非编码RNA调控血管平滑肌细胞成骨样表型转化的研究进展

分化成熟的血管平滑肌主要功能是收缩血管、调节血管周径及血压等.在高磷、高糖、维生素D3、炎症等因素的作用下,平滑肌细胞可转分化为成骨样细胞参与血管钙化的形成,诱发心脑血管不良事件.非编码RNA是经基因转录但不翻译为蛋白质的一类RNA总称,其通过调控多种细胞活动来参与机体的生理和病理过程.已有研究表明,非编码RNA可通过调控血管平滑肌细胞成骨样表型转化影响血管钙化的发生、发展.本文从微小RNA、长链非编码RNA、环状RNA几方面综述非编码RNA在血管平滑肌成骨样表型转化中的调节作用,有助于进一步了解血管钙化的分子机制以及发现防治血管钙化的新靶点.

血管外膜细胞钙化及其钙化机制研究

目的:研究经体外诱导钙化建立大鼠血管外膜细胞钙化模型,检测钙化过程中成骨相关指标及凋亡、自噬相关蛋白的表达变化,旨在为心血管疾病模型提供更精确的细胞模型,并初步探讨其钙化机制。方法:原代提取大鼠胸主动脉外膜纤维细胞,取3~6代细胞使用诱导培养基(高糖DMEM+10%胎牛血清+10 mmol/Lβ-甘油磷酸+0.05 mmol/L抗坏血酸+100 mmol/L地塞米松)诱导钙化,诱导时间为3 d、6 d、9 d、12 d、15 d,筛选出诱导细胞钙化的最佳时间。对细胞采用茜素红S染色、细胞内钙含量测定和碱性磷酸酶(ALP)活性检测,鉴定是否成功构建钙化模型。采用实时定量聚合酶链式反应(PT-PCR)检测成骨相关因子骨形态生成蛋白2(BMP2)和核心结合因子α1(Runx2)的mRNA含量,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2和自噬相关蛋白微血管相关蛋白(LC3)、Beclin-1的表达水平,找出血管外膜细胞钙化的潜在机制。结果:当诱导钙化时间为15 d时,血管外膜细胞中主要钙化指标胞内钙含量及ALP活性上调(P<0.05),茜素红S染色显示钙化组有明显钙盐沉积。血管外膜细胞经钙化诱导后,BMP2和Runx2的mRNA水平上调,Bax蛋白水平上调,Bcl-2和Beclin-1蛋白水平下调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调(P<0.05)。结论:钙化诱导培养基培养血管外膜细胞15 d可成功构建钙化细胞模型,血管外膜细胞钙化可能与细胞向成骨样表型转化有关,血管外膜细胞钙化过程涉及细胞自噬及凋亡调控。

miRNA-205在慢性肾脏病患者血管钙化中的作用及诊断价值

目的探讨miRNA-205在慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者血管钙化中的作用及诊断价值。方法该研究分为体外细胞实验和回顾性队列研究。采用大鼠胸主动脉平滑肌细胞进行体外实验,茜素红染色法、钙含量检测血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的钙化情况,碱性磷酸酶检测试剂盒测定碱性磷酸酶活性,Western印迹检测VSMCs成骨转录因子Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及平滑肌22α蛋白(smooth muscle 22α,SM-22α)的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测VSMCs中miRNA-205和Runx2的表达含量。双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-205与Runx2的靶向关系。回顾性选择2020年6月至2021年1月河北医科大学第四医院肾内科的CKD 3~5期非透析患者,并按照冠状动脉钙化积分(coronary artery calcium score,CACs)将患者分为无钙化组(CACs=0)、轻中度钙化组(0400)。采用Spearman相关分析法评价血清miRNA-205、Runx2与CKD患者血管钙化的相关性,Logistic回归模型及受试者工作特征曲线分析miRNA-205预测CKD患者血管钙化的价值。结果(1)与对照组相比,高磷组VSMCs钙结节较多,钙含量、碱性磷酸酶活性、Runx2蛋白表达均显著较高,α-SMA、SM-22α蛋白及miRNA-205表达水平均较低(均P<0.05)。过表达miRNA-205时,VSMCs钙化减轻,α-SMA和SM22α蛋白表达水平均升高,Runx2蛋白表达水平降低(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miRNA-205-5p过表达后野生型Runx23’端非编码区质粒荧光素酶活性降低。(2)纳入CKD患者80例,年龄(57.50±14.93)岁,其中男性49例(61.3%)。无钙化组(n=26)、轻中度钙化组(n=30)和重度钙化组(n=24)患者miRNA-205和Runx2表达水平比较结果显示,钙化程度越高,miRNA-205表达水平越低,Runx2 mRNA表达水平越高(均P<0.05)。血清miRNA-205与CACs呈负相关(r=-0.50,P<0.01),Runx2与CACs呈正相关(r=0.55,P<0.01)。多因素Logistic回归分析结果显示,miRNA-205(OR=0.451,95%CI 0.122~0.873)是CKD患者发生血管钙化的独立影响因素。miRNA-205和miRNA-205联合Runx2预测血管钙化的受试者工作特征曲线下面积分别为0.796(95%CI 0.697~0.859)和0.924(95%CI 0.866~0.982)。结论miRNA-205通过靶向Runx2负向调控VSMCs成骨样表型转化进而抑制血管钙化,有望成为早期诊断CKD患者血管钙化的生物标志物。