重建端粒酶活性的正常人成纤维细胞的成骨潜能研究

目的 通过重建端粒酶活性延长人成纤维细胞寿命 ,并对其成骨潜能进行研究 ,为解决组织工程骨修复种子细胞老化问题提供实验依据。方法 将人端粒酶催化亚基 (h TERT)基因用电穿孔法导入正常人原代成纤维细胞 ,用 TRAP- PCR检测细胞端粒酶活性 ,用β-半乳糖苷酶活性测定评价细胞衰老情况。在此基础上用骨形成蛋白(BMP- 2 )和肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)联合诱导已重建端粒酶活性的成纤维细胞在体外培养条件下成骨 ,用四环素活体标记和茜素红染色显示钙盐结节形成。结果 转染 h TERT的人成纤维细胞能稳定表达端粒酶活性 ,培养超过 5 0代后细胞仍保持β-半乳糖苷酶阴性。经 BMP- 2和 TNF-α诱导后 ,转染后传 80代的人成纤维细胞仍可形成四环素标记和茜素红染色均为阳性的钙盐结节。结论 重建端粒酶活性。

放射损伤对小鼠骨髓间充质干细胞成骨潜能及造血干细胞龛位的影响

目的观察放射对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMMSCs)体外成骨潜能及体内骨髓造血干细胞(hematologic stemcells,HSCs)龛位的影响。方法分离、培养正常及接受4 Gy放射后不同时间点小鼠BMMSCs,用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色法和实时定量RT-PCR检测成骨分化相关基因,鉴定BMMSCs体外成骨分化潜能的改变,并通过骨组织形态学和免疫组织化学的方法检测放射后小鼠体内成骨细胞及纺锤形的、表达神经钙黏附分子的成骨细胞(spindle-shaped N-cadherin-expressing osteoblasts,SNOs)数量的变化。结果全身照射(total body irradiation,TBI)后早期小鼠BMMSCs的成骨潜能增强,但随后迅速降低;TBI后28 d小鼠骨髓中成骨细胞和SNOs的数量均显著减少。结论4 Gy放射损伤后远期小鼠BMMSCs的成骨潜能显著降低,体内HSCs龛位也明显缩小。

山羊颈椎间盘纤维环组织成骨潜能的体内观察

目的:观察山羊颈椎椎间融合器内填充松质骨、纤维环组织后在体内的组织学变化过程,以了解纤维环组织在骨融合过程中的成骨潜能.方法:实验山羊按常规颈椎前路减压、内固定术式施术,术中随机取C2～C6椎间隙中相邻的两个间隙,每个间隙各置入两枚钛合金颈椎空心螺纹式柱状内固定器(CHTF),分别填充单纯松质骨(A组);松质骨+纤维环(B组);纤维环(C组)及空白对照(D组).术后应用X线片、颈椎CT扫描等影像学检查及组织切片观察植骨融合及局部组织反应情况.结果:X线片及CT示内置CHTF与椎体的骨-金属界面周围有骨组织生长,CHTF与椎体终板接触部位有成骨现象,骨桥形成.A组切片观察示新生软骨、骨小梁存在,原植入骨坏死;B组纤维组织有坏死,原骨小梁、纤维环周围新生骨存在,新生软骨堆积;C组术后6周纤维组织内有纤维软骨存在,术后12周新生软骨存在;D组术后6周组织学观察无阳性染色结果,术后12周有少量新生软骨.结论:颈椎间盘纤维环组织有成骨潜能,成骨形式可能是成纤维细胞的软骨化骨.

肥大型骨不连断端组织成骨潜能的实验研究

目的观察肥大型骨不连断端及其周围区域组织的结构特点,评估其成骨潜能。方法收集2009年至2012年因肥大型骨不连在我院行手术治疗患者的骨不连断端标本共25例,通过光学显微镜及透射电镜观察不同区域的组织结构特点和微观特征。采用免疫组化检测BMP-2的表达,在高倍镜(400倍)下对阳性细胞进行观察并计数,并作统计分析。结果肥大型骨不连断端区域呈现出不同的组织类型,中心区主要是纤维化组织,其内可见大量的成纤维样细胞;边缘区可见大量的软骨细胞,可见少量的新生血管形成;骨痂区见有一定量的成骨细胞及丰富的新生血管。免疫组化染色显示肥大型骨不连断端中心区、周围区及骨痂区组织BMP-2的表达明显不同(P<0.05)。结论肥大型骨不连断端区域的组织及细胞类型呈现出不同的特点,BMP-2含量减少使得不同区域的成骨潜能不同。

全身照射引起间充质干/祖细胞池缩小及成骨潜能改变

为了研究辐射对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSC)数量及成骨分化潜能的影响,探讨BMMSC在辐射损伤中的反应及其与照射后造血和骨骼系统长期损伤的关系,用全身照射(total body irradiation,TBI)小鼠模型观察TBI前后不同时间点小鼠骨髓纤维母细胞集落形成单位(colony-forming unit-fibroblast,CFU-F)的改变及BMMSC细胞周期分布情况;用Von Kossa染色法测定钙盐沉积,实时定量RT-PCR检测成骨分化相关基因及成骨转录共刺激因子TAZ(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)的表达变化。结果显示:TBI后骨髓CFU-F数量明显减少;TBI后3天较多的BMMSC进入细胞周期并且其成骨潜能明显增强,随后细胞周期分布恢复正常,但成骨潜能明显降低,同时伴有TAZ表达改变。结论:TBI能导致小鼠骨髓间充质干/祖细胞池的显著缩小并改变BMMSC的成骨分化潜能,TAZ表达的变化可能在其成骨潜能的改变中发挥一定作用。

颈椎病患者颈椎间盘纤维环成纤维细胞成骨潜能的体外观察

目的研究纤维环成纤维细胞成骨化生在颈椎间盘退变机制中的作用,以进一步揭示颈椎病的发病机理。方法利用体外细胞培养技术,建立颈椎病患者的颈椎间盘纤维环中成纤维细胞的培养体系,观察其在细胞因子rhBMP2、TNF-α条件培养液诱导下的成骨潜能表现。结果非条件培养组和条件培养组在传代的颈椎病患者纤维环成纤维细胞培养的各时间点的细胞增殖活力(MTT)测定无明显差异(P>0.05),细胞增殖速度较慢,条件培养液对细胞增殖无明显影响。rhBMP2、rhBMP2+TNF-α条件培养组细胞趋化性生长明显,细胞呈漩涡状和复层生长,局部密度增高,可见有肉眼观呈黑色点状矿化结节出现。各条件培养组的ALP活力经测定均与空白对照组ALP活力有显著性差异(P<0.05),rhBMP2+TNF-α组的成纤维细胞所形成的骨钙素分泌量均与空白对照组有显著性差异(P<0.05),而rhBMP2组、TNF-α组则与空白对照组无显著性差异。结论颈椎间盘纤维环成纤维细胞存在成骨潜能,rhBMP-2对纤维环成纤维细胞体外有明确的诱导成骨作用,纤维环成纤维细胞的骨化在颈椎退变的病理过程中有重要作用。

山羊颈椎间盘纤维环成纤维细胞成骨潜能的体外观察

目的诱导培养椎间盘纤维环成纤维细胞,探讨其成骨潜能,比较重组人骨形成蛋白2(recom b inan thum an bone m orphogenetic prote in 2,rhBM P-2)和肿瘤坏死因子α(tum or necros is factor,αTNF-α)对其成骨的不同影响。方法利用体外细胞培养技术,建立实验山羊颈椎间盘纤维环成纤维细胞培养体系,根据培养液的不同,分为空白对照组、TNF-α组(加入50 U/m lTNF-α)、rhBM P-2组(加入0.1μg/m l rhBM P-2)和TNF-α+rhBM P-2组(加入50 U/m l TNF-α+0.1μg/m l rhBM P-2),培养3周观察纤维环成纤维细胞在条件培养液诱导下的成骨表型变化、碱性磷酸酶(a lka line phosphatase,ALP)和骨钙素(osteoca lc in,OC)等成骨指标变化。结果各实验组培养液对细胞增殖无明显影响。rhBM P-2组和TNF-α+rhBM P-2组细胞趋化性生长明显,矿化结节出现,茜素红染色呈深红色钙阳性反应。各实验组ALP活力与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。rhBM P-2组与TNF-+αrhBM P-2组成纤维细胞的OC分泌量与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),TNF-α组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论体外培养的椎间盘纤维环成纤维细胞有成骨潜能,rhBM P-2对纤维环成纤维细胞有明确的诱导成骨作用。

放射抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨潜能并导致骨损伤

目的观察放射对小鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs）体外成骨潜能及体内骨组织的影响。方法分离、培养正常的及接受4Gy放射后28d的小鼠BMMSCs,用碱性磷酸酶（ALP）和Von Kossa染色法鉴定BMMSCs体外成骨分化潜能的改变,并通过骨组织形态学和骨密度（BMD）检测放射后小鼠体内骨组织的相关变化。结果4Gy照射28d后小鼠BMMSCs的成骨潜能明显降低,同时体内骨组织结构破坏,小鼠骨密度降低。结论放射损伤后小鼠BMMSCs的成骨潜能显著降低,可能在干细胞水平参与了放射后骨损伤的发生。

颈椎间盘纤维环组织的成骨潜能(英文)

背景:椎间盘组织的骨化机制及脊柱韧带、纤维组织的骨化演变过程尚不清楚。目的:实验拟观察颈椎间盘纤维环组织在骨融合过程中的成骨潜能。设计、时间及地点:对比观察,于2006-10在解放军第二军医大学实验动物中心和上海市伤骨科研究所完成。材料:健康实验山羊10只,雄性6只,雌性4只。羊用钛合金颈椎空心螺纹式柱状内固定器由常州康辉医疗器械有限公司参照羊的颈椎仿人用钛合金颈椎空心螺纹式柱状内固定器定制。方法:实验山羊按常规颈椎前路减压、内固定施术,随机取颈2～6椎间隙中相邻的2个间隙,每个间隙各置入2枚钛合金颈椎空心螺纹式柱状内固定器,共4枚。3枚钛合金颈椎空心螺纹式柱状内固定器中的填充组织分别为:单纯松质骨,松质骨+纤维环,纤维环。1枚不充填任何组织作为空白对照。主要观察指标:术后6,12周分别拍摄山羊颈椎正侧位X射线平片、颈椎CT平扫观察植入物在位及融合情况。组织学观察各组植骨融合情况及局部组织反应。结果:①X射线平片及CT显示实验山羊内植钛合金颈椎空心螺纹式柱状内固定器在整个实验过程中均在位,无松动、移位、脱落。山羊内植钛合金颈椎空心螺纹式柱状内固定器与椎体的骨-金属界面周围有骨组织生长,与椎体终板接触部位有成骨现象,骨桥形成。②单纯松质骨组新生软骨、骨小梁存在,原植入骨坏死;松质骨+纤维环组纤维组织有坏死、原骨小梁、纤维环周围新生骨存在,新生软骨堆积;纤维环组术后6周纤维组织内有纤维软骨存在,12周新生软骨存在;空白组对照组术后6周组织学观察无阳性染色结果,12周有少量新生软骨。结论:颈椎间盘纤维环组织的成骨形式可能是成纤维细胞的软骨化骨生成。

上颌窦黏膜具有成骨潜能的研究进展

上颌后牙区骨量不足可以通过不同方法的上颌窦提升术结合使用骨移植材料或不使用骨移植材料解决骨高度不足问题,并且同期或延期进行种植体种植术。最近临床研究上颌窦提升不使用移植材料发现也有骨组织形成。另外,一些病例也报道上颌窦囊肿去除和上颌窦内异位阻生牙去除后,也会有自发性骨组织形成。由此推断上颌窦黏膜具有成骨的潜能。本文将从骨组织生成的细胞分子学基础,人类实验,动物实验,临床试验出发,

狗骨髓基质细胞的分离培养及成骨潜能的研究

目的 观察狗骨髓基质细胞（MSCs）的生长特点及诱导条件下的成骨能力，为利用狗的MSCs进行成骨研究提供实验基础。方法 从成年狗胫骨取骨髓进行MSCs培养，检测细胞周期；应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法观察细胞增殖；测定碱性磷酸酶活性；用Von Kossa染色法观察钙化结节。观察在条件培养液中MSCs生长及成骨分化情况。结果 MSCs增殖能力强，细胞周期显示有20％的细胞处于G0／G1期。诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性明显增高，10～12d达到高峰，并出现钙化结节。结论 体外培养狗的MSCs具有分化成骨的潜能，增殖能力强，可作为骨组织工程的种子细胞。

重组人骨形态发生蛋白2与碱性成纤维细胞生长因子联合促进兔骨髓基质细胞血管内皮细胞生长因子表达及其成骨潜能

背景:了解在体外或体内环境下,应用重组人骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子,能否达到既加强成骨又促进血管内皮细胞生长因子表达的双重作用。目的:观察兔骨髓基质细胞经重组人骨形态发生蛋白2与碱性成纤维细胞生长因子刺激后,其血管内皮细胞生长因子表达及成骨潜能的变化。方法:取兔双侧股骨骨髓基质细胞,采用骨髓基质细胞体外培养技术,单独或联合以重组人骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子刺激细胞。细胞培养5d后,进行细胞形态、增殖情况、碱性磷酸酶活性、成骨结节、血管内皮细胞生长因子阳性细胞率等项目的检测。结果与结论:联合先后应用重组人骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子在细胞计数、碱性磷酸酶活性、矿化面积百分率、血管内皮细胞生长因子阳性细胞率4个检测项目上优于同时应用重组人骨形态发生蛋白2或碱性成纤维细胞生长因子以及单独应用重组人骨形态发生蛋白2或碱性成纤维细胞生长因子。结果表明合理的联合使用重组人骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子,不仅可促进骨髓基质细胞的快速增殖及向成骨细胞转化,还可促进促血管内皮细胞增生的重要介质血管内皮细胞生长因子的表达。

间充质干细胞在涂有聚氨基酸尿烷共聚物／胶原的聚四氟乙烯上的成骨潜能（英）

本研究利用已研发的聚四氟乙烯聚合体（e—P）和聚氨基酸尿烷共聚物／胶原（e—PPC）复合培养基做细胞培养基。将大鼠间充质干细胞（MSC）用含地塞米松的e—P和e—PPC聚合物培养。24小时后，MSC和e—PPC表面接触良好，14天后，MSC中碱性磷酸酶活性、钙沉积、骨钙蛋白表达明显上调。将MSC与聚合物培养1周，移植于鼠皮下，4周取材。

成纤维细胞成骨潜能的体外培养研究

本研究采用新西兰种家兔皮肤的成纤维细胞进行体外培养，通过活体相差显微缩时录像、体视显微镜摄影、ＨＥ染色以及组织化学染色等技术做系列观察。发现成纤维细胞在体外培养条件下，不仅能产生粘多糖、胶原等基质成分，而且还能提供钙盐沉积。培养中期，成纤维细胞培养液显示ＡｌＰ阳性反应；培养后期，培养液与成纤维细胞都可显示ＡｌＰ阳性反应。四环素荧光标记证明成纤维细胞所形成的小结与小梁均为新生骨组织。由此表明：皮肤成纤维细胞在体外培养中能显示成骨潜能。

家兔皮肤成纤维细胞的成骨潜能（组织化学及放射自显影研究）

家兔皮肤的中厚皮片，经制备成小皮块以后作体外培养。成纤维细胞自皮块游出，不断增多，以后开始汇合、形成多层结构。成纤维细胞分泌众多颗粒，堆积在细胞的表面，逐步形成云雾状物质。云雾状物质增大、成为圆形或卵圆形结节。相邻的结节可被条状小粱联在一起。用新生骨组织的特异标记物一四环素及茜素红，作组织化学观察，结节及小梁均呈阳性反应，说明成纤维细胞所形成的结节及小梁均为骨组织。将体外培养的成纤维细胞用￣３Ｈ－ＴｄＲ标记后注射进同一家兔的桡骨骨折部位，以后经放射自显影技术可以在骨性骨痴的骨小梁内观察到具银颗粒的骨细胞。这说明在骨折愈合过程中成纤维细胞能演变为骨细胞，从而证明成纤维细胞的成骨潜能。

免疫介导型再生障碍性贫血小鼠间充质干细胞成骨及成脂潜能改变

[目的]探讨免疫介导型再生障碍性贫血小鼠间充质干细胞(msenchymal stem cell,MSC)向成骨及成脂肪细胞分化潜能的改变。[方法]采用免疫介导法进行再障造模,Babl/c小鼠经60Co射线亚致死剂量照射后,自尾静脉输入DBA/2小鼠的淋巴细胞建立免疫介导型再生障碍性贫血小鼠模型;造模15天后进行再生障碍性贫血小鼠骨髓间充质干细胞培养,并检测骨髓成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)数量变化,观察模型小鼠骨髓病理改变;茜素红和油红O分别检测模型小鼠MSC钙结节数和脂肪细胞形成率。[结果]再障模型小鼠CFU-F数明显减少;骨髓病理切片显示,造血组织减少,并脂肪化;再障小鼠MSC钙结节数量减少,脂肪细胞分化率显著增加。[结论]免疫介导再生障碍性贫血小鼠MSC成骨潜能减弱,成脂潜能明显增强。

家兔皮肤成纤维细胞体外成骨潜能的研究

作者将家兔皮肤的中厚皮片制备成小皮块后，作体外培养，在倒置相差显微镜下观察，并作扫描电镜检查。结果显示成纤维细胞自皮块游出，不断增多，开始汇合。细胞呈现鳞片形状、具树枝样分叉，并形成多层结构。成纤维细胞开始分泌众多微小颗粒，堆集在细胞的表面及周围。以后在细胞表面出现细针状结晶。结晶及颗粒结合在一起，不断增大，成为结节。成纤维细胞以辐射状排列在结节的四周。相邻的结节联在一起，形成小梁状的组织。用新生骨组织的特异标记物四环素及茜素红，作组织化学观察，结节及小梁状的组织均呈阳性反应，说明成纤维细胞所形成的结节及小梁状组织均为骨组织，从而证明成纤维细胞的成骨潜能。

骨髓基质细胞体外培养的生物学特性和成骨能力初步鉴定

目的体外分离培养狗的骨髓基质细胞(BMSCs),诱导其向成骨细胞分化,初步鉴定其成骨潜能和生物学特性。方法抽取毕格犬髂骨骨髓体外分离培养获得BMSCs,DMEM、新生牛血清培养基进行原代培养,部分传代细胞以含10 mmol／L地塞米松、50μg／ml抗坏血酸和10 mmol／L β-甘油磷酸钠的矿化培养液诱导其向成骨细胞增殖分化。倒置相差显微镜进行细胞形态学和细胞生长增殖观察,Von Kossa法染色检测体外矿化结节形成,细胞碱性磷酸酶染色检测BMSCs 的成骨活性。结果体外分离培养的BMSCs经条件培养基诱导后表现出明显的成骨活性,体外矿化(骨样)结节的Von Kossa染色阳性;传代BMSCs碱性磷酸酶染色阳性。结论体外分离培养的BMSCs中含有骨源性前体细胞,传代细胞具有较强的成骨潜能。

丹参对成纤维细胞成骨的扫描电镜观察

目的:阐明丹参对成纤维细胞成骨功能的影响。方法:用皮肤纯化的成纤维细胞作体外培养,分丹参组与对照组,在扫描电镜下观察。结果:0.2%、0.3%浓度的丹参能明显促使成纤维细胞由梭形向鳞片形方向转化,细胞量增多,胶原合成分泌增加,但未见骨结节形成。结论:适当浓度的丹参对成纤维细胞有促增殖、促分化、增加其功能活性的作用,但不能作为诱导因子来诱导成纤维细胞成骨潜能的显示。