成骨前体细胞来源的外泌体对乳腺癌细胞迁移和增殖影响的研究

背景乳腺癌骨转移是目前研究热点之一,骨微环境中成骨细胞可以促进肿瘤细胞存活并形成微转移,但目前鲜有成骨细胞来源的外泌体对乳腺癌作用的研究报道。目的探讨成骨前体细胞MC3T3-E1来源的外泌体对乳腺癌4T1和MDA-MB-231细胞迁移和增殖的影响。方法通过超高速离心法提取MC3T3-E1细胞来源的外泌体,透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析(nanopartic tracking analysis,NTA)和Western blot方法鉴定外泌体特性;利用划痕实验和Transwell实验检测分析MC3T3-E1来源的外泌体对乳腺癌4T1和MDA-MB-231细胞迁移的影响;CCK-8法和克隆形成实验检测MC3T3-E1来源的外泌体对乳腺癌4T1和MDA-MB-231细胞增殖的影响。结果MC3T3-E1细胞来源的外泌体具有膜结构囊状小泡,直径分布为100~200 nm,且表达外泌体标志蛋白Alix和TSG101。CCK-8活性实验结果显示,浓度为20μg/mL的MC3T3-E1细胞来源的外泌体不影响乳腺癌细胞的活性,30μg/mL、50μg/mL的外泌体能够降低乳腺癌细胞活性。划痕实验和Transwell实验结果显示,20μg/mL外泌体能够促进乳腺癌细胞的迁移(P<0.05)。CCK-8增殖实验和细胞克隆形成实验结果显示,20μg/mL外泌体能够促进乳腺癌细胞的增殖(P<0.05)。结论MC3T3-E1来源的外泌体可以促进乳腺癌细胞的迁移和增殖,这为乳腺癌骨转移的治疗提供可能的靶点和治疗策略。

纳米羟基磷灰石颗粒对成骨前体细胞的增殖和分化影响

对纳米羟基磷灰石颗粒对成骨前体细胞MC3T3E1的增殖和分化的影响进行了研究.采用四唑盐比色法(MTT)、碱性磷酸酶检测及矿化结节染色的方法分析了羟基磷灰石纳米颗粒悬液对成骨前体细胞的增殖和分化的影响.同时用纳米羟基磷灰石悬液的浸出液及吸附条件培养液后的纳米颗粒制备悬液分别处理细胞,探讨钙离子释放和蛋白吸附在成骨前体细胞增殖和分化过程中的作用.结果表明:在0～50μg.mL-1,纳米羟基磷灰石颗粒对成骨前体细胞的增殖有一定抑制作用,且随着浓度的增加抑制作用也相应加强.10μg.mL-1的纳米羟基磷灰石悬液对成骨前体细胞的分化具有促进作用.纳米羟基磷灰石颗粒悬液对成骨前体细胞分化的促进作用不受到钙离子释放或蛋白吸附作用的影响.

灯盏花对成骨细胞及破骨前体细胞OPG/RANKL/RANK表达的影响

目的研究不同浓度和不同作用时间的灯盏花对体外培养的成骨细胞和破骨前体细胞中OPG/RANKL/RANK mRNA及蛋白表达的影响,初步探讨灯盏花对骨改建的作用及其机制。方法体外培养人MG63细胞和小鼠RAW264.7细胞,分别取第三代细胞分为对照组和不同的实验组,分别应用不同浓度的灯盏花(0、0.001、0.01、0.1、1 mg/mL)干预48 h后提取总RNA和蛋白质,同时单独对0、1 mg组设12、24、48 h时间点提取蛋白质,采用半定量RT-PCR方法检测MG63细胞OPG mRNA和RANKL mRNA的表达以及RAW264.7细胞RANK mRNA的表达,采用Western blot法检测MG63细胞OPG蛋白和RANKL蛋白的表达以及RAW264.7细胞RANK蛋白的表达。结果灯盏花随浓度(0、0.001、0.01、0.1、1 mg/mL)增高,干预48 h后MG63细胞OPG mRNA和蛋白表达逐步降低(P<0.05);MG63细胞RANKL mRNA和蛋白表达逐步增加(P<0.05);RAW264.7细胞RANK mRNA表达增加(P<0.05),但0.1 mg/mL组较0.01 mg/mL组mRNA表达稍降低,RANK蛋白表达逐步增加(P<0.05)。1 mg/mL灯盏花干预12、24、48 h后MG63细胞OPG蛋白表达随时间逐步降低(P<0.05)、RANKL蛋白表达随时间逐步增加(P<0.05);RAW264.7细胞RANK蛋白表达随时间逐步增加(P<0.05)。结论灯盏花大致上呈剂量和时间依赖性抑制成骨细胞OPG表达,促进成骨细胞RANKL的表达和破骨前体细胞RANK的表达,灯盏花可能有促进骨吸收的作用。

小分子肽对成骨前体细胞MC3T3-E1骨保护素和核转录因子κB受体活化因子配体表达的影响

背景:体内实验显示,小分子肽能明显增加去卵巢大鼠的骨钙含量,使其骨密度增加,能很好地预防骨质疏松。同时体外实验显示,小分子肽能促进小鼠成骨细胞和成骨前体细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化,并且可能是通过抑制核转录因子p50和p65的表达来起作用。而小分子肽对骨保护素/核转录因子κB受体活化因子配体的影响尚不明确。目的:观察小分子肽对MC3T3-E1在增殖、分化、矿化过程中骨保护素和RANKL表达的影响。方法:以体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液为空白对照组,50,100mg/L质量浓度小分子肽作用小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1,分别于作用3,6,12,18,24,30d后,收集细胞提取蛋白,Western Blot检测骨保护素和核转录因子κB受体活化因子配体蛋白的表达。结果与结论:50,100mg/L小分子肽作用MC3T3-E1后能明显促进作用骨保护素的表达(P<0.01),而对核转录因子κB受体活化因子配体无明显影响。小分子肽作用后MC3T3-E1中骨保护素/核转录因子κB受体活化因子配体的比值要明显高于空白对照组(P<0.01)。因此,认为小分子肽可以通过增加骨保护素的表达来影响骨保护素/核转录因子κB受体活化因子配体系统,间接地抑制破骨细胞的数量和功能。

miR-467g下调Runx-2表达抑制成骨前体细胞的分化和矿化

背景:最新的研究发现miR-467g能抑制骨质再生,但其具体的作用和作用机制尚不明确。目的:探索miR-467g对小鼠成骨前体细胞成骨分化和矿化的影响及其机制。方法:体外分离、培养C57小鼠成骨前体细胞,通过Western-blot、实时定量PCR、碱性磷酸酶染色、茜素红染色等实验探索小鼠成骨前体细胞诱导分化过程中,成骨分化指标Runx-2、Osterix、Osteocalcin表达变化情况及碱性磷酸酶活性和矿化能力,以及miR-467g和它潜在靶基因Runx-2表达水平的变化;通过脂质体转染构建miR-467g高表达的小鼠成骨前体细胞,研究miR-467g对小鼠成骨前体细胞成骨分化的影响。利用荧光素酶实验检测miR-467g对Runx-2的靶向作用。结果与结论:(1)分离培养的小鼠成骨前体细胞具有良好的体外增殖与分化能力;(2)miR-467g表达水平随小鼠成骨前体细胞诱导分化时间的增加而降低;(3)miR-467g能够抑制小鼠成骨前体细胞成骨分化和矿化;(4)荧光素酶实验证实mi R-467g直接靶向Runx-2;(5)结果提示:miR-467g通过下调Runx-2抑制小鼠成骨前体细胞成骨分化和矿化。

阿托伐他汀钙对成骨前体细胞(3T3-E1)增殖与分化的影响及其与内质网应激的联系

目的观察不同浓度阿托伐他汀钙对成骨前体细胞(3T3-E1细胞)增殖与分化影响,分析该过程与内质网应激相关基因Bip、PERK、Eif2a表达的关系。方法 3T3-E1细胞培养至对数期,加入含不同浓度阿托伐他钙0、10^(-8)、10^(-7)、10^(-6)mol/L培养液继续培养细胞,24 h后利用CCK-8比色法检测细胞增殖能力,碱性磷酸酶测定试剂盒测定ALP活力,实时定量PCR技术检测内质网应激标志性基因Bip、PERK、Eif2a表达水平。结果镜下观察3T3-E1细胞呈梭形或多角形等形态,生长状态良好。(2)与对照组相比,不同浓度的阿托伐他汀钙作用于细胞24 h后,均可促进3T3-E1细胞增殖并增加ALP活性(P<0.05),其中以10^(-6)mol/L阿托伐他钙浓度增殖最明显。(3)实时定量PCR结果显示,阿托伐他汀钙组Bip、PERK、Eif2a表达均高于对照组(P<0.05)。结论阿托伐他汀钙可促进3T3-E1细胞增殖,促进细胞ALP活性增加,提高内质网应激标志性基因表达,提示阿托伐他汀促进增殖的作用可能与内质网应激通路相关,为骨质疏松的临床治疗及药物研发提供新的思路。

淫羊藿苷对MC3T3-E1成骨前体细胞的成骨诱导作用及意义

目的观察淫羊藿苷对MC3T3-E1成骨前体细胞的细胞毒性及成骨诱导作用,为其用于骨组织再生提供依据。方法将MC3T3-E1成骨前体细胞随机分为观察组、阴性对照组及阳性对照组。观察组分别加入终浓度为1×10^(-6)、10^(-5)、1×10^(-4)、1×10^(-3)、1×10^(-2)mmol/L的淫羊藿苷溶液100μL,阴性对照组及阳性对照组分别加入等体积含DMSO的培养基及骨形态发生蛋白2(rh BMP-2)。采用MTT法检测各组培养第3、7天的细胞增殖率,死/活细胞荧光染色法检测细胞存活率,茜素红钙结节染色观察细胞钙化结节形成情况,细胞超声裂解法检测碱性磷酸酶(ALP)活性、钙含量及骨钙素表达。结果培养第3天,加入1×10^(-2)mmol/L淫羊藿苷溶液的观察组细胞增殖率明显低于阴性对照组及阳性对照组(P均<0.05)。培养第7天,加入1×10^(-3)、1×10^(-2)mmol/L淫羊藿苷溶液的观察组细胞增殖率明显低于阴性对照组及阳性对照组(P均<0.05)。加入1×10^(-3)mmol/L淫羊藿苷溶液的观察组细胞存活率明显低于阳性对照组,加入1×10^(-2)mmol/L淫羊藿苷溶液的观察组细胞存活率明显低于阴性对照组及阳性对照组(P均<0.05)。阴性对照组未见明显红染钙化结节,阳性对照组有明显的钙化结节,观察组随着加入淫羊藿苷浓度的升高红染钙化结节面积逐渐增大。加入不同浓度淫羊藿苷溶液的观察组细胞ALP活性、骨钙素表达均高于阴性对照组(P均<0.05)。加入1×10^(-4)、1×10^(-3)、1×10^(-2)mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞钙含量均高于阴性对照组,加入1×10^(-6)、1×10^(-5)mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞钙含量均低于阳性对照组(P均<0.05)。结论 1×10^(-4)mmol/L淫羊藿苷溶液对MC3T3-E1成骨前体细胞的细胞毒性较低,其成骨诱导作用与rh BMP-2接近,可作为一种骨诱导生长因子替代剂联合骨修复材料用于促进骨组织再生。

人脐带间充质干细胞来源的外泌体促进小鼠成骨前体细胞增殖与分化

目的提取人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)来源的外泌体(hucMSC-exo),观察其对小鼠成骨前体细胞(mouse osteoblast progenitor cells,mOPCs)的作用。方法体外分离培养hucMSCs,超速离心法收集外泌体;采用CCK8试剂盒检测不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs增殖的影响,碱性磷酸酶活性检测以及茜素红染色观察不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs矿化的影响。结果成功提取hucMSCs,呈现旋涡状贴壁式生长,形态呈长梭形,具有多向诱导分化潜能。HucMSCs来源的外泌体呈圆形、椭圆形,大小在80 nm左右最多,阳性表达CD9,CD63。CCK8法结果显示5、10μg/ml的hucMSC-exo可以显著地促进mOPCs在体外的增殖(P<0.05),碱性磷酸酶和茜素红染色结果发现5、10μg/ml的hucMSC-exo组可以明显提高mOPCs碱性磷酸酶活性及钙化结节的形成,且10μg/ml的外泌体浓度作用强于5μg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功提取了hucMSCs及hucMSC-exo,hucMSC-exo可以以浓度依赖的方式促进mOPCs的增殖与成骨分化。

Wnt5a对成骨前体细胞分泌和分化功能的影响

目的研究Wnt5a对成骨前体细胞分泌和分化功能的影响,并对其分子机制进行初步探讨。方法 Wnt5a刺激成骨前体细胞(MC3T3-E1)后,用双抗体夹心ELISA法检测细胞上清中骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)、IL-6、IL-1β及TNF-α的表达水平;用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒及实时定量PCR法检测ALP的表达量及活性;通过实时定量PCR方法检测Ror2基因表达水平,应用Western blot检测细胞JNK蛋白表达变化。结果 Wnt5a抑制了OPG的表达,增加了IL-6的分泌,但并没有改变IL-1β和TNF-α的表达量;Wnt5a上调了ALP的表达量及活性,促进了Ror2基因水平的表达,并上调了细胞内JNK蛋白水平。结论 Wnt5a通过调节成骨前体细胞OPG、IL-6、ALP和JNK的表达和分泌,可加重骨破坏和关节炎症,Wnt5a与类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)骨破坏和关节炎症进展有关。

金枪鱼鱼骨活性钙对鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)活力和凋亡作用

目的:以金枪鱼骨为原料,制备柠檬酸-苹果酸钙剂(CMC),研究其对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的细胞活力、凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:在小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)培养液中,分别加入高浓度(1μg/m L)CMC和低浓度(0.1μg/m L)CMC,利用MTT法检测对MC3T3-E1细胞活力的影响,流式细胞仪检测血清饥饿诱导的细胞凋亡。结果:高浓度和低浓度的钙对MC3T3-E1细胞活力均有显著的促进作用,24 h的高钙组的细胞增长率(9.67%)优于低钙组(8.95%);36 h和48 h后低钙组的增长率分别为14.96%和20.33%,明显优于36 h和48 h作用后的高钙组(6.23%和1.73%),两组细胞凋亡率与空白组比较差异较小,且均显著低于对照组(p<0.01)。结论:CMC高钙组和CMC低钙组在一定浓度范围内,能促进MC3T3-E1细胞活力显著增强,并且改善血清饥饿诱导的成骨前体细胞凋亡。

成骨前体细胞对乳腺癌细胞表达骨拟态特性及增殖的影响

目的通过共培养体系探讨成骨前体细胞MC3T3-E1对MDA-MB-231乳腺癌细胞表达骨拟态特性及增殖的影响。方法实验组将MC3T3-E1及MDA-MB-231细胞采用transwell小室共培养,上室接种MC3T3-E1成骨细胞,下室接种相同数量的MDA-MB-231细胞。对照组上、下室均采用相同数量及密度的MDA-MB-231细胞。实时荧光定量PCR、Western blot法检测实验组及对照组骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的基因及蛋白的表达差异,采用CCK-8法检测各组增殖的差异,结晶紫染色法检测细胞集落形成差异。结果与对照组相比,实验组OCN、OPN、OPG的基因及蛋白表达均有明显的上调(P<0.05),MDA-MB-231细胞的增殖能力明显增高(P<0.01);实验组MDA-MB-231细胞集落形成数量及大小均优于对照组。结论短期共培养后MC3T3-E1成骨细胞可促进乳腺癌MDA-MB-231细胞表达骨拟态特性,并可促进其增殖及细胞集落形成。

高糖环境对小鼠成骨前体细胞及脂肪干细胞成骨分化的影响

目的研究不同葡萄糖浓度对小鼠成骨前体细胞(primary osteoblasts,POBs)和脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)成骨分化的影响。方法分离培养小鼠成骨前体细胞、棕色脂肪干细胞(brown adipose-derived stem cells,B-ASCs)、白色脂肪干细胞(white adipose-derived stem cells,W-ASCs),复苏MC3T3-E1细胞系,分别给予不同浓度葡萄糖(5.5 mmol/L、25 mmol/L和55 mmol/L)刺激,常规成骨诱导分化7d,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色观察不同细胞成骨分化程度。取成骨前体细胞分别成骨诱导分化3d、7d,采用定量PCR 检测各组细胞Runx2、碱性磷酸酶、Osterix 及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)等成骨分化标记物的表达水平。采用Western blot检测成骨相关蛋白的表达。结果在不同浓度葡萄糖刺激下,MC3T3-E1、POBs和W-ASCs的成骨分化能力随着糖浓度的升高而升高,而B-ASCs的成骨分化能力则受到抑制。对POBs成骨诱导培养3d和7d后,25mmol/L、55mmol/L组成骨分化程度显著高于5.5mmol/L组。Real-timePCR结果显示3d和7d时,25mmol/L、55mmol/L组Runx2、ALP、Osterix和OPN的表达也显著高于5.5mmol/L组。Westernblot检测结果证明高糖在成骨诱导过程中可激活骨钙素(osteocalcin,OCN)的表达。结论高糖对成骨前体细胞的成骨分化起促进作用。

骨软骨前体细胞分离鉴定及转化生长因子β3对其成软骨分化的影响

背景:关节软骨中存在着前软骨干细胞,可能成为软骨组织工程潜在的种子细胞,转化生长因子β3对前软骨干细胞的增殖及成软骨分化具有正向调节作用。目的:分析转化生长因子β3对骨软骨前体细胞成软骨的分化作用。方法:分离筛选出晚期骨关节炎患者软骨组织CD146^+软骨细胞并鉴定。培养CD146^+软骨细胞团块分为4组:为普通培养基组,转化生长因子β3-诱导组,转化生长因子β3+诱导组(含2.5μg/L重组人转化生长因子β3)和转化生长因子β3++诱导组(含10μg/L重组人转化生长因子β3)。培养4周后行组织块Ⅱ型胶原、Aggrecan免疫组织化学及相关基因实时荧光定量PCR检测。结果与结论:(1)成软骨诱导培养时,转化生长因子β3++诱导组所形成软骨块>转化生长因子β3+诱导组>转化生长因子β3-诱导组;(2)免疫组织化学结果显示,转化生长因子β3++诱导组Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达明显高于转化生长因子β3+诱导组(P<0.05),转化生长因子β3+诱导组表达明显高于转化生长因子β3-诱导组(P<0.05);(3)实时荧光定量PCR检测显示,转化生长因子β3++诱导组Ⅱ型胶原和Aggrecan m RNA的表达明显强于转化生长因子β3+诱导组(P<0.05),转化生长因子β3+诱导组2指标表达明显强于转化生长因子β3-诱导组(P<0.05);转化生长因子β3++诱导组和转化生长因子β3+诱导组性别决定区Y框蛋白-9的表达均明显强于转化生长因子β3-诱导组(P<0.05);(4)结果表明,晚期骨关节炎患者残余关节软骨中存在着具有干细胞特性的骨软骨前体细胞;转化生长因子β3具有较强促骨软骨前体细胞成软骨分化的能力,其有可能成为软骨组织工程中理想的细胞因子。

假体无菌性松动过程中Co^2+对成骨前体细胞的生物学反应

背景:假体无菌性松动是人工关节置换后的主要并发症。目前金属离子已被证实参与人工假体无菌性松动的过程,如何控制和减缓假体松动成为当前研究的热点。目的:观察在假体松动过程中,不同浓度的二价钴离子(Co^2+)刺激成骨前体细胞的生物学反应。方法:(1)体外实验:小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1)分别与含不同浓度Co^2+的成骨细胞诱导液共同培养72 h,诱导为成骨细胞;应用MTT法检测细胞的增殖能力;通过测定乳酸脱氢酶活性来反映不同浓度Co^2+的细胞毒性;测定血清碱性磷酸酶蛋白浓度来检测成骨前体细胞向成骨细胞转化的能力;应用RT-PCR测定相关因子mRNA表达;(2)体内实验:将小鼠分为3组,稳定对照组将钛钉置入小鼠的胫骨近端、松动对照组置入钛钉和钴铬颗粒、钴离子组置入钛钉和钴铬颗粒并注入经过钴离子刺激的成骨前体细胞,术后立即使用MicroCT进行假体周围骨密度测定,5周后再次行假体周围骨密度测定,麻醉处死小鼠并离断患侧膝关节进行拔钉实验,并将拔钉后的组织进行苏木精-伊红染色。通过拔钉力量来测定假体松动程度;通过假体与骨界面之间膜的厚度来反映炎症反应的严重程度;通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察假体周围组织中破骨细胞数量。结果与结论:(1)体外实验结果:当Co^2+浓度升高时,成骨前体细胞的增殖会受到抑制;Co^2+对成骨前体细胞表达血清碱性磷酸酶具有显著的抑制作用;Co^2+可促进单核细胞趋化蛋白1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、核因子KB受体活化因子配基(RANKL)、活化T细胞核因子c1(NFATc1)mRNA表达,抑制骨保护素及成骨细胞特异性转录因子mRNA表达;低浓度Co^2+(62μmol/L)促进低密度脂蛋白受体相关蛋白(Lrp-5)和Runx2 mRNA表达,高浓度Co^2+(500μmol/L)抑制其表达;(2)体内实验结果:MicroCT扫描显示钴离子组小鼠骨密度值最低(P<0.05);钴离子组中,拔钉实验所需要的剪切力较对照组明显降低(P<0.05);苏木精-伊红染色染色显示,钴离子组假体周围炎性反应膜的形成,Co^2+刺激的成体前体细胞可能会加重假体周围炎症反应;(3)结果证实,成骨细胞在假体无菌性松动中可发挥重要作用,Co^2+刺激的成骨细胞前体细胞对破骨细胞分化成熟的具有重要调控作用。

二甲基乙二酰基甘氨酸对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞增殖和分化的影响

目的 :探讨低氧模拟剂二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的增殖、成骨分化及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法:将MC3T3-E1细胞接种到培养板24h后,实验组培养基中分别加入50μM(50μM组)和200μM(200μM组)的DMOG,对照组加入完全培养液。分别于培养1、3、5d时采用MTT法检测MC3T3-E1细胞增殖情况,5、10d行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及ALP活性检测成骨细胞分化,21d用茜素红染色检测MC3T3-E1细胞钙结节的形成并进行定量分析,采用ELISA法检测MC3T3-E1培养3d情况时上清液中的VEGF蛋白含量,并用实时荧光定量PCR法检测MC3T3-E1细胞VEGF mRNA的相对表达量。结果:培养1d时对照组、50μM组和200μM组的MC3T3-E1的光密度(optical density,OD)值分别为0.041±0.009、0.074±0.019、0.086±0.044,3d时分别为0.123±0.027、0.148±0.020、0.224±0.061,5d时分别为0.297±0.044、0.325±0.084、0.354±0.038,1d、3d时50μM组和200μM组与同时间点对照组比较均有显著性差异(P<0.05),3d时50μM组与200μM组有显著性差异(P<0.05)。培养5d和10d时对照组ALP染色颜色较深,50μM组颜色中等,200μM组颜色较浅;5d时对照组ALP活性为1.943±0.072,50μM组为1.632±0.051,200μM组为1.319±0.065;10d时对照组ALP活性为3.734±0.067,50μM组为3.381±0.070,200μM组为2.831±0.086。三组间同时间点比较均有统计学差异(P<0.05),同组10d时与5d时比较均有统计学差异(P<0.05)。茜素红染色200μM组可见少量红色结节,50μM组可见中等量红色结节,对照组可见大量红色结节;对照组茜素红含量(μg/ml)为56.178±7.940,50μM组为41.922±2.438,200μM组为31.929±1.922,三组间比较均有统计学差异(P<0.05)。培养3d时对照组细胞培养上清液中VEGF蛋白含量(ng/孔)为9.063±0.603,50μM组为12.123±0.870,200μM组为15.540±0.581,三组间比较均有统计学差异(P<0.05);50μM组VEGF mRNA表达量为对照组的1.792±0.067,200μM组为对照组的3.963±0.092,三组间比较均有统计学差异(P<0.05)。结论 :低氧模拟剂DMOG可促进MC3T3-E1细胞增殖和VEGF表达,抑制其成骨分化。

葛根素对MC3T3-E1成骨前体细胞增殖能力的影响及其机制

目的探讨葛根素对MC3T3-E1成骨前体细胞增殖能力的影响及其可能的作用机制。方法取对数生长期的MC3T3-E1细胞,加入不同浓度葛根素作用不同时间,采用CCK-8法检测细胞增殖能力;结果显示,葛根素浓度为0.1μmol/L、作用时间为48 h时细胞增殖能力最强(以下实验采用葛根素浓度为0.1μmol/L、作用时间为48 h)。将MC3T3-E1细胞随机分为空白对照组、葛根素组和雌激素组,分别加入α-MEM完全培养基、0.1μmol/L葛根素和0.01μmol/L雌激素。作用48 h,电镜下观察细胞自噬情况,Western blotting法检测磷酸化的丝裂原活化蛋白激酶(p-AMPK)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ/LC3Ⅰ表达。观察干扰AMPK对葛根素作用后MC3T3-E1细胞自噬及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达的影响。结果空白对照组细胞器、细胞核和染色体形态正常;葛根素组和雌激素组细胞质内可见较多环状结构物质,该物质具有自噬体特异性的双层膜结构。葛根素组、雌激素组p-AMPK及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均明显高于空白对照组,雌激素组均明显高于葛根素组(P均<0.01)。干扰AMPK表达可减轻葛根素介导的MC3T3-E1细胞自噬程度,并降低细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达(P均<0.01)。结论葛根素可增强MC3T3-E1细胞增殖能力;激活AMPK/LC3信号通路介导的自噬水平是其可能的机制之一。

自体成骨细胞的诱导培养及其生物学特性

目的 诱导培养来自自体骨髓间充质干细胞的成骨细胞或成骨细胞的前体细胞 ,进行自体成骨细胞异体骨复合移植实验研究。方法 抽取动物骨髓、抗凝稀释 ,以适当条件培养诱导 ,分化为成骨细胞并分析细胞生物学特性。成骨细胞生长在同种异体骨制成的载体上 ,形成复合物 ,植入人工缺损处 ,观察骨修复情况。结果 可以诱导培养出大量的成骨细胞或成骨细胞的前体细胞。自体成骨细胞异体松质骨复合物修复骨缺损的效果明显优于对照组。结论 本实验为自体成骨细胞异体骨复合移植的临床应用提供一个简单有效的方法。

一氧化氮对成骨细胞样细胞系MC3T3-E1的矿化调控

目的:探讨一氧化氮NO(Nitric Oxide,NO)对成骨细胞前体细胞系MC3T3-E1的增殖和矿化调控作用。方法:给于成骨细胞样细胞浓度为1×10-3mmol/L的NO外源性供体S亚硝基N乙酰基青霉胺(S-nitroso-N-acetyl-dl-penicillamine,SNAP)3w,通过成骨细胞DNA含量及碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性变化,以检测NO对细胞生长影响,通过Von Kossa染色和骨钙素免疫组化方法,以观察成骨细胞合成钙盐情况;通过Western Blot方法检测细胞骨唾液酸蛋白(Bone Sialoprotein,BSP)表达变化。结果:和对照组相比,SNAP可明显增加成骨细胞DNA含量和碱性磷酸酶活性;SNAP可刺激成骨细胞于培养2w时生成明显钙化结节,骨钙素蛋白表达,并显著上调骨唾液酸蛋白表达。结论:一定浓度一氧化氮,可加速成骨细胞前体细胞MC3T3-E1增殖,并可能通过调控骨唾液酸蛋白表达刺激成骨细胞进一步分化和矿化。

miR-363在脆性骨折患者血中的表达及对MC3T3-E1细胞成骨分化及增殖的影响

目的研究miR-363在脆性骨折患者血中的表达及对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)成骨分化与增殖的影响。方法收集脆性骨折患者外周血,采用荧光定量PCR检测患者miR-363、矮小相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、连环蛋白β1(CTNNB1)和骨髓细胞瘤癌基因(MYC)表达。采用茜素红S染色与噻唑蓝检测过表达miR-363对细胞成骨分化及增殖的影响。采用双荧光素酶报告基因与Western blotting检测miR-363对Dickkopf相关蛋白1(DKK1)的调控作用。结果miR-363在脆性骨折患者外周血中的表达水平低于正常健康者,而术后1周、2周及4周外周血中的表达水平高于术前并呈上调趋势(P<0.05);模拟物组MC3T3-E1细胞中miR-363表达水平高于阴性对照组(P<0.05);模拟物组MC3T3-E1细胞矿化程度、RUNX2及OCN mRNA表达水平及1天、2天、3天光密度(OD)值高于阴性对照组(P<0.05);DKK1是miR-363的靶基因,模拟物组MC3T3-E1细胞中DKK1蛋白表达水平低于阴性对照组,而CCND1、CTNNB1及MYC mRNA表达水平高于阴性对照组(P<0.05)。结论miR-363可能通过调控靶基因DKK1与Wnt/β-catenin信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化与增殖。

胎牛血清外泌体对成骨细胞增殖的作用

背景:研究表明外泌体具有促进骨再生的能力,但从胎牛血清中提取的外泌体是否可以促进骨形成仍存在争议。目的:观察胎牛血清外泌体对成骨细胞增殖能力的影响,从而为临床治疗骨破坏提供新思路。方法:通过超速离心法从胎牛血清中提取外泌体,采用透射电子显微镜和Western blot法验证外泌体是否提取成功;然后用10 mg/L胎牛血清外泌体干预成骨前体细胞MC3T3-E1,通过CCK-8实验检测外泌体对成骨细胞增殖能力的影响,Western blot检测外泌体对成骨细胞骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白表达的影响。以不含外泌体的胎牛血清培养的MC3T3-E1细胞为对照组。结果与结论:①胎牛血清外泌体具有典型的脂质双层膜结构,大小在30-150 nm之间,外泌体表面标记因子CD81表达呈阳性,而微囊表面标记物CD40表达呈阴性;②外泌体组的增殖能力明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);外泌体组成骨标志性因子骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白的表达水平明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);③结果表明,胎牛血清外泌体对成骨细胞的增殖起促进作用,可为临床治疗骨破坏提供新思路。