MT01对Pg感染的成骨细胞MG63特异性成骨相关因子表达的影响

目的:通过检测MT01对牙周致病菌Pg感染的成骨细胞MG63细胞内特异性成骨相关因子基因表达水平,探讨MT01对感染状态下成骨细胞成骨分化作用的影响。方法:选取生长状态稳定的人成骨样细胞MG63接种于6孔板,分别加入质量浓度1mg/L的特定序列寡核苷酸MT01和等体积PBS,共孵育3h后,加入感染复数MOI=100∶1的Pg菌悬液(对照组加等体积PBS)。即实验分为:MT01+Pg、MT01、Pg和空白对照4组,Realtime PCR检测2、4、6、8、12、24h特异性成骨相关因子Runx2,SP7mRNA的表达。结果:在有无Pg感染的状态下,MT01均可上调成骨细胞MG63细胞内成骨相关因子Runx2,SP7mRNA的表达,但在不同时间点,MT01调控Runx2,SP7mRNA表达上调的能力存在差异。结论:MT01可以促进牙周致病菌感染下的成骨细胞的成骨向分化。

miR-31-5p对牙髓干细胞HIF-1α/BNIP3信号通路及成骨相关因子表达的影响

目的 :探讨微小RNA-31-5p(miR-31-5p)对牙髓干细胞(DPSCs)低氧诱导因子1α(HIF-1α)/Bcl-2/腺病毒E1B 19-kDa相互作用蛋白3(BNIP3)信号通路及成骨相关因子表达的影响。方法 :体外培养人DPSCs,分为对照组(不转染)、mimic NC组(转染negative control-miR-31-5p)、miR-31-5p mimic组(转染hsa-miR-31-5p mimic)、si RNA NC组(转染nonsense siRNA)和miR-31-5p siRNA组(转染miR-31-5p siRNA)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组DPSCs细胞中miR-31-5p、HIF-1α、BNIP3、碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录子2(Runx2)mRNA的表达情况,MTT法检测各组DPSCs细胞增殖情况,ALP活性测定试剂盒检测各组DPSCs细胞ALP活性,蛋白印迹(WB)法检测各组DPSCs细胞中HIF-1α、BNIP3、Runx2蛋白的表达情况。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与对照组、mimic NC组相比,miR-31-5p mimic组DPSCs细胞A值、ALP mRNA表达水平及活性、Runx2 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05),ALP染色明显减弱,miR-31-5p mRNA、HIF-1α、BNIP3 mRNA及HIF-1α、BNIP3、Beclin1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与对照组、siRNA NC组相比,miR-31-5p siRNA组DPSCs细胞A值、ALP mRNA表达水平及活性、Runx2 mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.05),ALP染色明显增强,miR-31-5p mRNA、HIF-1α、BNIP3 mRNA及HIF-1α、BNIP3、Beclin1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论 :miR-31-5p可以激活HIF-1α/BNIP3信号通路,抑制DPSCs细胞的成骨相关因子表达。

全髋关节置换者骨髓间充质干细胞中成骨细胞相关因子的基因表达

背景:全髋关节置换后假体的使用寿命与假体周围有效的骨生成密切相关,这包括骨髓间充质干细胞的募集。碱性磷酸酶、Runx2、MSX2、骨形态发生蛋白2及骨形态发生蛋白受体1a,b的基因表达可反映出骨髓间充质干细胞的成骨潜能。目的:分析全髋关节置换患者骨髓间充质干细胞相关成骨基因的表达水平与性别、年龄及体质量指数的关系。方法:选取12例接受全髋关节置换的患者,术中取患者股骨近端的骨髓组织于体外在α-MEM与体积分数20%胎牛血清培养基中扩增至子一代(Passage1),取出细胞进行流式细胞学或RNA检测,应用反转录-聚合酶链反应用检测成骨相关信号因子SOST、碱性磷酸酶、Runx2,MSX2、骨形态发生蛋白2及骨形态发生蛋白受体1a,b的RNA表达水平。骨形态发生蛋白2与骨形态发生蛋白1a,b的关系应用线性回归分析;成骨相关因子与SOST的关联性应用Pearson分析。结果与结论:骨髓间充质干细胞成骨相关信号因子与患者的性别、年龄及体质量指数无明显相关性。线性回归分析表明,骨形态发生蛋白2与骨形态发生蛋白受体1a存在显著相关性(P<0.01),但与骨形态发生蛋白受体1b无相关性。SOST与碱性磷酸酶、MSX2及骨形态发生蛋白受体1a有相关性(P<0.05)。提示全髋关节置换后假体的稳定性可能与患者的成骨能力相关。尽管性别、年龄及体质量指数等与成骨潜能无明显联系,但这些因素仍然可能影响假体的稳定性。

刘氏正骨方2号对过表达Sclerostin腺病毒转染后BMSCs促成骨分化的影响

目的探究刘氏正骨方2号对过表达Sclerostin腺病毒转染后BMSCs中Wnt信号通路及成骨相关因子的影响。方法分别用刘氏正骨方2号含药血清、BMP-2干预BMSCs,并分为对照组、中药组、BMP-2组,采用CCK-8法检测细胞活性,ALP染色、茜素红染色检测成骨诱导28 d后各组细胞ALP活性和矿化情况,荧光定量PCR、Western Blot法检测各组细胞中Col1A2、OCN、OPN、Sclerostin表达。采用腺病毒转染技术过表达BMSCs中Sclerostin基因,分为空白对照组、过表达Sclerostin组,再分别用空白血清、中药血清体外干预3 d后,检测Wnt信号通路相关分子(LRP5、β-catenin)和成骨相关因子Runx2的表达情况。结果与空白对照组比较,中药组BMSCs细胞活性及成骨分化程度增强,BMP-2组成骨分化程度高于中药组,但BMP-2组细胞活性最低(P<0.05);在Sclerostin基因表达方面,中药组出现表达抑制,而BMP-2组呈上调趋势(P<0.05)。腺病毒转染BMSCs可抑制BMSCs细胞活性,上调Sclerostin mRNA和蛋白表达。与NT比较,Ad-SOST组细胞活性降低,LRP5、β-catenin、Runx2表达下调(P<0.05);与空白血清比较,中药血清干预后NT组、Ad-SOST组细胞活性不同程度增强,而LRP5、β-catenin、Runx2表达上调(P<0.05)。结论刘氏正骨方2号具有增强BMSCs细胞活性、促进成骨分化作用,可影响过表达Sclerostin腺病毒转染后BMSCs的LRP5、β-catenin、Runx2表达。

壮骨止痛胶囊调控OSX、OPN蛋白对去势大鼠成骨细胞分化的影响

目的探究壮骨止痛胶囊含药血清调控成骨相关转录因子抗体(osterix, OSX)、骨桥蛋白(osteopontin, OPN)对去势大鼠成骨细胞分化的机制。方法 50只3月龄雌性大鼠,随机分为空白组、假手术组、模型组、骨松宝组和壮骨止痛胶囊组,10只/组,除空白组及假手术组外,摘除双侧完整卵巢,然后各组分别予以相应干预,获取相应血清;10只新生SD乳鼠提取原代成骨细胞,培养至第三代后添加上述分组相应10%血清,银染及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色鉴定成骨细胞,免疫组化检测OSX、OPN蛋白的表达。结果各组中的成骨细胞银染呈褐色、碱性磷酸酶染色呈蓝紫色;免疫组化结果表明,骨松宝组、壮骨止痛胶囊组中细胞质呈棕色;空白组和假手术组呈浅棕黄色;模型组几乎不见棕黄色。与假手术组比,模型组OSX、OPN蛋白的表达率降低(P<0.05);壮骨止痛方及骨松宝干预后OSX、OPN蛋白表达率较模型组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论壮骨止痛胶囊组含药血清能促进OSX、OPN蛋白分泌,从而促进成骨细胞增殖、分化,发挥抗绝经后骨质疏松作用。

中药对成骨细胞分化增殖和功能表达影响的研究进展

中药在成骨领域中的研究与应用不断地发展与突破,但其作用机理还有待进一步的深入研究。本研究就中药对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化、成骨细胞分化和增殖、成骨细胞功能表达、成骨细胞信号通路调控的影响进行了综述,为成骨中药临床应用提供新的思路与依据。

吡格列酮对正常MC3T3-E1成骨细胞增殖、凋亡以及功能蛋白表达的影响

目的探讨不同浓度吡格列酮(PIO)对正常糖浓度培养下MC3T3-E1小鼠早期成骨细胞增殖、凋亡及功能蛋白分泌表达的影响。方法体外培养MC3T3-E1细胞,分为正常对照组、不同浓度PIO干预组(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L),分别干预24、48 h。CCK-8检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RIA法和ELISA法分别检测相关功能蛋白骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP),RT-PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、成骨因子runt相关基因2(Runx2)及骨形成蛋白-2(BMP-2)mRNA表达水平。结果 (1)与对照组比较,MC3T3-E1细胞增殖能力在5μmol/L PIO干预组增加显著(P<0.05)、在PIO大于5μmol/L～10μmol/L干预组则降低(P<0.05)。干预时间由24 h延长至48 h,各组细胞增殖能力呈不同程度增加,但在20、40μmol/L PIO干预的两组增加无统计学差别。(2)对照组及各PIO浓度干预干预24 h,细胞凋亡率分别为:1.97%、0.43%、13.0%、48.30%、81.00%;(3)随着PIO浓度从0～40μmol/L范围内的增加,MC3T3-E1细胞的PPARγmRNA表达水平呈增加趋势(P<0.05);Runx2 mRNA表达量在5μmol/L PIO浓度组时较对照组增加,在剂量较高时(PIO≥10μmol/L)随浓度升高表达下降。(4)细胞功能蛋白ALP、OCN的分泌及BMP-2的表达在5μmol/L PIO浓度组时最高,PIO≥10μmol/L时,上述蛋白量逐渐下降(P<0.05);随干预时间从24～48 h延长,各PIO浓度干预组ALP以及BMP-2量增加(P<0.05),而OCN无显著改变(P>0.05)。结论 PIO对正常糖浓度培养的MC3T3-E1细胞具有双向作用:低浓度促进细胞增殖,高浓度则促进凋亡。PPARγ适当激活可促使成骨细胞通过Runx2增加功能蛋白的合成;过度激活,则表现出细胞毒性。

miR-21对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响

目的探讨miR-21对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)增殖及成骨的影响,旨在为干细胞治疗牙周炎提供实验基础。方法酶解组织块法分离培养hPDLSCs,通过流式细胞仪检测表面分子CD34、CD45、CD90、CD105对hPDLSCs进行鉴定,采用Lipofectamine 2000将miR-21的mimics(pre-miR-21)、inhibitor(anti-miR-21)以及各自的阴性对照转染至hPDLSCs。实验分组:过表达组(mimics组)、过表达阴性对照组(mimics-NC组);抑制阴性对照组(inhibitor-NC组)、抑制组(inhibitor组)。实时荧光定量PCR检测miR-21转染效率;CCK-8、流式细胞术检测hPDLSCs的增殖;茜素红染色检测hPDLSCs的成骨能力和Western blot检测成骨相关基因Runx2的蛋白表达。结果miR-21的mRNA表达量mimics组较mimics-NC组明显升高,inhibitor组较inhibitor-NC组明显降低(P<0.05)。hPDLSCs增殖及S期细胞比例mimics组较mimicsNC组升高,inhibitor组较inhibitor-NC组减少,差异有统计学意义(P<0.05)。经茜素红染色后,mimics组矿化结节多于mimics-NC组;inhibitor组矿化结节少于inhibitor-NC组;Western blot检测mimics组Runx2蛋白表达高于mimics-NC组,inhibitor组Runx2蛋白表达量较inhibitor-NC组减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-21调控hPDLSCs的增殖和成骨向分化。

miR-214抑制牙囊细胞成骨分化的体外研究

目的探讨miR-214对于牙囊细胞(dental follicle cells,DFCs)成骨分化的影响。方法双向差速传代法体外培养提纯牙囊细胞,以未转染的DFCs为对照(DFCs组),通过向DFCs中转染miR-214-3p mimics(miR-214 mimics组)或miR-214-3p inhibitor(miR-214 inhibitor组)分别上调和下调DFCs中的miR-214的表达。成骨诱导7 d,qRT-PCR检测miR-214表达及相关成骨基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨粘连蛋白(osteonectin,OSN)、成骨相关转录因子2(runt-related transcription factor-2,RUNX-2)的mRNA表达,免疫蛋白印迹检测各组RUNX-2、β-catenin蛋白表达;成骨诱导14 d茜素红染色观察矿化结节形成的情况。结果骨诱导7d,相较DFCs组,miR-214 mimics组miR-214的表达上调,miR-214 mimics组成骨相关基因ALP、OSN及RUNX-2的mRNA表达均低于DFCs组,但仅ALP在两组的差异具有统计学意义(P>0.05),而miR-214 inhibitor组成骨相关基因ALP、OSN、RUNX-2的mRNA表达均高于DFCs组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。miR-214mimics组RUNX-2、β-catenin的蛋白表达均低于miR-214 inhibitor组。miR-214 mimics组钙化结节明显少于DFCs组,而miR-214 inhibitor组钙化结节却明显多于DFCs组。结论miR-214上调可使β-catenin表达下调,并抑制成骨相关基因ALP、OSN及RUNX-2的表达,抑制成骨分化;下调miR-214,结果相反;miR-214可能是通过下调β-catenin的表达,抑制DFCs的成骨分化。

非编码RNA调控血管平滑肌细胞成骨样表型转化的研究进展

分化成熟的血管平滑肌主要功能是收缩血管、调节血管周径及血压等.在高磷、高糖、维生素D3、炎症等因素的作用下,平滑肌细胞可转分化为成骨样细胞参与血管钙化的形成,诱发心脑血管不良事件.非编码RNA是经基因转录但不翻译为蛋白质的一类RNA总称,其通过调控多种细胞活动来参与机体的生理和病理过程.已有研究表明,非编码RNA可通过调控血管平滑肌细胞成骨样表型转化影响血管钙化的发生、发展.本文从微小RNA、长链非编码RNA、环状RNA几方面综述非编码RNA在血管平滑肌成骨样表型转化中的调节作用,有助于进一步了解血管钙化的分子机制以及发现防治血管钙化的新靶点.

两种杜仲黄酮类化合物对成骨细胞OPG/RANKL及成骨相关转录因子的影响

目的:研究杜仲黄酮类化合物紫云英苷和黄芩素对成骨细胞特异性转录因子Osterix及破骨细胞抑制因子与核因子κB受体活化因子配体比值(OPG/RANKL)的影响。方法:采用MC3T3-E1 Subclone 14成骨细胞,不同浓度紫云英苷和黄芩素和维生素D3组加入质量浓度为30 mg·L-1作用细胞24 h后,用MTT法检测细胞增殖情况,成骨细胞接种于24孔板后,空白组加入培养基,给药组分别加入质量浓度为80 mg·L-1(高浓度),40 mg·L-1(中浓度),7.5 mg·L-1(低浓度)的含紫云英苷或黄芩素,作用24 h后,ELISA法检测钙离子活性,蛋白免疫印迹法检测Osterix,OPG以及RANKL的蛋白表达水平。结果:与空白组相比,紫云英苷和黄芩素可后明显促进MC3T3-E1 Subclone 14成骨细胞的增殖(P<0.05);明显上调OPG和Osterix的表达(P<0.05),同时能降低RANKL的表达(P<0.05)。结论:杜仲黄酮类化合物紫云英苷和黄芩素能促进MC3T3-E1Subclone 14成骨细胞增殖,并上调Osterix和OPG/RANKL。

Runx2,Osterix及MMP-13在大鼠激素性股骨头无菌性坏死组织中的表达及意义

目的探讨Runx2,Osterix及MMP-13蛋白及基因在大鼠激素性股骨头无菌性坏死组织中的表达。方法40只成年Wistar大鼠随机分为模型组(30只)和对照组(10只)。模型组大鼠接受地塞米松20 mg/kg肌肉注射,1次/周,注射后,在跑步机上对动物进行训练。模型组根据训练时间分为3组(各10只):A组8周;B组10周;C组12周。采用PCR和Western blot方法检测大鼠股骨头组织中基因及蛋白变化。结果模型组大鼠脂肪细胞最大直径、空骨陷窝率高于对照组,且随着训练时间的增加,脂肪细胞最大直径、空骨陷窝率逐渐增加,差异具有统计学意义(P<0.00);模型组骨小梁面积低于对照组,且随着训练时间的增加,骨小梁面积逐渐降低,差异具有统计学意义(P<0.00)。模型组大鼠Runx2,Osterix蛋白与基因表达量低于对照组,且随着时间的延长,表达量逐渐降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠MMP-13蛋白与基因表达量高于对照组,且随着时间的延长,表达量逐渐增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论激素性股骨头坏死组织中Runx2,Osterix在mRNA和蛋白表达水平均低于正常股骨头组织,MMP-13高于正常股骨头组织。

MiR-34a可双向调控感染及非感染状态成骨样细胞的成骨分化

目的将微小RNA-34a(miR-34a)转染至健康及炎症状态下成骨样细胞,检测其对细胞成骨分化能力的影响。方法取人成骨样细胞(MG63)为实验细胞,将miR-34a拟态物转染至细胞并用实时定量PCR法(RTPCR)及荧光显微镜检测转染效率。RT-PCR检测受牙龈卟啉单胞菌(Pg)感染的MG63细胞内miR-34a表达量变化及转染miR-34a后健康或炎症状态下MG63细胞中成骨相关因子Ⅰ型胶原(COLⅠ)、Runt相关转录因子2(Runx2)及Osterix成骨相关转录因子(SP7)表达量变化。结果 MiR-34a有效转染至MG63细胞内;miR-34a可促进MG63细胞内COLⅠ、Runx2及SP7基因表达;炎症状态下MG63细胞内miR-34a表达量下降;miR-34a降低感染状态下MG63细胞内COLⅠ、Runx2及SP7基因表达量。结论证实miR-34a促进MG63细胞成骨分化,当细胞处于感染状态时,其抑制细胞成骨分化。

OSX基因沉默对醛固酮诱导的小鼠血管平滑肌细胞钙化的影响

目的研究成骨相关转录因子(OSX)沉默对醛固酮诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)成骨样分化和钙化的影响。方法体外原代培养小鼠的VSMC。针对小鼠OSX基因设计合成小分子干扰RNA(siRNA)序列,使用Lipo 2000为载体,转染体外培养的VSMC;FAM荧光标记siRNA优化转染条件。实时PCR检测OSX mRNA表达。将siRNA序列转染VSMC,细胞分为4组:1正常组;2醛固酮组(1.5 mmol/L);3siRNA转染组:醛固酮+OSX-siRNA;4阴性转染对照组:醛固酮+阴性对照siRNA。实时RT-PCR及免疫印迹法检测OSX、整联结合涎蛋白(Ibsp)基因和蛋白表达;茜素红染色观察细胞钙盐沉积。结果与醛固酮组相比,siRNA转染组OSX mRNA表达在转染后24 h及48 h均明显低于醛固酮组(均P<0.01);OSX蛋白表达在转染后48 h和72 h均低于醛固酮组(均P<0.01),以48 h最明显。siRNA有效沉默OSX基因表达后,OSX转染组Ibsp mRNA和蛋白的表达低于醛固酮组(均P<0.01),而且细胞钙盐沉积低于高磷组。结论 OSX-siRNA可以有效抑制VSMC OSX基因和蛋白的表达,从而抑制醛固酮诱导的VSMC成骨样分化和细胞钙化。OSX可以成为CKD血管钙化治疗的靶点。

氟化钠饮水染毒6个月对大鼠骨组织成骨活性标志的影响

[背景]氟中毒是由于长期从空气、食物和饮水中摄入过量的氟而引起的以氟骨症和氟斑牙为主要特征的一种慢性全身性疾病。地方性氟中毒在全国分布广泛且严重,受威胁人口众多。研究氟中毒相关机制有助于预防和治疗因摄氟过多而造成的氟骨症、氟斑牙等骨相病变。[目的 ]探讨不同浓度氟化钠染毒对大鼠成骨活性标志的影响,为研究氟中毒机制提供实验数据。[方法 ]将32只SD大鼠按体重均衡随机均分为:对照组(0 mg/L)、低氟组(50 mg/L)、中氟组(150 mg/L)、高氟组(250 mg/L)。采取饮水染毒方式,染氟至6个月时分别收集各组大鼠12 h尿液,测定尿氟浓度;大鼠经10%水合氯醛麻醉,心脏采血处死后,测定血氟浓度;取左前肢,液氮研磨,采用实时荧光PCR法测定Col Ⅰ、Runx2和Osx mRNA表达水平;取右前肢,液氮研磨,采用Western blot检测Col Ⅰ、Runx2和Osx的蛋白表达水平。[结果 ]染毒期间,大鼠饮食、饮水正常,精神状况良好,不同染毒组与对照组相比体重差异均无统计学意义。染氟6个月后,低、中、高染氟组大鼠尿氟含量[(9.71±2.33)、(20.36±4.92)、(42.36±4.56)mg/kg]均高于对照组[(5.69±1.59)mg/kg],差异有统计学意义(P <0.05);低、中、高染氟组大鼠血氟含量[(0.19±0.01)、(0.23±0.01)、(0.29±0.02)mg/L]均高于对照组[(0.14±0.01)mg/L],差异有统计学意义(P <0.05);且随着染氟剂量的增加,尿氟和血氟都呈上升趋势(分别r=0.89、0.90,均P <0.01)。染氟6个月后,低、中、高染氟组大鼠Col Ⅰ mRNA表达[分别为(0.91±0.28)、(0.87±0.33)、(0.67±0.31)]均低于对照组(1.31±0.43),低、中、高染氟组大鼠Runx2 mRNA表达[分别为(0.81±0.33)、(0.78±0.18)、(0.57±0.25)]均低于对照组(1.18±0.28),差异均有统计学意义(P <0.05);且随着染氟剂量的增加,Col Ⅰ和Runx2 mRNA的表达都呈下降趋势(r=-0.56、-0.31,均P <0.05)。与对照组(1.01±0.15)相比,低、中染氟组大鼠Osx mRNA表达量[分别为(1.31±0.20)、中氟组(1.49±0.41)]升高,但高氟组(0.58±0.15)降低,差异均有统计学意义(P <0.05)。染氟6个月后,低、中、高染氟组大鼠Col Ⅰ蛋白相对表达量[分别为(0.17±0.02)、(0.15±0.01)、(0.11±0.03)]均低于对照组(0.22±0.03),差异有统计学意义(P <0.05);且随着染氟剂量的增加,Col Ⅰ蛋白的相对表达量呈下降趋势(r=-0.88,P <0.05)。与对照组[分别为(0.19±0.03)、(0.16±0.03)]相比,低氟组[分别为(0.30±0.04)和(0.25±0.02)]、中氟组[(0.26±0.01)和(0.31±0.03)]大鼠的Runx2蛋白和Osx蛋白的相对表达量升高,高氟组[(0.12±0.02)和(0.10±0.03)]降低,差异均有统计学意义(P <0.05)。[结论 ]氟对骨组织成骨活性标志表达的影响复杂,Col Ⅰ的表达随着染毒剂量的增加呈下降趋势;而中、低剂量染毒会促进Runx2和Osx的表达,高剂量时则会抑制其表达。