酸酶染色,成骨诱导28天后行茜素红染色,检测其成骨能力。Image J 测量膜片厚度和染色阳性区域面积。结果 蛇床子素对ASCs的增殖没有显著影响;10-7 mol/L蛇床子素可以使ASC膜片显著增厚(P<0.01);成膜诱导与蛇床子素二者联合运用对ASCs成骨能力有更好的促进作用,其中10-7 和10-6mol/L蛇床子素可显著促进ASC膜片的成骨能力(P<0.01),10-7组效果最好。结论 蛇床子素可以促进ASCs的成膜能力;成膜诱导与蛇床子素共同应用对于ASCs的成骨能力具有协同促进效应。

重组共表达质粒pIRES-hVEGF_(121)cDNA/hBMP-4转染骨髓间充质干细胞对其成骨分化的影响

背景:在许多情况下,人体组织修复是多因子共同协调作用的结果,因而共表达多基因载体的构建能够满足多因子基因治疗的需要,是近年来基因治疗的新思路。目的:观察重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的表达及其对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响,为骨缺损的联合基因治疗奠定基础。方法:使用全骨髓培养法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志抗原的表达;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒经酶切鉴定后,在脂质体介导下将其转入大鼠骨髓间充质干细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测;茜素红染色检测转染后大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。结果与结论:流式细胞仪检测显示CD90表达强阳性,CD45表达阴性;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中,并获得有效共表达;转染后第14天,茜素红染色阳性,能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,为骨缺损的联合基因治疗奠定了基础。

OPG过表达的ADSC对大鼠牙槽后槽骨缺损的修复作用

目的:探究骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)过表达的脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stem cell,ADSC)对大鼠牙槽后槽骨缺损修复的影响。方法:选择SD雄性大鼠38只,其中6只用于获得ADSC及ADSCOPG过表达转染,鉴定转染情况并观察不同ADSC的形态、成骨分化、成脂分化及增殖能力;其中8只作为对照组,另外24只建立牙槽后槽骨缺损大鼠模型,随机分为模型组、正常ADSC组和OPG过表达的ADSC组。6周后,Micro-CT扫描观察骨缺损愈合情况;苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察骨缺损组织病理改变;免疫组化分析组织中碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)的表达;Westernblot分析组织中OPG/核因子-κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclearfactor-κB ligand,RANKL)/核因子-κB受体活化因子(Receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)通路蛋白表达。结果:携带空载体与OPG过表达慢病毒的转染效率分别为75.23%和79.08%;两种ADSC均为长梭形;OPG过表达ADSC中的OPG蛋白表达水平、增殖能力、成骨能力明显高于正常ADSC,成脂能力明显低于正常ADSC(P<0.05);与对照组相比,模型组的牙槽后槽骨缺损体积、RANKL、RANK蛋白表达水平明显升高,Lane-Sandhu组织学评分、ALP、OCN阳性表达率、OPG蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与模型组相比,正常ADSC组获得与上述相反的结果;OPG过表达的ADSC组上述指标的变化幅度较正常ADSC组更显著。结论:OPG过表达的ADSC能够促进大鼠牙槽后槽骨缺损的修复。

ALP、Runx2及OCN在大鼠拔牙后牙槽骨来源BMSCs中的表达

目的:通过分离培养大鼠拔牙后不同时间点牙槽骨组织来源的骨髓间充质干细胞(BMSCs),探讨拔牙后不同时间点BMSCs的增殖及成骨分化能力。方法:选用8周龄健康雄性SD大鼠,拔除上颌右侧磨牙建立动物模型,分别于拔牙后1、4及12周处死大鼠。取拔牙后各时间点牙槽骨组织BMSCs进行培养及鉴定,通过cck-8检测各组BMSCs增殖情况,对比各组成骨诱导后茜素红染色及q-PCR检测钙结节形成及成骨相关基因的表达,比较各组BMSCs的增殖及成骨分化能力。结果:拔牙后各时间点获得的牙槽骨组织BMSCs增殖能力无差异;经成骨诱导后茜素红染色显示,拔牙后4周形成的钙结节最多,12周最少;成骨诱导后q-PCR检测ALP、Runx2、OCN的表达,结果 3种基因均在拔牙后4周时表达最高,12周时最低,且差异具有统计学意义。结论:拔牙后不同时间点牙槽骨组织BMSCs的增殖能力没有明显差异,但4周时来源的BMSCs成骨能力最强,与其他时间组有差异。