脯氨酰羟化酶2抑制剂cpd17对小鼠成骨前体细胞的影响

背景:脯氨酰羟化酶2抑制剂能够调节骨代谢,改善卵巢切除大鼠骨质疏松。cpd17是中国药科大学最新研发的一款小分子口服脯氨酰羟化酶2抑制剂,用于治疗肾性贫血疗效肯定,不良反应小,但是对骨形成和骨吸收的作用还不清楚。目的:探讨脯氨酰羟化酶2抑制剂cpd17对成骨前体细胞的影响。方法:采用cpd17处理C57BL/6小鼠成骨前体细胞,检测碱性磷酸酶活性和细胞外基质矿化程度,检测成骨、破骨相关标志物以及脯氨酰羟化酶2、低氧诱导因子1α的表达水平。使用低氧诱导因子1α通路抑制剂LW6抑制低氧诱导因子1α通路后,再次检测碱性磷酸酶活性和细胞外基质矿化程度,以及成骨和破骨分化相关标志物以及脯氨酰羟化酶2、低氧诱导因子1α的表达水平。结果与结论:cpd17能显著增强碱性磷酸酶活性和基质矿化程度,上调成骨分化相关标志物的表达,下调破骨分化相关标志物的表达,并上调低氧诱导因子1α表达,下调脯氨酰羟化酶2的表达。而LW6能明显减弱cpd17的作用。结果表明,脯氨酰羟化酶2抑制剂cpd17可通过激活低氧诱导因子1α信号通路促进成骨分化和抑制破骨分化。

成骨前体细胞来源的外泌体对乳腺癌细胞迁移和增殖影响的研究

背景乳腺癌骨转移是目前研究热点之一,骨微环境中成骨细胞可以促进肿瘤细胞存活并形成微转移,但目前鲜有成骨细胞来源的外泌体对乳腺癌作用的研究报道。目的探讨成骨前体细胞MC3T3-E1来源的外泌体对乳腺癌4T1和MDA-MB-231细胞迁移和增殖的影响。方法通过超高速离心法提取MC3T3-E1细胞来源的外泌体,透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析(nanopartic tracking analysis,NTA)和Western blot方法鉴定外泌体特性;利用划痕实验和Transwell实验检测分析MC3T3-E1来源的外泌体对乳腺癌4T1和MDA-MB-231细胞迁移的影响;CCK-8法和克隆形成实验检测MC3T3-E1来源的外泌体对乳腺癌4T1和MDA-MB-231细胞增殖的影响。结果MC3T3-E1细胞来源的外泌体具有膜结构囊状小泡,直径分布为100~200 nm,且表达外泌体标志蛋白Alix和TSG101。CCK-8活性实验结果显示,浓度为20μg/mL的MC3T3-E1细胞来源的外泌体不影响乳腺癌细胞的活性,30μg/mL、50μg/mL的外泌体能够降低乳腺癌细胞活性。划痕实验和Transwell实验结果显示,20μg/mL外泌体能够促进乳腺癌细胞的迁移(P<0.05)。CCK-8增殖实验和细胞克隆形成实验结果显示,20μg/mL外泌体能够促进乳腺癌细胞的增殖(P<0.05)。结论MC3T3-E1来源的外泌体可以促进乳腺癌细胞的迁移和增殖,这为乳腺癌骨转移的治疗提供可能的靶点和治疗策略。

纳米羟基磷灰石颗粒对成骨前体细胞的增殖和分化影响

对纳米羟基磷灰石颗粒对成骨前体细胞MC3T3E1的增殖和分化的影响进行了研究.采用四唑盐比色法(MTT)、碱性磷酸酶检测及矿化结节染色的方法分析了羟基磷灰石纳米颗粒悬液对成骨前体细胞的增殖和分化的影响.同时用纳米羟基磷灰石悬液的浸出液及吸附条件培养液后的纳米颗粒制备悬液分别处理细胞,探讨钙离子释放和蛋白吸附在成骨前体细胞增殖和分化过程中的作用.结果表明:在0～50μg.mL-1,纳米羟基磷灰石颗粒对成骨前体细胞的增殖有一定抑制作用,且随着浓度的增加抑制作用也相应加强.10μg.mL-1的纳米羟基磷灰石悬液对成骨前体细胞的分化具有促进作用.纳米羟基磷灰石颗粒悬液对成骨前体细胞分化的促进作用不受到钙离子释放或蛋白吸附作用的影响.

小分子肽对成骨前体细胞MC3T3-E1骨保护素和核转录因子κB受体活化因子配体表达的影响

背景:体内实验显示,小分子肽能明显增加去卵巢大鼠的骨钙含量,使其骨密度增加,能很好地预防骨质疏松。同时体外实验显示,小分子肽能促进小鼠成骨细胞和成骨前体细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化,并且可能是通过抑制核转录因子p50和p65的表达来起作用。而小分子肽对骨保护素/核转录因子κB受体活化因子配体的影响尚不明确。目的:观察小分子肽对MC3T3-E1在增殖、分化、矿化过程中骨保护素和RANKL表达的影响。方法:以体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液为空白对照组,50,100mg/L质量浓度小分子肽作用小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1,分别于作用3,6,12,18,24,30d后,收集细胞提取蛋白,Western Blot检测骨保护素和核转录因子κB受体活化因子配体蛋白的表达。结果与结论:50,100mg/L小分子肽作用MC3T3-E1后能明显促进作用骨保护素的表达(P<0.01),而对核转录因子κB受体活化因子配体无明显影响。小分子肽作用后MC3T3-E1中骨保护素/核转录因子κB受体活化因子配体的比值要明显高于空白对照组(P<0.01)。因此,认为小分子肽可以通过增加骨保护素的表达来影响骨保护素/核转录因子κB受体活化因子配体系统,间接地抑制破骨细胞的数量和功能。

阿托伐他汀钙对成骨前体细胞(3T3-E1)增殖与分化的影响及其与内质网应激的联系

目的观察不同浓度阿托伐他汀钙对成骨前体细胞(3T3-E1细胞)增殖与分化影响,分析该过程与内质网应激相关基因Bip、PERK、Eif2a表达的关系。方法 3T3-E1细胞培养至对数期,加入含不同浓度阿托伐他钙0、10^(-8)、10^(-7)、10^(-6)mol/L培养液继续培养细胞,24 h后利用CCK-8比色法检测细胞增殖能力,碱性磷酸酶测定试剂盒测定ALP活力,实时定量PCR技术检测内质网应激标志性基因Bip、PERK、Eif2a表达水平。结果镜下观察3T3-E1细胞呈梭形或多角形等形态,生长状态良好。(2)与对照组相比,不同浓度的阿托伐他汀钙作用于细胞24 h后,均可促进3T3-E1细胞增殖并增加ALP活性(P<0.05),其中以10^(-6)mol/L阿托伐他钙浓度增殖最明显。(3)实时定量PCR结果显示,阿托伐他汀钙组Bip、PERK、Eif2a表达均高于对照组(P<0.05)。结论阿托伐他汀钙可促进3T3-E1细胞增殖,促进细胞ALP活性增加,提高内质网应激标志性基因表达,提示阿托伐他汀促进增殖的作用可能与内质网应激通路相关,为骨质疏松的临床治疗及药物研发提供新的思路。

miR-467g下调Runx-2表达抑制成骨前体细胞的分化和矿化

背景:最新的研究发现miR-467g能抑制骨质再生,但其具体的作用和作用机制尚不明确。目的:探索miR-467g对小鼠成骨前体细胞成骨分化和矿化的影响及其机制。方法:体外分离、培养C57小鼠成骨前体细胞,通过Western-blot、实时定量PCR、碱性磷酸酶染色、茜素红染色等实验探索小鼠成骨前体细胞诱导分化过程中,成骨分化指标Runx-2、Osterix、Osteocalcin表达变化情况及碱性磷酸酶活性和矿化能力,以及miR-467g和它潜在靶基因Runx-2表达水平的变化;通过脂质体转染构建miR-467g高表达的小鼠成骨前体细胞,研究miR-467g对小鼠成骨前体细胞成骨分化的影响。利用荧光素酶实验检测miR-467g对Runx-2的靶向作用。结果与结论:(1)分离培养的小鼠成骨前体细胞具有良好的体外增殖与分化能力;(2)miR-467g表达水平随小鼠成骨前体细胞诱导分化时间的增加而降低;(3)miR-467g能够抑制小鼠成骨前体细胞成骨分化和矿化;(4)荧光素酶实验证实mi R-467g直接靶向Runx-2;(5)结果提示:miR-467g通过下调Runx-2抑制小鼠成骨前体细胞成骨分化和矿化。

淫羊藿苷对MC3T3-E1成骨前体细胞的成骨诱导作用及意义

目的观察淫羊藿苷对MC3T3-E1成骨前体细胞的细胞毒性及成骨诱导作用,为其用于骨组织再生提供依据。方法将MC3T3-E1成骨前体细胞随机分为观察组、阴性对照组及阳性对照组。观察组分别加入终浓度为1×10^(-6)、10^(-5)、1×10^(-4)、1×10^(-3)、1×10^(-2)mmol/L的淫羊藿苷溶液100μL,阴性对照组及阳性对照组分别加入等体积含DMSO的培养基及骨形态发生蛋白2(rh BMP-2)。采用MTT法检测各组培养第3、7天的细胞增殖率,死/活细胞荧光染色法检测细胞存活率,茜素红钙结节染色观察细胞钙化结节形成情况,细胞超声裂解法检测碱性磷酸酶(ALP)活性、钙含量及骨钙素表达。结果培养第3天,加入1×10^(-2)mmol/L淫羊藿苷溶液的观察组细胞增殖率明显低于阴性对照组及阳性对照组(P均<0.05)。培养第7天,加入1×10^(-3)、1×10^(-2)mmol/L淫羊藿苷溶液的观察组细胞增殖率明显低于阴性对照组及阳性对照组(P均<0.05)。加入1×10^(-3)mmol/L淫羊藿苷溶液的观察组细胞存活率明显低于阳性对照组,加入1×10^(-2)mmol/L淫羊藿苷溶液的观察组细胞存活率明显低于阴性对照组及阳性对照组(P均<0.05)。阴性对照组未见明显红染钙化结节,阳性对照组有明显的钙化结节,观察组随着加入淫羊藿苷浓度的升高红染钙化结节面积逐渐增大。加入不同浓度淫羊藿苷溶液的观察组细胞ALP活性、骨钙素表达均高于阴性对照组(P均<0.05)。加入1×10^(-4)、1×10^(-3)、1×10^(-2)mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞钙含量均高于阴性对照组,加入1×10^(-6)、1×10^(-5)mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞钙含量均低于阳性对照组(P均<0.05)。结论 1×10^(-4)mmol/L淫羊藿苷溶液对MC3T3-E1成骨前体细胞的细胞毒性较低,其成骨诱导作用与rh BMP-2接近,可作为一种骨诱导生长因子替代剂联合骨修复材料用于促进骨组织再生。

人脐带间充质干细胞来源的外泌体促进小鼠成骨前体细胞增殖与分化

目的提取人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)来源的外泌体(hucMSC-exo),观察其对小鼠成骨前体细胞(mouse osteoblast progenitor cells,mOPCs)的作用。方法体外分离培养hucMSCs,超速离心法收集外泌体;采用CCK8试剂盒检测不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs增殖的影响,碱性磷酸酶活性检测以及茜素红染色观察不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs矿化的影响。结果成功提取hucMSCs,呈现旋涡状贴壁式生长,形态呈长梭形,具有多向诱导分化潜能。HucMSCs来源的外泌体呈圆形、椭圆形,大小在80 nm左右最多,阳性表达CD9,CD63。CCK8法结果显示5、10μg/ml的hucMSC-exo可以显著地促进mOPCs在体外的增殖(P<0.05),碱性磷酸酶和茜素红染色结果发现5、10μg/ml的hucMSC-exo组可以明显提高mOPCs碱性磷酸酶活性及钙化结节的形成,且10μg/ml的外泌体浓度作用强于5μg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功提取了hucMSCs及hucMSC-exo,hucMSC-exo可以以浓度依赖的方式促进mOPCs的增殖与成骨分化。

Wnt5a对成骨前体细胞分泌和分化功能的影响

目的研究Wnt5a对成骨前体细胞分泌和分化功能的影响,并对其分子机制进行初步探讨。方法 Wnt5a刺激成骨前体细胞(MC3T3-E1)后,用双抗体夹心ELISA法检测细胞上清中骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)、IL-6、IL-1β及TNF-α的表达水平;用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒及实时定量PCR法检测ALP的表达量及活性;通过实时定量PCR方法检测Ror2基因表达水平,应用Western blot检测细胞JNK蛋白表达变化。结果 Wnt5a抑制了OPG的表达,增加了IL-6的分泌,但并没有改变IL-1β和TNF-α的表达量;Wnt5a上调了ALP的表达量及活性,促进了Ror2基因水平的表达,并上调了细胞内JNK蛋白水平。结论 Wnt5a通过调节成骨前体细胞OPG、IL-6、ALP和JNK的表达和分泌,可加重骨破坏和关节炎症,Wnt5a与类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)骨破坏和关节炎症进展有关。

成骨前体细胞对乳腺癌细胞表达骨拟态特性及增殖的影响

目的通过共培养体系探讨成骨前体细胞MC3T3-E1对MDA-MB-231乳腺癌细胞表达骨拟态特性及增殖的影响。方法实验组将MC3T3-E1及MDA-MB-231细胞采用transwell小室共培养,上室接种MC3T3-E1成骨细胞,下室接种相同数量的MDA-MB-231细胞。对照组上、下室均采用相同数量及密度的MDA-MB-231细胞。实时荧光定量PCR、Western blot法检测实验组及对照组骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的基因及蛋白的表达差异,采用CCK-8法检测各组增殖的差异,结晶紫染色法检测细胞集落形成差异。结果与对照组相比,实验组OCN、OPN、OPG的基因及蛋白表达均有明显的上调(P<0.05),MDA-MB-231细胞的增殖能力明显增高(P<0.01);实验组MDA-MB-231细胞集落形成数量及大小均优于对照组。结论短期共培养后MC3T3-E1成骨细胞可促进乳腺癌MDA-MB-231细胞表达骨拟态特性,并可促进其增殖及细胞集落形成。

高糖环境对小鼠成骨前体细胞及脂肪干细胞成骨分化的影响

目的研究不同葡萄糖浓度对小鼠成骨前体细胞(primary osteoblasts,POBs)和脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)成骨分化的影响。方法分离培养小鼠成骨前体细胞、棕色脂肪干细胞(brown adipose-derived stem cells,B-ASCs)、白色脂肪干细胞(white adipose-derived stem cells,W-ASCs),复苏MC3T3-E1细胞系,分别给予不同浓度葡萄糖(5.5 mmol/L、25 mmol/L和55 mmol/L)刺激,常规成骨诱导分化7d,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色观察不同细胞成骨分化程度。取成骨前体细胞分别成骨诱导分化3d、7d,采用定量PCR 检测各组细胞Runx2、碱性磷酸酶、Osterix 及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)等成骨分化标记物的表达水平。采用Western blot检测成骨相关蛋白的表达。结果在不同浓度葡萄糖刺激下,MC3T3-E1、POBs和W-ASCs的成骨分化能力随着糖浓度的升高而升高,而B-ASCs的成骨分化能力则受到抑制。对POBs成骨诱导培养3d和7d后,25mmol/L、55mmol/L组成骨分化程度显著高于5.5mmol/L组。Real-timePCR结果显示3d和7d时,25mmol/L、55mmol/L组Runx2、ALP、Osterix和OPN的表达也显著高于5.5mmol/L组。Westernblot检测结果证明高糖在成骨诱导过程中可激活骨钙素(osteocalcin,OCN)的表达。结论高糖对成骨前体细胞的成骨分化起促进作用。

假体无菌性松动过程中Co^2+对成骨前体细胞的生物学反应

背景:假体无菌性松动是人工关节置换后的主要并发症。目前金属离子已被证实参与人工假体无菌性松动的过程,如何控制和减缓假体松动成为当前研究的热点。目的:观察在假体松动过程中,不同浓度的二价钴离子(Co^2+)刺激成骨前体细胞的生物学反应。方法:(1)体外实验:小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1)分别与含不同浓度Co^2+的成骨细胞诱导液共同培养72 h,诱导为成骨细胞;应用MTT法检测细胞的增殖能力;通过测定乳酸脱氢酶活性来反映不同浓度Co^2+的细胞毒性;测定血清碱性磷酸酶蛋白浓度来检测成骨前体细胞向成骨细胞转化的能力;应用RT-PCR测定相关因子mRNA表达;(2)体内实验:将小鼠分为3组,稳定对照组将钛钉置入小鼠的胫骨近端、松动对照组置入钛钉和钴铬颗粒、钴离子组置入钛钉和钴铬颗粒并注入经过钴离子刺激的成骨前体细胞,术后立即使用MicroCT进行假体周围骨密度测定,5周后再次行假体周围骨密度测定,麻醉处死小鼠并离断患侧膝关节进行拔钉实验,并将拔钉后的组织进行苏木精-伊红染色。通过拔钉力量来测定假体松动程度;通过假体与骨界面之间膜的厚度来反映炎症反应的严重程度;通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察假体周围组织中破骨细胞数量。结果与结论:(1)体外实验结果:当Co^2+浓度升高时,成骨前体细胞的增殖会受到抑制;Co^2+对成骨前体细胞表达血清碱性磷酸酶具有显著的抑制作用;Co^2+可促进单核细胞趋化蛋白1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、核因子KB受体活化因子配基(RANKL)、活化T细胞核因子c1(NFATc1)mRNA表达,抑制骨保护素及成骨细胞特异性转录因子mRNA表达;低浓度Co^2+(62μmol/L)促进低密度脂蛋白受体相关蛋白(Lrp-5)和Runx2 mRNA表达,高浓度Co^2+(500μmol/L)抑制其表达;(2)体内实验结果:MicroCT扫描显示钴离子组小鼠骨密度值最低(P<0.05);钴离子组中,拔钉实验所需要的剪切力较对照组明显降低(P<0.05);苏木精-伊红染色染色显示,钴离子组假体周围炎性反应膜的形成,Co^2+刺激的成体前体细胞可能会加重假体周围炎症反应;(3)结果证实,成骨细胞在假体无菌性松动中可发挥重要作用,Co^2+刺激的成骨细胞前体细胞对破骨细胞分化成熟的具有重要调控作用。

葛根素对MC3T3-E1成骨前体细胞增殖能力的影响及其机制

目的探讨葛根素对MC3T3-E1成骨前体细胞增殖能力的影响及其可能的作用机制。方法取对数生长期的MC3T3-E1细胞,加入不同浓度葛根素作用不同时间,采用CCK-8法检测细胞增殖能力;结果显示,葛根素浓度为0.1μmol/L、作用时间为48 h时细胞增殖能力最强(以下实验采用葛根素浓度为0.1μmol/L、作用时间为48 h)。将MC3T3-E1细胞随机分为空白对照组、葛根素组和雌激素组,分别加入α-MEM完全培养基、0.1μmol/L葛根素和0.01μmol/L雌激素。作用48 h,电镜下观察细胞自噬情况,Western blotting法检测磷酸化的丝裂原活化蛋白激酶(p-AMPK)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ/LC3Ⅰ表达。观察干扰AMPK对葛根素作用后MC3T3-E1细胞自噬及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达的影响。结果空白对照组细胞器、细胞核和染色体形态正常;葛根素组和雌激素组细胞质内可见较多环状结构物质,该物质具有自噬体特异性的双层膜结构。葛根素组、雌激素组p-AMPK及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均明显高于空白对照组,雌激素组均明显高于葛根素组(P均<0.01)。干扰AMPK表达可减轻葛根素介导的MC3T3-E1细胞自噬程度,并降低细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达(P均<0.01)。结论葛根素可增强MC3T3-E1细胞增殖能力;激活AMPK/LC3信号通路介导的自噬水平是其可能的机制之一。

成骨分化促进小鼠胚胎成骨前体细胞中压电型机械敏感离子通道组件1的表达

目的研究小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1经成骨诱导后压电型机械敏感离子通道组件1(PIEZO1)的表达变化及意义。方法成骨诱导MC3T3-E1细胞后,于第0、14、21天分别进行茜素红染色观察钙结节和细胞形态,利用蛋白质印迹法(Western blot)、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分别检测成骨诱导对各时间点PIEZO1蛋白和PIEZO1 mRNA表达的影响,组间比较采用One-way ANOVA检验。结果MCET3-E1成骨诱导0 d时基本未见红色钙化结节,细胞呈梭形;诱导14 d时出现钙化结节,细胞呈聚集样和层叠样生长,且随着诱导时间延长钙化结节数量增多,形状逐渐增大,细胞层叠样生长加重;同时MC3T3-E1中PIEZO1蛋白及mRNA的表达量随着成骨诱导时间的延长而逐渐增高(PIEZO1蛋白0 d组0.26±0.04、14 d组0.42±0.16、21 d组0.81±0.04,F=24.05,P<0.001;PIEZO1 mRNA 0 d组1.00±0.03、14 d组1.45±0.11、21 d组4.51±0.44,F=161.90,P<0.001),差异有统计学意义。结论成骨分化可促进MC3T3-E1在矿化结节形成期PIEZO1蛋白的表达。

不同前列腺癌细胞对成骨前体细胞增殖和成熟能力的影响

目的 :探讨前列腺癌LNCaP和PC-3细胞条件培养液(conditioned medium,CM)对成骨前体细胞MC3T3-E1增殖和分化的影响。方法 :分别用含20%LNCaP CM、20%PC-3 CM和不含CM的α-MEM培养液(作为对照组)处理MC3T3-E1细胞。CCK-8法检测各组细胞的增殖情况,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测试剂盒检测各组细胞中ALP的活性,茜素红染色法检测各组细胞的钙化情况,实时荧光定量-PCR法检测各组细胞中Ⅰ型胶原蛋白α1(collagen typeⅠalpha 1,Col1α1)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)和RUNX2(runt-related transcription factor 2)的mRNA表达水平。结果 :与对照组和LNCaP CM组相比,PC-3CM组MC3T3-E1细胞的增殖能力明显增高(P<0.05);LNCaP CM组MC3T3-E1细胞中ALP的活性明显高于对照组(P<0.05),钙化面积大于对照组(P<0.05);PC-3 CM组MC3T3-E1细胞中ALP的活性较对照组明显降低(P<0.05),钙化面积明显小于对照组(P<0.05);LNCaP CM组MC3T3-E1细胞中Col1α1、OCN和RUNX2的mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.05),而PC-3 CM组MC3T3-E1细胞中Col1α1、OCN和RUNX2的mRNA表达水平均明显低于对照组(P<0.05)。结论 :PC-3 CM可明显促进成骨前体细胞增殖,但抑制其分化成熟;而LNCaP CM可显著促进成骨前体细胞分化成熟,说明该模型能够充分反映不同前列腺癌细胞对成骨前体细胞增殖和分化的差异,可以作为后续研究前列腺癌骨转移机制的体外模型。

糖基化对成骨前体细胞MC3T3-E1细胞增殖分化影响的实验研究

目的观察糖基化在成骨前体细胞（MC3T3-E1）的增殖和分化中的作用。方法免疫荧光检测MC3T3-E1细胞加入transglycosylation（TG）TG;Deoxynorleucine（DON）DON后O-连接的β-N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）O-GLcNAc表达,MTT法检测加入TG;DON后MC3T3-E1增殖,ELISA法测定加入TG、DON后MC3T3-E1细胞ALP活性。结果免疫荧光TG组细胞数量增多,O-GLcNAc表达增强,DON组细胞数量明显下降,O-GLcNAc表达降低。各浓度TG组对MC3T3-E1的MTT值均较正常对照组升高（P〈0.05）,随着TG浓度的增加,MC3T3-E1的吸光度逐渐增加。各浓度DON组对MC3T3-E1的增殖均较正常对照组降低（P〈0.05）。随着TG浓度的增加,TG组MC3T3-E1的ALP值均较正常对照组有所升高（P〈0.05）,加入0.25~0.5μl/ml的TG时,ALP值的增加有所减缓,加入0.5μl/ml的TG后MC3T3-E1的ALP分泌最高。随着DON浓度的增加,MC3T3-E1的ALP值均较正常对照组有所降低（P〈0.05）。结论糖基化在MC3T3-E1细胞成骨方向增殖和分化中起作用。

琥珀酸调控小鼠MC3T3-E1成骨前体细胞成骨分化的作用研究

目的探讨琥珀酸调控小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1成骨分化的作用及其可能的机制研究。方法配置0.01、0.10、0.50、1、2 mmol/L琥珀酸,分别处理MC3T3-E1细胞48h,采用四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法检测各组细胞增殖能力。实验分为琥珀酸组和对照组,经成骨分化诱导7 d,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测细胞成骨分化能力。经成骨分化诱导14 d,采用茜素红染色分析钙结节沉积数量。经成骨分化诱导7 d,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western blot分别检测两组MC3T3-E1细胞成骨分化相关基因Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的mRNA和蛋白的表达水平变化。结果低浓度(0.01 mmol/L和0.10 mmol/L)琥珀酸组MC3T3-E1吸光度值与对照组差异无统计学意义(P>0.05),高浓度(0.50 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L)的琥珀酸组吸光度值均低于对照组(P<0.05或0.01)。琥珀酸处理组(1 mmol/L)ALP活性低于对照组[(0.55±0.11)vs.(0.96±0.11),P<0.05];两组矿化钙结节统计结果显示:琥珀酸处理组钙结节数目低于对照组[(8.32±0.83)vs.(14.22±2.10),P<0.05]。琥珀酸处理组MC3T3-E1成骨分化基因Runx2、OCN的mRNA相对表达量均低于对照组(P<0.05或0.01),琥珀酸处理组小鼠MC3T3-E1成骨分化基因Runx2、OCN的蛋白相对表达量均低于对照组(P<0.05)。结论琥珀酸可抑制小鼠MC3T3-E1成骨前体细胞的增殖和成骨分化能力,其机制可能与抑制成骨分化相关Runx2和OCN基因表达相关。

牙源性间充质干细胞对成骨前体细胞成骨分化的影响

目的:探讨牙源性间充质干细胞对成骨前体细胞成骨分化的影响。方法:将小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1分为两组,观察组为牙源性间充质干细胞与MC3T3-E1细胞共培养,对照组为单一MC3T3-E1细胞培养。采用CCK-8法检测细胞增殖水平,采用酶联免疫法检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性并进行茜素红染色,采用qRT-PCR、Western blot检测ALP与骨桥素(osteopontin,OPN) m RNA与蛋白表达水平。结果:细胞共培养1 d与3 d后,观察组的细胞增殖指数、ALP活性显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,观察组的矿化结节显著增加,经茜素红染色呈红褐色。细胞共培养1 d与3 d后,观察组的ALP、OPN m RNA与蛋白相对表达水平显著高于对照组(P<0.05)。结论:牙源性间充质干细胞能促进成骨前体细胞的ALP、OPN表达,提高ALP活性,增加细胞增殖能力,诱发矿化,从而促进成骨分化。

胎牛血清外泌体对成骨细胞增殖的作用

背景:研究表明外泌体具有促进骨再生的能力,但从胎牛血清中提取的外泌体是否可以促进骨形成仍存在争议。目的:观察胎牛血清外泌体对成骨细胞增殖能力的影响,从而为临床治疗骨破坏提供新思路。方法:通过超速离心法从胎牛血清中提取外泌体,采用透射电子显微镜和Western blot法验证外泌体是否提取成功;然后用10 mg/L胎牛血清外泌体干预成骨前体细胞MC3T3-E1,通过CCK-8实验检测外泌体对成骨细胞增殖能力的影响,Western blot检测外泌体对成骨细胞骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白表达的影响。以不含外泌体的胎牛血清培养的MC3T3-E1细胞为对照组。结果与结论:①胎牛血清外泌体具有典型的脂质双层膜结构,大小在30-150 nm之间,外泌体表面标记因子CD81表达呈阳性,而微囊表面标记物CD40表达呈阴性;②外泌体组的增殖能力明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);外泌体组成骨标志性因子骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白的表达水平明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);③结果表明,胎牛血清外泌体对成骨细胞的增殖起促进作用,可为临床治疗骨破坏提供新思路。

上调骨形态发生蛋白2促进成骨细胞增殖分化的硅酸钙类材料Biodentine

背景:Biodentine是一种具有生物相容性的新型硅酸钙口腔修复材料,它不仅可以增加牙髓细胞中生长因子的分泌,也可以诱导牙本质的矿化,但是其在骨修复方面的研究较少。目的:通过构建干扰骨形态发生蛋白2的小鼠成骨前体细胞株,研究Biodentine对于干扰骨形态发生蛋白2小鼠成骨前体细胞株的增殖及分化能力的影响。方法:将0.1,1,10,100 g/L的Biodentine浸提液作用于小鼠成骨前体细胞24 h,通过CCK-8与碱性磷酸酶活性实验筛选最佳的作用质量浓度10 g/L,用于以下实验。将Biodentine浸提液作用于小鼠成骨前体细胞1,3,5,7 d,以未干预组为对照,通过CCK-8与碱性磷酸酶活性实验观察作用前后细胞的增殖及成骨分化。构建干扰骨形态发生蛋白2的小鼠成骨前体细胞株,通过CCK-8与碱性磷酸酶活性实验观察干扰前后细胞的增殖及成骨分化。构建干扰骨形态发生蛋白2的小鼠成骨前体细胞株,Biodentine组加入10 g/L的Biodentine浸提液,设置单纯干扰组为对照,作用24,48 h后,通过CCK-8与碱性磷酸酶活性实验观察细胞的增殖及成骨分化;作用24 h后,Real-time PCR、Western blot检测碱性磷酸酶mRNA与蛋白的表达。结果与结论:(1)10 g/L的Biodentine浸提液在1,3,5,7 d可促进小鼠成骨前体细胞的增殖与成骨分化;(2)干扰骨形态发生蛋白2可抑制小鼠成骨前体细胞的增殖与成骨分化;(3)Biodentine组作用24,48 h后的细胞增殖与成骨分化能力高于干扰组(P <0.05),作用24 h后的碱性磷酸酶mRNA与蛋白表达高于干扰组(P <0.05);(4)结果表明,10 g/L的Biodentine可以通过骨形态发生蛋白2增强成骨细胞的增殖及成骨分化。