Chir99021调控Wnt/β-catenin信号通路抑制大鼠牙髓干细胞成骨诱导分化的机制

目的探讨Chir99021对大鼠牙髓干细胞(DPSCs)成骨诱导分化的影响及机制。方法原代分离大鼠DPSCs,利用荧光免疫法进行验证。设置不同浓度的Chir99021,通过CCK-8检测细胞增殖情况挑选最适浓度。利用茜素红染色验证细胞成骨诱导分化。最后通过Real-time PCR、Western blotting检测成骨诱导分化相关基因与蛋白无翅型MMTV整合位点家族成员1(Wnt1)、无翅型MMTV整合位点家族成员3A(Wnt3a)、β-连环蛋白(β-catenin)、轴抑制蛋白2抗体(Axin2)、骨钙素(OCN)、牙本质基质蛋白1(DMP1)的mRNA和蛋白表达情况。结果牙本质涎磷蛋白(DSPP)和干细胞标记物波形蛋白(vimentin)阳性表达,说明大鼠DPSCs分离成功。大鼠DPSCs成骨诱导后钙沉积物显著上升,加入糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的小分子抑制剂Chir99021后钙沉积物明显减少。大鼠DPSCs成骨诱导分化后Wnt1、Wnt3a、β-catenin、Axin2、OCN和DMP1表达明显上升,而加入Chir99021后Wnt1、Wnt3a、β-catenin、Axin2、OCN和DMP1蛋白表达均显著下降。结论Chir99021对诱导7 d后的大鼠DPSCs成骨诱导分化有一定的抑制作用。

大鼠脂肪干细胞体外培养及成骨诱导分化研究

目的:观察SD大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)体外培养的基本生物学特性、鉴定其诱导成骨分化潜能。方法:无菌条件下取6周龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,0.1%I型胶原酶消化,分离培养。显微镜下观察细胞形态;采用MTT比色法绘制细胞生长曲线;用流式细胞仪检测细胞表面标志物;取第3代细胞行成骨和成脂诱导培养,分别用碱性磷酸酶(ALP)、茜素红染色和油红O染色鉴定成骨诱导效果。结果:从SD大鼠脂肪组织中分离获得的ASCs呈长梭形或多角形,呈集落生长;细胞生长曲线呈"S"型,具有较强的增殖能力;流式细胞仪分析示:CD29、CD90高表达,CD34、CD45低表达;成骨诱导后ALP染色及茜素红染色阳性,成脂诱导后油红O染色阳性。结论:分离培养的细胞为ASCs,具有成骨潜能。

人牙周韧带细胞成骨诱导分化后的超微结构观察

目的观察成骨诱导分化培养前后,人牙周韧带细胞超微结构的变化。方法对人牙周韧带细胞进行体外培养,并进行成骨诱导分化,14d后行透射电子显微镜观察。结果体外成骨诱导分化培养后,人牙周韧带细胞内细胞器发达,数目较常规培养条件下明显增多。细胞内可见大量的基质小泡、髓样结构及中、低电子密度的圆形和椭圆形小泡样结构。结论人牙周韧带细胞是一种具有成骨潜能的细胞,经成骨诱导分化培养后,其超微结构具有成骨细胞和成牙骨质细胞的特点。

壳多糖酶3样蛋白1对人脐带来源间充质干细胞成脂和成骨分化的调控作用

目的探讨壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)对人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSC)成脂和成骨分化的调控作用。方法复苏并培养hUC-MSC,流式细胞术检测细胞表面标志物CD14,CD34,CD45,CD73,CD90和CD105;成脂和成骨诱导分化后,油红O染色和碱性磷酸酶(ALP)染色检测体外成脂和成骨分化能力,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测成脂和成骨关键转录因子mRNA表达,即脂肪酶(ADI)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)mRNA表达及ALP和骨桥蛋白(OPN)mRNA表达。利用慢病毒载体构建稳定敲低CHI3L1的hUC-MSC(shCHI3L1-MSC)和对照hUC-MSC(shNC-MSC),同上鉴定其生物学特征。shCHI3L1-MSC和shNC-MSC体外成脂诱导分化后,油红O染色检测细胞内脂滴数目,RT-qPCR检测ADI和PPAR-γmRNA表达;成骨诱导分化后,ALP染色检测ALP染色面积,RT-qPCR检测ALP和OPN mRNA表达。结果培养的hUC-MSC高表达CD73,CD90和CD105,低表达或不表达CD14,CD34和CD45;成骨诱导分化后,与未诱导组相比,诱导组ALP活性增加,ALP和OPN mRNA表达显著增加(P<0.01);成脂诱导分化后,经油红O染色,诱导组出现大量红色脂滴,ADI和PPAR-γmRNA表达显著增加(P<0.01)。敲低CHI3L1基因,hUC-MSC表面标志物、成脂和成骨分化能力生物学特性未发生改变。shNC-MSC和shCHI3L1-MSC成脂和成骨诱导分化后,shCHI3L1-MSC诱导组脂滴数及ADI和PPAR-γmRNA表达均显著高于shNC-MSC(P<0.01),ALP活性及ALP和OPN mRNA表达均显著低于shNC-MSC(P<0.01),提示hUC-MSC敲低CHI3L1基因后成脂分化能力增强,成骨分化能力降低。结论CHI3L1参与hUC-MSC体外成脂和成骨分化调控。

牙髓和牙周韧带间充质干细胞成骨能力差异分析研究

目的探究牙髓间充质干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)和牙周韧带间充质干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)在成骨能力上的差异机制。方法培养人牙髓干细胞和牙周干细胞(分为DPSCs组和PDLSCs组),比较两种干细胞诱导成骨分化能力的差异,通过实时荧光定量PCR检测成骨分化过程中关键转录因子的转录表达差异。同时,从GEO官网下载牙组织单细胞测序数据(GSE161267_RAW),通过比较干细胞亚群占比差异、调控成骨分化基因表达差异及生物学功能富集等揭示两种组织干细胞成骨分化功能差异的原因。结果成骨诱导分化结果显示,DPSCs组茜素红着色较PDLSCs组更深,运用RT-PCR检测成骨分化关键转录因子骨钙素(osteocalcin,OC)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RunX2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、破骨细胞抑制因子(osteoprotegerin,OPG)和骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)。结果显示,与PDLSCs组相比,DPSCs组Osteocalin、ALP、RunX2、OPG和BMP-2基因转录水平显著升高(**P<0.01,*P<0.05)。单细胞测序数据分析结果显示,牙周和牙髓组织中干细胞构成比例不同,其中牙周组织中MSC2和MSC3亚群占比多,牙髓组织中MSC1亚群占比多;MSC1中调控成骨分化基因表达显著高于MSC2和MSC3。差异基因生物学功能富集结果显示,MSC1亚群主要表现为成骨分化及参与成骨分化的信号通路。结论DPSCs较PDLSCs有更高的成骨分化功能,是由于DPSCs中成骨分化功能强大的细胞亚群含量高于PDLSCs。

微渠多孔羟基磷灰石支架诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的miRNA表达谱分析

背景:多孔羟基磷灰石支架具有良好的体内外成骨效能,但其所涉及的mi RNAs复杂调控机制相关研究较少。目的:探讨多孔羟基磷灰石支架材料介导大鼠骨髓间充质干细胞成骨矿化过程中相关miRNA表达谱的变化。方法:体外分离、培养和鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,将骨髓间充质干细胞与多孔羟基磷灰石支架共培养为实验组,骨髓间充质干细胞单独培养为空白对照组,分别进行成骨诱导7 d,运用miRNA高通量测序技术分析两组骨髓间充质干细胞成骨矿化过程中相关miRNA表达谱的变化并进行GO分析,筛选出两组中表达差异明显的mi RNA分子并进行q RT-PCR验证。结果与结论:①与空白对照组比较,成骨诱导7 d时实验组BMP2、ALP、Runx2 mRNA表达上调,其中BMP2上调明显(P <0.05);②micro RNA高通量测序结果显示mi R-210-3p、mi R-146a-5p等13个mi RNAs明显上调;let-7c-3p、let-3615等17个mi RNAs明显下调;③GO分析上调的mi RNA靶基因主要参与生物学调节、细胞基因表达、基因表达调节等,包括NF-κB、Toll样受体9、细胞间黏附、白细胞介素1调节、血管生成、Hippo等信号通路;④实时荧光定量q PCR验证结果显示mi RNA-210在实验组上调15倍,mi R-146a-5p在实验组上调10倍(P <0.05);⑤结果表明,新型微渠多孔羟基磷灰石支架可以通过上调骨髓间充质干细胞mi RNA-210-3p和mi R-146a表达,促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。

晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间充质干细胞的体外成骨分化

背景:间充质干细胞是组织工程中常用的种子细胞,而来源于人膝关节滑膜组织的间充质干细胞能否作为骨组织修复与再生中合适的种子细胞还需要进一步验证。目的:观察晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织来源的间充质干细胞体外向成骨细胞定向分化的潜能,对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定。方法:无菌条件下从行全膝关节置换的晚期骨关节炎患者膝关节腔内获取滑膜组织,Ⅰ型胶原酶消化分离获得有核细胞。以最适密度接种(200个有核细胞/cm2),挑选单细胞克隆,筛选出滑膜间充质干细胞。基础培养基培养,传至第3代时改换为含地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸的成骨诱导培养基诱导培养。结果与结论:体外分离培养的滑膜间充质干细胞早期可形成葵花样细胞集落,克隆样生长。传代至第3代,细胞呈成纤维细胞样生长,形态均一。滑膜间充质干细胞成骨诱导后呈典型的"铺路石样"成骨细胞形态,诱导至第7天碱性磷酸酶染色呈强阳性,碱性磷酸酶活性表达也在诱导7 d时达最高峰;诱导21 d茜素红染色可见大量钙结节形成;同时反转录PCR检测到Ⅰ型胶原、Runx2、骨结合蛋白和骨桥蛋白的表达在诱导后增加,21 d时表达最高。从晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织分离获得的滑膜间充质干细胞,在体外可成功诱导分化为成骨细胞,所诱导生成的细胞具有典型的成骨细胞特性。提示滑膜间充质干细胞有望成为骨组织工程理想的种子细胞来源,在骨组织的再生修复中发挥重要作用。

大鼠BMSCs成骨诱导及复合支架材料构建组织工程骨组织的研究

目的利用诱导成骨分化的骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)复合生物支架材料构建组织工程骨组织。方法采用密度梯度离心法获取大鼠骨髓间充质干细胞,原代培养扩增后,条件培养基诱导成骨分化作为实验组,并设非条件培养基培养为对照组。诱导培养后,通过碱性磷酸酶、钙结节染色;I型胶原、骨钙素检测鉴定成骨性。将诱导的BMSCs利用滴加法种入自制组织工程生物支架复合培养,采取扫描电镜、HE切片染色观察培养8天时细胞在支架内部的生长情况。结果密度梯度离心法获取培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形或三角形贴壁生长,以梭形为主;经成骨诱导剂诱导后细胞呈多角形贴壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性、茜素红染色出现阳性的钙化结节;Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组明显增加(<0.05);ELISA法检测骨钙素结果较对照组明显升高(<0.01)。HE切片染色可见支架内部有细胞长入,细胞呈圆形或椭圆形。扫描电镜可见支架内部有大量细胞长入,细胞粘附、生长良好,呈现完全伸展状态,细胞-支架-细胞之间有基质连接。结论本实验获取的原代细胞为骨髓间充质干细胞,诱导剂诱导后成功分化为成骨细胞。采用经诱导成骨后的细胞作为组织工程骨构建的种子细胞,与三维支架材料复合后共培养,使构建的组织复合物更接近骨组织,为临床大段骨缺损的修复增加可能性。

CRISPR系统促进脂肪干细胞成骨分化与抑制成脂分化的研究

本研究旨在优化组织培养法分离小鼠脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs),为研究成骨分化和成脂分化在间充质干细胞分化过程中的相互影响奠定基础。通过细胞形态学观察、细胞生长曲线和流式仪器检测所分离获得的间充质干细胞的特性,利用CRISPR-dCas9系统在快速促进间充质干细胞成骨分化的前提下观察其对成脂分化的影响,并通过生化染色、实时荧光定量PCR和免疫细胞学等手段进行分析。结果显示,接种3~5 d后可见细胞从组织块周围爬出,光镜下可见细胞形态多为成纤维细胞样的梭形细胞,且形态单一均匀,具有较高的爬出率,可以大大提高脂肪间充质干细胞的分离效率;通过CRISPR-dCas9系统激活Runx 2和Osterix基因后可以促进间充质干细胞的成骨分化,实时荧光定量PCR及油红O染色结果显示,CRISPR-dCas9系统可以同时抑制间充质干细胞的成脂分化;通过CRISPR-dCas9-KRAB系统同时抑制成骨相关基因Runx 2和Osterix后可以促进成脂分化。本研究利用组织贴壁法成功获得了高纯度的脂肪间充质干细胞,具有间充质干细胞的特性和分化能力;利用CRISPR系统可以同时过表达Runx 2和Osterix两个基因,可以在进成骨分化的同时抑制成脂分化,表明成脂分化和成骨分化的相关性,为基因编辑在间充质干细胞诱导分化和临床应用方面提供了新的思路和方法。

荷斯坦奶牛乳腺干细胞的成骨诱导及鉴定

背景:课题组已经完成乳腺干细胞向神经细胞和脂肪细胞的诱导,该实验诱导乳腺干细胞分化为成骨细胞,进一步丰富其分化潜能多样性,对乳腺干细胞的研究具有重要意义。目的:探讨荷斯坦奶牛乳腺干细胞定向诱导分化为成骨细胞的潜能。方法:分离纯化的荷斯坦奶牛乳腺干细胞系,由内蒙古生物制造重点实验室提供。取第4代乳腺干细胞加入成骨诱导液培养21 d,采用茜素红染色法和RT-PCR技术进行鉴定。结果与结论:荷斯坦奶牛乳腺干细胞经成骨诱导后,细胞边缘模糊,细胞中有颗粒状钙化结节出现,经茜素红染色呈阳性,诱导后成骨细胞标记性基因Alpl和Bglap呈阳性表达,表明了荷斯坦奶牛乳腺干细胞具有分化为成骨细胞的潜能。

SDF-1α复合Pluronic F-127对兔上颌窦底提升术成骨影响的实验研究

目的 :通过制备基质细胞衍生因子(SDF1-α)的Pluronic F-127复合凝胶材料,观察这种复合材料在体外对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的矿化及成血管作用和复合凝胶材料在兔上颌窦外提升术中的成骨及成血管效果。方法:将兔骨髓间充质干细胞、50ng/ml SDF1-α和质量百分比浓度0.1%的Pluronic F-127复合培养,MTT法检测其细胞毒性,碱性磷酸酶活性测定及茜素红染色。将18只新西兰大白兔双侧进行上颌窦外提升术,双侧植入不同的复合材料(共3种)并进行对照。材料分别为:β-磷酸三钙(β-TCP),生理盐水及SDF-1α复合Pluronic F-127凝胶。于术后4、8、12周处死,X线片观察双侧上颌窦骨质形成情况,行HE染色、CD31+、CD34+、BMP-2及VEGF免疫组织化学染色观察成骨及成血管作用,并进行统计学分析。结果:体外实验采用MTT法证实了0.1%w/w Pluronic F-127无细胞毒性(P>0.05)。BMSCs-SDF1α复合凝胶碱性磷酸酶染色下,细胞质可见大量碱性磷酸酶染色沉淀,其余3组未见沉淀。BMSCs-SDF1α复合凝胶、BMSCs-单纯凝胶、单纯BMSCs在成骨诱导培养条件下均产生矿化结节,非成骨诱导组未见矿化结节形成。体内实验,X线片结果显示BMSCs-SDF1-α复合凝胶及β-TCP充填侧均有阻射影,生理盐水组未见明显阻射影;HE染色结果显示BMSCs-SDF1-α复合凝胶成骨效果与β-TCP成骨效果明显,生理盐水组未见骨质形成,统计学分析表明BMSCs-SDF1-α复合凝胶成血管作用较β-TCP及生理盐水组明显增加。结论:SDF-1α复合Pluronic F-127凝胶能够成功诱导BMSCs分化为成骨细胞,无细胞毒性,在体外及兔上颌窦内成骨、成血管效果明显。

2型糖尿病大鼠脂肪干细胞体外成骨能力的研究

目的:比较2型糖尿病(T2MD)大鼠和正常SD大鼠脂肪来源干细胞(ASCs)的增殖及多向分化能力。方法:取16只SPF级8周龄SD大鼠,随机分为两组(n=8):糖尿病组,采用高脂高糖饲料构建T2DM大鼠模型;对照组常规饲料喂养,比较两组大鼠的血糖水平。建模成功8周后,分别培养两组大鼠腹股沟处的ASCs,显微镜下观察细胞形态;CCk-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞表面标志物;取第3代细胞行成骨和成脂诱导实验,实时定量PCR检测成骨诱导7 d时成骨相关基因的表达。结果:两组大鼠脂肪组织均可分离获得ASCs,且细胞形态和增殖能力无显著差异(P>0.05);两组细胞均高表达CD44和CD90,低表达CD34和CD45;T2DM大鼠P3代ASCs成脂诱导后油红O染色较正常组强,而成骨诱导后碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色较正常组弱;ALP蛋白活性检测较正常组低;ALP、OCN、OPG和RUNX2等成骨相关基因的表达水平较正常组低。结论:T2DM大鼠ASCs体外成骨分化能力较弱。

诱导hBMSCs成骨分化中微小RNA和靶基因表达水平的变化

目的明确萎缩性骨不连组织中表达上调的数种微小RNA(micro RNA,miRNA)与其相应靶基因mRNA、蛋白在hBMSCs成骨分化过程中的表达变化趋势和生物学功能。方法取自体髂骨植骨手术患者的髂骨骨髓血,采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs。取第4代hBMSCs以成骨诱导培养液诱导成骨分化,分别提取0、12 h,1、2、4、7、14 d时的细胞总RNA和蛋白,进行miRNA的实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、相应靶基因mRNA的qRT-PCR和蛋白Western blot检测。结果诱导hBMSCs成骨分化时,成骨性靶基因碱性磷酸酶(alkalinephosphatase liver/bone/kidney,ALPL)、PDGF-α多肽(PDGF-αpolypeptide,PDGF-A)和BMP-2的mRNA和蛋白表达在多数时间点同对照(0 h)相比增加(BMP-2在12 h和1 d时下降),1～7 d变化最为显著。不同时间点的miRNA、靶基因mRNA和蛋白表达水平存在差异,其中hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p miRNA含量的变化趋势与各自靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白表达水平总体上成负相关(P<0.05),hsa-miRNA-221与其靶基因PDGF-A的变化趋势无明显负相关关系(P>0.05)。结论诱导hBMSCs成骨分化过程中,hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p对其相应靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白存在密切调控关系。

芳香化酶和雌激素相关受体在人骨髓间充质干细胞中的表达

背景:骨髓间充质干细胞中可能存在芳香化酶和雌激素受体相互作用的雌激素信号途径,调控骨髓间充质干细胞生物活性。目的:观察成人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中芳香化酶和雌激素相关受体的表达。方法:将骨髓间充质干细胞分为单纯培养组和成骨诱导组,分别用低糖DMEM完全培养基和成骨诱导分化完全培养基培养,MTT检测细胞增殖能力,茜素红染色观察成骨矿化能力,q PCR和Western blot检测芳香化酶、雌激素受体α、雌激素受体β和雌激素受体相关受体αm RNA和蛋白表达,ELISA检测细胞上清液和裂解液中雌二醇水平。结果与结论:培养72 h,成骨诱导组增殖能力最强;培养21 d,成骨诱导组茜素红染色显示大量钙沉积;q PCR和Western blot结果显示成骨诱导组能促进芳香化酶和雌激素受体αm RNA和蛋白表达,抑制雌激素受体相关受体αm RNA和蛋白表达,成骨诱导组雌激素受体βm RNA和蛋白表达与单纯培养组无差异;ELISA结果显示成骨诱导组上清液中雌二醇水平高于裂解液及单纯培养组上清液中雌二醇水平。结果表明成人骨髓间充质干细胞及成骨诱导分化后能表达芳香化酶、雌激素受体α、雌激素受体β和雌激素受体相关受体α,亦能自身合成和分泌雌激素,由此产生的雌激素可能是通过相关受体对骨髓间充质干细胞成骨分化发挥作用。

新短肽P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石材料生物活性的评价

背景:胶原基质矿化磷灰石材料具有仿生的化学组成及良好的生物学性能,已被用于某些骨缺损修复;新短肽P17-骨形态发生蛋白2具有良好的生物相容性和成骨诱导生物活性,因此将新短肽P17-骨形态发生蛋白2与胶原基质矿化磷灰石材料制备成复合支架材料可望提升骨修复效率和效果。目的:探讨新型P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石复合材料的生物活性。方法:将兔骨髓间充质干细胞分别接种于新型P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石复合材料与胶原基质矿化磷灰石材料上,培养3,7 d后,利用RT-PCR检测细胞碱性磷酸酶mRNA相对表达。将新型P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石复合材料(实验组)与胶原基质矿化磷灰石材料(对照组)分别埋置于SD大鼠皮下,植入12,35 d后进行Masson染色后组织学分析。将新型P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石复合材料(实验组)与胶原基质矿化磷灰石材料(对照组)分别植入日本大耳白兔下颌骨箱状缺损处,植入5,15周后进行大体与X射线检查。实验经中国医科大学附属口腔医院伦理委员会批准。结果与结论:①复合材料组培养7 d的碱性磷酸酶mRNA表达高于胶原基质矿化磷灰石组(P<0.05);②皮下埋植实验显示两组材料和组织界面均未引起明显的急性炎症反应,植入后35d实验组可见更多的纤维细胞与材料嵌合;③骨缺损修复实验中,大体观察显示两种材料均具有良好的骨修复能力,植入5周时缺损区已有缩小趋势,植入15周缺损表面比较平整;X射线检查显示与对照组相比,实验组缺损区缩小趋势更明显;④结果表明,新型P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石复合支架材料具有比胶原基质矿化磷灰石更为优良的生物活性与骨缺损修复能力。

微重力对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化影响的研究

目的研究微重力对骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞（OB）分化的影响。方法小鼠股骨离断法提取BMSCs，传代扩增。取第4代BMSCs分为4组：①正常重力组（NG组），正常重力条件下无成骨诱导。②微重力组（MG组），微重力条件下无成骨诱导。③正常重力诱导组（NG＋I组），正常重力条件下行成骨诱导。④微重力诱导组（MG＋I组），微重力条件下行成骨诱导，培养10d。噻唑蓝（MTT）法测定各组BMSCs的增殖；茜素红染色检测细胞基质钙沉积；细胞碱性磷酸酶（ALP）活性测定以计算其在细胞基质中的表达；实时定量PCR（qPCR）及WesternBlot检测相关基因及蛋白表达。结果MG组细胞培养4d后数量开始多于NG组（P〈0．05）；茜素红染色示BMSCs诱导10d，NG＋I组出现较多的矿化结节，而MG组基本无矿化结节，NG组和MG＋I组出现的结节均较少；qPCR结果示NG组和MG组中COLI、ALP、RUNX-2基因的相对值分别为2．41±0．30VS0．56±0．19、2．15±0．12vs0．16±0．15、0．98±0．12VS0．16±0．05，差异均有统计学意义（P〈0．05）；MG＋I组上述3种基因相对值也均低于NG＋I组：1．79±0．10vs0．59±0．04、1．57±0．19vs0．57±0．08、1．30±0．14VS0．74±0．05，差异均有统计学意义（P〈0．05）；WesternBlot检测结果与qPCR基本一致，即微重力条件能明显抑制成骨相关蛋白的表达。结论微重力条件可促进BMSCs增殖，抑制BMSCs向成骨细胞的分化。

利用CRISPR-dCas9系统促进脂肪干细胞的成骨诱导分化

为了建立一种快速促进脂肪间充质干细胞成骨诱导分化的方法,本研究利用CRISPR-dCas9系统快速激活成骨前体基因的表达,通过对细胞内前体基因转录的检测和诱导分化后茜素红染色来确定成骨诱导分化的效率。结果可见,通过CRISPR-dCas9系统可以快速地启动RUNX2和OSX基因的转录;经成骨诱导分化后茜素红染色显示,基因编辑过的细胞成骨诱导更快。本研究结果表明,通过CRISPR-On系统可以有效地促进成骨前体细胞相关基因RUNX2和OSX的表达,从而使得骨前体细胞相关基因可以被快速地内源性激活,使得脂肪间充质干细胞快速进入成骨诱导分化状态,促进成骨分化的潜能。

下调microRNA-34a增强对人脂肪干细胞成骨诱导分化作用的初步探索

目的:颅颌面临界骨缺损是整复外科常见疾患,常常给患者的身心带来障碍和压力。为解决骨形成不足这一难题,我们拟通过表观遗传修饰的手段,调节microRNA-34a在人脂肪干细胞中的表达,来探讨microRNA-34a对人脂肪干细胞成骨诱导分化的影响。方法:分离培养原代人脂肪干细胞,以慢病毒为转染载体,分三组对其进行上调、下调microRNA-34a的表达及阴性对照。然后对其进行成骨诱导培养,于诱导的第7天行碱性磷酸酶(ALP)染色,第14天行茜素红(Alizarin Red)染色,定性比较转染后人脂肪干细胞成骨诱导分化的效果。结果:成功分离和培养原代人脂肪干细胞,并以慢病毒高效率转染调控microRNA-34a的表达。对比碱性磷酸酶和茜素红染色可见下调microRNA-34a组成骨效率最高,其次是阴性对照组,上调组效率最低。结论:1.人脂肪干细胞通过慢病毒转染获得高效率的表观遗传修饰;2.下调microRNA-34a的表达对人脂肪干细胞成骨的诱导分化有一定的促进作用。

辛伐他汀对大鼠BMSCs成骨诱导Wnt信号传导通路相关因子mRNA表达的影响

目的探讨辛伐他汀(simvastatin,SIM)对大鼠BMSCs成骨分化过程中Wnt信号传导通路相关因子mRNA表达的影响,研究SIM促进BMSCs成骨分化的作用机制。方法取6周龄雌性SD大鼠双侧股骨、胫骨骨髓细胞,全骨髓培养法进行原代和传代培养。取第2代细胞换用成骨诱导培养基培养,并将细胞分为2组,实验组加入1×10-7mol/LSIM,对照组加入等量无水乙醇和PBS。诱导培养7d倒置相差显微镜观察两组细胞形态,并行ALP染色观察;培养28d行vonKossa染色观察ECM矿化;培养7、14d采用实时定量PCR检测Wnt信号传导通路相关因子Axin2、β-catenin、骨钙素(osteocalcin,OC)、frizzled-2、Lef-1、Wnt5amRNA的表达。结果诱导培养7d倒置相差显微镜观察显示,实验组以多边形和三角形细胞居多;对照组细胞多呈长梭形,少数为小圆形或三角形。诱导培养7dALP染色观察显示,实验组细胞质中出现蓝染的ALP,阳性染色细胞和区域明显多于对照组;培养28dvonKossa染色观察显示,两组细胞均可见点状及片状钙沉积,与对照组相比,实验组钙沉积明显增多。实时定量PCR检测显示,诱导培养7d,实验组Axin2mRNA表达水平显著低于对照组,frizzled-2、Lef-lmRNA表达水平显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);其余各因子mRNA表达两组差异无统计学意义(P>0.05);培养14d,实验组除β-catenin外,其余各因子mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论SIM可促进BMSCs向成骨细胞分化,并伴Wnt信号途径相关因子mRNA表达水平的改变。

鸟苷酸结合蛋白2对人脐带来源间充质干细胞成骨分化的调控作用

目的探讨鸟苷酸结合蛋白2(guanylate binding protein 2,GBP2)对人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell,hUC-MSC)成骨分化的调控作用。方法培养hUC-MSC,采用吉姆萨染色、流式细胞术及体外诱导分化等方法对hUC-MSC生物学特性进行鉴定;构建过表达GBP2的慢病毒载体,转染hUCMSC,荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率,实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,q-PCR)法检测转染后hUC-MSC中GBP2的表达,获得稳定过表达GBP2的hUC-MSC(GBP2^(high)hUC-MSC);采用流式细胞术和体外诱导分化试验检测GBP2^(high)hUC-MSC的生物学特性,油红O染色评价体外成脂分化能力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色评估成骨分化能力,q-PCR法检测成脂和成骨分化相关转录因子的表达。结果培养的hUCMSC的细胞形态、细胞表型和诱导分化均符合MSC国际金标准。经GBP2慢病毒载体转染的hUC-MSC中GBP2的表达显著增加,获得稳定过表达GBP2的hUC-MSC(GBP2^(high)hUC-MSC)。GBP2^(high)hUC-MSC的细胞形态和细胞表型以及体外成脂分化能力均未发生变化,但成骨分化能力发生改变,GBP2^(high)hUC-MSC组ALP染色明显高于hUC-MSC组,成骨分化关键转录因子OPN和ALP的表达也显著高于hUC-MSC组(P均<0.05)。结论GBP2可促进hUCMSC的成骨分化,并上调成骨标志基因OPN和ALP的表达。