miR-130a-5p靶向Runx2对牙槽骨成骨细胞增殖和分化的影响及其调控机制研究

目的:探究miR-130a-5p靶向Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)对牙槽骨成骨细胞(Alveolar osteoblast,AOB)增殖、凋亡、成骨分化的影响及其机制。方法:将AOB分为NC组、miR-NC组、miR-130a-5p组、miR-130a-5p+Runx2组和miR-130a-5p+SHH组。双荧光素酶报告验证miR-130a-5p对Runx2、Sonic hedgehog(SHH)的调控关系;CCK-8及EdU染色检测细胞增殖能力;AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡能力;ALP染色、茜素红染色检测细胞成骨分化能力;RT-qPCR检测miR-130a-5p、Runx2、SHH、神经胶质瘤关联癌基因同源物1(Gli1)mRNA水平;Western Blot检测增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Ki67、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 related X protein,Bax)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP2)、Runx2、SHH、Gil1水平。结果:miR-130a-5p靶向调控Runx2、SHH。过表达miR-130a-5p后,细胞24 h、48 h、72 h OD值及EdU阳性率降低,细胞凋亡率升高,成骨分化能力降低,miR-130a-5p、Bax蛋白水平升高,Runx2、PCNA、Ki67、Bcl-2、ALP、OCN、BMP2蛋白及SHH、Gil1 mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)。过表达miR-130a-5p和Runx2或过表达miR-130a-5p和SHH可减弱过表达miR-130a-5p对细胞增殖、凋亡、成骨分化的影响。结论:miR-130a-5p靶向Runx2抑制AOB增殖和成骨分化,并促进AOB凋亡,其可能通过抑制SHH信号通路发挥作用。

降钙素基因相关肽对大鼠成骨细胞表达转录因子RUNX2的影响

目的:探讨外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对大鼠颅盖骨来源成骨细胞RUNX2因子表达水平的影响,进一步了解CGRP促进成骨的作用机制。方法:用酶消化法培养原代大鼠成骨细胞并鉴定;MTT法筛选促进成骨细胞增殖的有效浓度,将含有不同浓度CGRP的条件培养基加入大鼠成骨细胞培养体系中,药物作用48 h后,用半定量RT-PCR和Western blotting方法检测大鼠成骨细胞转录因子RUNX2在mRNA和蛋白水平的表达。结果:当CGRP浓度在10-8～10-6mol/L范围时,对成骨细胞增殖有明显促进作用,增殖率分别为71.9%,142.1%,321.0%,P<0.05;浓度为10-7和10-6mol/L的CGRP作用于成骨细胞48 h后,转录因子RUNX2在mRNA水平的表达量明显上调,分别增强(46.2±11.2)%和(58.6±14.0)%,P<0.05;转录因子RUNX2的蛋白表达变化趋势与其mRNA的表达变化趋势基本一致。结论:一定浓度的CGRP对大鼠成骨细胞转录因子RUNX2的表达有直接促进作用,RUNX2可能参与了CGRP刺激成骨细胞增殖反应的机制。

Runx2基因高表达对脐血间充质干细胞成骨分化相关基因表达的影响

背景:Runx2在成骨分化的信号途径中起核心作用,在诱导干细胞成骨分化及促进骨愈合方面具有重要的研究意义。目的:观察Runx2基因高表达对脐血间充质干细胞成骨分化的影响。方法:(1)扩增Runx2基因,利用腺病毒载体构建Runx2重组腺病毒(pA d-Runx2),检测病毒滴度后用重组腺病毒感染脐血间充质干细胞,并于荧光显微镜下观察荧光表达变化;(2)感染后1,3,7,14 d采用实时荧光定量PCR及Western blot检测脐血间充质干细胞Runx2、BMP-2、OCN、ALP的mRNA和蛋白表达。结果与结论:(1)成功制备pA d-Runx2重组腺病毒,病毒滴度为1.7×10^(10)pfu/L;(2)Runx2重组腺病毒感染脐血间充质干细胞后细胞形态呈成骨样细胞改变,对照组细胞无明显变化;(3)感染组细胞Runx2、BMP-2、OCN、ALP mRNA和蛋白的表达量随感染时间的增加均有不同程度的上调;(4)结果表明,高表达Runx2基因腺病毒感染脐血间充质干细胞,能够上调BMP-2、OCN、ALP基因的表达,从而促进脐血间充质干细胞的成骨分化。

miR-192-5p靶向CKIP-1促进骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化

背景:酪蛋白激酶2结合蛋白1(casein kinase 2-interaction protein-1,CKIP-1)是一种重要的骨形成负调控基因,其敲除鼠骨质显著增强、骨形成和骨密度也显著提高。而miRNA作为较早发现的小分子调控物,对大多数编码基因具有调控作用,在成骨分化中发挥重要作用。目的:探讨miRNA/CKIP-1对骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其分子机制。方法:采用miRNA-Seq技术检测2022年3-6月在开封市中心医院骨外科就诊32例骨质疏松患者及同期体检中心健康人群骨髓间充质干细胞中miRNA的变化情况;利用Targetscan网站预测靶向调控CKIP-1的miRNA,利用荧光素酶报告基因实验检测miRNA与CKIP-1启动子区DNA的结合;在骨髓间充质干细胞中转染miR-192-5p类似物(miR-192-5p mimics)/阴性对照(NC mimics)或miR-192-5p抑制剂(miR-192-5p inhibitor)/阴性对照(NC inhibitor),成骨诱导后第7,14天,通过实时荧光定量PCR技术及茜素红染色检测成骨标志基因Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素、抗骨桥蛋白、骨唾液蛋白及CKIP-1的表达水平和骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的情况;采用蛋白质免疫印迹实验及茜素红染色检测miR-192-5p/CKIP-1/轴对细胞成骨分化的的调控作用。结果与结论:与健康组相比,骨质疏松组有16个miRNA表达明显升高,53个miRNA表达明显降低(P<0.05);利用Targetscan网站预测,并通过荧光素酶报告基因实验验证,发现miR-192-5p与CKIP-1有互补的核苷酸序列(P<0.05);过表达miR-192-5p,Runx2、骨钙素、骨桥素和骨唾液蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),抑制miR-192-5p,Runx2、骨钙素、骨桥素和骨唾液蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),而沉默CKIP-1的表达后,Runx2、骨钙素及骨桥素的蛋白水平增加(P<0.05),逆转了敲低miR-192-5p对细胞成骨分化的抑制作用。上述结果证实,miR-192-5p在骨质疏松症中表达降低;miR-192-5p通过靶向抑制CKIP-1的表达,促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

三种补肾方含药血清对衰老骨髓间充质干细胞成骨分化及Runx2表达的影响

目的探究3种补肾方(健骨二仙丸、六味地黄丸、金匮肾气丸)含药血清对衰老骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化及Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2,Runx2)表达的影响,研究3种补肾方治疗骨质疏松症的机制。方法将40只SPF级SD大鼠随机分为空白对照组(等体积生理盐水)、健骨二仙丸组(75.9 g/kg)、六味地黄丸组(85.8 g/kg)及金匮肾气丸组(89.1 g/kg),每组10只,分别灌胃用于制备含药血清。建立对数增长的P3代BMSCs。500μmol/L 30%H_(2)O_(2)处理以建立氧化衰老BMSCs模型。cck-8法检测衰老BMSCs代谢活性。衰老BMSCs分为模型组、诱导组、空白血清组、健骨二仙丸含药血清组、六味地黄丸含药血清组、金匮肾气丸含药血清组,共6组。在诱导第4、8、12、16天,观察各组细胞形态学变化,Western blot法检测Runx2蛋白表达,RT-PCR法检测Runx2 mRNA相对表达量。结果与正常BMSCs比较,H_(2)O_(2)处理后的BMSCs活性显著降低(P<0.05)。对比模型组,诱导组和空白血清组衰老BMSCs在分化过程中,茜素红染色增多;对比诱导组及空白血清组,各含药血清组衰老BMSCs在分化过程中,茜素红染色增多;且除模型组外,各组随着时间推移,茜素红染色不断增加。在第4、8、12、16天,对比模型组,诱导组、空白血清组Runx2 mRNA和蛋白表达水平均升高(P<0.05);对比诱导组、空白血清组,健骨二仙丸含药血清组、金匮肾气丸含药血清组Runx2 mRNA和蛋白表达水平均升高(P<0.05)。在第4、8、12天,对比诱导组,六味地黄丸含药血清组Runx2 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。在第4、12、16天,对比空白血清组,六味地黄丸含药血清组Runx2 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论健骨二仙丸、六味地黄丸、金匮肾气丸均可促进Runx2的表达,并促进衰老BMSCs往成骨方向分化。

淫羊藿苷通过上调Runx2促进踝关节骨折大鼠骨重建及抑制破骨细胞形成

【目的】观察淫羊藿苷对踝关节骨折大鼠的治疗作用及机制。【方法】取55只SD大鼠,建立踝关节骨折模型。将成功造模的全部50只大鼠随机分为模型组,淫羊藿苷低、中、高剂量组及阳性药组,每组10只。淫羊藿苷低、中、高剂量组分别给予腹腔注射淫羊藿苷30、60、120 mg/kg,阳性药组给予腹腔注射复方骨肽注射液0.4 mL/kg,模型组给予腹腔注射等体积生理盐水,每日1次,连续给药4周。给药结束后,进行Micro-CT活体扫描及生物力学测试,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法检测骨痂组织破骨细胞数量,苏木素-伊红(HE)染色法观察骨痂组织病理学变化,采用Western Blot法检测骨痂组织Runt相关转录因子2(Runx2)蛋白表达量。【结果】与模型组比较,淫羊藿苷低、中、高剂量组和阳性药组干预2、4周后骨小梁数量(Tb.N)、最大载荷、刚度、骨体积分数(BV/TV)值及骨痂组织Runx2蛋白表达量升高,骨痂组织破骨细胞数量减少(P<0.05),淫羊藿苷各剂量组作用效果呈剂量依赖性;但淫羊藿苷各剂量组干预2、4周后Tb.N、最大载荷、刚度、BV/TV值及骨痂组织Runx2蛋白表达量均低于同期阳性药组,骨痂组织破骨细胞数高于阳性药组(均P<0.05)。【结论】淫羊藿苷可促进踝关节骨折创伤大鼠骨重建,抑制破骨细胞形成,提高生物力学性能,其作用机制可能与上调Runx2蛋白表达有关;但其作用效果不及复方骨肽注射液。

Runx2基因参与骨代谢相关通路的研究进展

随着老龄化时代的到来,骨质疏松症成为人们研究的热点,而Runx2基因作为一种成骨分化特异性转录因子,参与多种信号通路调控成骨分化的过程。本文仅就Runx2基因参与转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)通路、Notch信号通路及Wnt信号通路的研究进展进行综述。

Runt相关基因2修饰的骨髓间充质干细胞促进兔下颌骨牵张成骨的研究

目的探讨Runt相关基因2(Runx2)修饰的自体骨髓间充质干细胞(MSCs)促进兔下颌牵张成骨新骨形成的可行性。方法将48只成年雄性新西兰大白兔随机分为3组:A组为Runx2重组质粒组,B组为不含Runx2重组质粒组,C组为生理盐水对照组。建立兔下颌牵张成骨模型;于牵张的第5天,A组兔牵张间隙内注射转染重组质粒adv-h Runx2-gfp的自体骨髓MSCs;B组注射转染adv-gfp质粒的自体骨髓MSCs;C组注射同体积生理盐水。在牵张结束后第8周处死所有动物,进行大体、影像学、组织学观察和三点弯曲测试。结果 CT平扫及组织学结果表明,A组牵张间隙内新骨形成和骨痂密度均明显高于B、C组;双能X线及三点弯曲测试表明,A组牵张间隙内新生骨组织密度、新生骨矿物质含量及最大载荷均高于B、C组(P<0.01)。结论基于MSCs的Runx2体外基因治疗可有效地促进牵张成骨新骨形成,从而缩短固定期,为临床颅颌面骨缺损的重建提供一个极具价值的修复策略。

葛根素对成骨细胞中miRNA-204的调控及其与Runx2基因表达的关系

目的研究葛根素作用于成骨细胞MC3T3-E1后miRNA表达的变化以及与Runx2基因表达的关系。方法 RT-PCR和western blot法检测Runx2的mRNA表达水平和蛋白表达水平;miRNA表达谱检测葛根素作用于成骨细胞后可能靶向Runx2的miRNA;Target Scan、Pic Tar等靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA;RT-PCR测定miRNA-204表达量;构建Runx23’UTR/突变型Runx2 3’UTR重组质粒、合成miRNA-204mimics和miRNA-204NC共转染MC3T3-E1细胞,双荧光素酶报告基因系统验证靶基因;miRNA-204mimics和miRNA-204inhibitor转染MC3T3-E1细胞,RT-PCR和western blot检测转染前后Runx2的mRNA表达量和蛋白表达量的变化。结果与空白组比较葛根素作用后Runx2的miRNA和蛋白表达均上升;miRNA-204表达水平下降;表达谱和靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA共同有miR-204、miR-3072-3p等;过表达miRNA-204后Runx2的蛋白表达水平下降,干扰miRNA-204表达后Runx2的蛋白水平上升。结论葛根素在成骨细胞中可通过调节靶向Runx2基因的miRNA-204来促进细胞增值分化。

miR-30a-5p通过靶向Runx2基因抑制成骨细胞分化

目的:构建绝经后骨质疏松大鼠模型,分析miR-30a-5p在成骨细胞分化中的功能。方法:将SD大鼠分为雌激素组、假手术组和模型组;取胫骨组织进行miRNA测序并差异表达分析;检测miR-30a-5p在各组大鼠骨中的表达含量;通过qRT-PCR检测miR-30a-5p表达对成骨分化标记相关蛋白胶原Ⅰ、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)表达的影响,同时检测对碱性磷酸酶(ALP)活性的影响;双萤光素酶报告基因检测miR-30a-5p对RUNT相关转录因子2(Runx2)的靶向调控作用。结果:miRNA测序分析结果显示,相对于假手术组、雌激素组,模型组有33种共同miRNA表达上调,选取miR-30a-5p作为本研究对象;qRT-PCR进一步验证miR-30a-5p在模型组骨组织中高表达;miR-30a-5p靶向抑制Runx2的表达,且能够抑制OCN、OPN和胶原Ⅰ的表达,降低ALP活性;而同时过表达Runx2后,OCN、OPN和胶原Ⅰ的表达升高,ALP活性增加,Runx2过表达部分缓解miR-30a-5p对成骨细胞分化的抑制作用。结论:miR-30a-5p在骨质疏松大鼠骨组织中表达上调,并能够靶向抑制Runx2的表达,从而抑制成骨细胞分化,促进骨质疏松进展,为骨质疏松症的诊断提供新的生物标志物。

Runx2基因转染对兔下颌骨牵张成骨的影响

目的 :探讨在兔下颌骨牵张成骨过程中,Runx2基因参与牵张过程对新骨再生的影响。方法 :选用32只新西兰白兔成功建立单侧下颌骨牵张成骨模型,随机分为实验组和对照组。牵张结束时,实验组牵张间隙内注入转染重组腺病毒(Ad5-Runx2),对照组牵张间隙内注入等体积无菌生理盐水。于牵张结束后4周末处死全部实验动物。利用组织学、影像学、双能X线(DXA)和生物力学分析等方法,对获取的下颌骨牵张标本进行检测分析。结果:三维CT重建、组织学及DXA结果证实,实验组牵张间隙内新骨生成、新骨密度和矿化含量均明显高于对照组;三点弯曲试验分析显示实验组牵张间隙最大载荷明显高于对照组。结论:Runx 2-in vivo基因治疗能够有效促进下颌牵张成骨过程中的新骨再生。

miR-889-3p靶向Runx2抑制脂肪间充质干细胞的成骨分化

背景:研究表明miR-889-3p可参与调控多种细胞的增殖分化过程,但是其对脂肪间充质干细胞成骨分化的影响尚不明确。目的:探讨miR-889-3p对脂肪间充质干细胞成骨分化的调节作用。方法:体外分离、培养SD大鼠脂肪间充质干细胞,转染miR-889-3p模拟物(miR-889-3p mimic)、miR-889-3p抑制剂(miR-889-3p inhibitor)和阴性对照(miR-NC)并诱导成骨分化。RT-PCR和Western blot检测成骨诱导14 d后的碱性磷酸酶活性、Runx2、骨钙素、骨桥素、Osterix等成骨相关mRNA和蛋白的表达。将野生型Runx2、突变型Runx2分别与miR-889-3p模拟物和miR-NC共转染脂肪间充质干细胞,通过双荧光素酶报告基因检测miR-889-3p与Runx2的靶向关系。结果与结论:①miR-889-3p表达水平随成骨诱导时间延长而逐渐减低;②成骨诱导第7天和第14天miR-889-3p inhibitor组的矿化结节数目、大小、颜色深浅明显超过miR-889-3p mimic组和miR-NC组(P<0.05);③miR-889-3p过表达后,碱性磷酸酶活性、Runx2、骨钙素、骨桥素、Osterix mRNA及蛋白表达量显著降低,而miR-889-3p敲除后成骨相关mRNA和蛋白表达量明显提高;④双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-889-3p过表达显著降低了野生型Runx2的荧光素酶活性;⑤上述结果表明,miR-889-3p通过靶向Runx2负向调控脂肪间充质干细胞成骨分化。

慢病毒介导沉默Smad2基因对人牙髓干细胞成骨向分化的作用

背景:人牙髓干细胞成骨分化的具体调控机制尚不明确,研究其具体机制对干细胞在组织工程中的应用有重要意义。目的:探究慢病毒介导沉默Smad2基因对人牙髓干细胞成骨分化的影响。方法:将培养的第3代人牙髓干细胞分为空白对照组、阴性对照组、Smad2-shRNA组和Smad2-shRNA+转化生长因子β3组。利用qRT-PCR技术检测成骨相关基因RUNX2、骨钙素、Smad2、Smad3及Smad4的mRNA表达,利用Western blot技术检测RUNX2、骨钙素、Smad2/Smad3、p-Smad2/Smad3及Smad4的蛋白表达,各组细胞培养第7,14天进行茜素红染色。结果与结论:①与阴性对照组及空白对照组比较,Smad2-shRNA组RUNX2、骨钙素、Smad2、Smad3和Smad4的mRNA表达量降低,差异有显著性意义(P<0.05);与Smad2-shRNA组比较,Smad2-shRNA+转化生长因子β3组的骨钙素、Smad2、Smad3及Smad4的mRNA表达量明显增高,差异有显著性意义(P<0.05);②与阴性对照组及空白对照组比较,Smad2-shRNA组RUNX2、骨钙素和Smad2/Smad3的蛋白表达量降低,差异有显著性意义(P<0.05);与Smad2-shRNA组比较,Smad2-shRNA+转化生长因子β3组的RUNX2、骨钙素、Smad2/Smad3和Smad4的蛋白表达量明显增高,差异有显著性意义(P<0.05);③使用常规培养基培养以及使用慢病毒载体转染不能诱导人牙髓干细胞的成骨分化,而转化生长因子β3能够正向调控人牙髓干细胞的成骨向分化;④结果表明,转化生长因子β/Smad2信号转导途径在人牙髓干细胞的成骨分化过程中发挥着重要作用。

过表达lncRNA HAGLR促胫骨骨折大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的机制研究

目的研究骨质疏松(OP)-胫骨骨折(TF)大鼠长链非编码RNA同源盒D基因簇反义生长相关长链非编码RNA(lncRNA HAGLR)与其下游靶基因的表达情况,并探讨lncRNA HAGLR对大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)成骨分化的作用与机制。方法30只SD雌性大鼠随机分为sham组、OP组、OP-TF组,每组10只。ELISA法检测大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的水平。对大鼠MSC细胞系R7500使用成骨分化诱导培养基进行诱导,并分为MSC组和成骨诱导组(Osteogenic-MSC组)。分别转染pcDNA-HAGLR、pcDNA-NC、miR-19a-3p的模拟物(miR-19a-3p mimic)、mimic的阴性对照(NC mimic)、miR-19a-3p的抑制剂(miR-19a-3p inhibitor)、miR-19a-3p inhibitor的阴性对照(NC inhibitor)至R7500后进行相应分组。双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA HAGLR和miR-19a-3p以及骨形态发生蛋白2(BMP2)和miR-19a-3p的靶向关系。qRT-PCR检测各组lncRNA HAGLR和miR-19a-3p的表达。Western blot检测BMP2、ALP、胶原蛋白I(COL-I)、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)的表达。ALP染色和AR染色检测MSC的成骨分化能力。结果OP组和OP-TF组的血清ALP和TRAP水平均高于sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。而OP组与sham组胫骨组织中lncRNA HAGLR、miR-19a-3p、BMP2的表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05),而OP-TF组胫骨组织中lncRNA HAGLR、BMP2的表达水平均明显低于sham组和OP组(P<0.05),OP-TF组胫骨组织中miR-19a-3p的表达水平高于sham组和OP组(P<0.05)。与MSC组相比,Osteogenic-MSC组的lncRNA HAGLR表达水平明显升高(P<0.05),而miR-19a-3p的表达降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验表明lncRNA HAGLR与miR-19a-3p具有靶向关系,miR-19a-3p与BMP2具有靶向关系。pcDNA-HAGLR组的miR-19a-3p的表达水平低于pcDNA-NC组(P<0.05)。miR-19a-3p mimic组与NC mimic组的lncRNA HAGLR的表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与NC mimic组相比,miR-19a-3p mimic组BMP2的表达水平降低(P<0.05),miR-19a-3p表达水平升高(P<0.05)。pcDNA-HAGLR组细胞较pcDNA-NC组具有更强的成骨分化能力和更高的ALP活性(P<0.05)。miR-19a-3p inhibitor组细胞较NC inhibitor组具有更强的成骨分化能力和更高的ALP活性(P<0.05)。结论胫骨骨折大鼠lncRNA HAGLR和BMP2表达降低,miR-19a-3p表达增高。过表达lncRNA HAGLR通过靶向调控miR-19a-3p/BMP2轴促进大鼠MSC的成骨分化。

miR-27b/PPARγ2轴对小鼠胚胎成骨前体细胞增殖和成骨细胞分化的意义

背景:先前的研究证实了miR-27b在脂质水平的作用,可以控制多个对血脂异常有重要影响的基因,推测miR-27b可能通过靶向PPARγ2在骨质疏松症中发挥作用。目的:探讨miR-27b/PPARγ轴在地塞米松诱导小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1细胞建立骨质疏松症细胞模型中的影响及相关作用机制。方法:体外地塞米松诱导MC3T3-E1细胞后,通过Lipofectamine^(■)2000转染miR-27b模拟物、miR-27b抑制剂、NC-模拟物、NC-抑制剂、siPPARγ2、siNC,使用二甲基亚砜处理作为对照。细胞诱导培养后,检测细胞活性、碱性磷酸酶活性以确定细胞成骨、分化水平;实时荧光定量PCR法和Western blot法检测成骨分化基因miR-27B、PPARγ2、Runx2、骨形态发生蛋白2和骨钙素的mRNA及蛋白表达水平;生信分析预测miR-27b下游靶基因,并用双荧光素酶基因报告实验验证。结果与结论:①地塞米松处理显著降低了MC3T3-E1细胞的活力和miR-27b表达水平;与二甲基亚砜相比,地塞米松处理在24和48 h显著抑制MC3T3-E1细胞的活力并显著下调了miR-27b的表达水平;②miR-27b可直接调控PPARγ2;与相应的NC相比,miR-27b模拟物显著上调了miR-27b的表达水平,而miR-27b抑制剂显著下调了miR-27b的表达水平;与相应的NC相比,PPARγ2 mRNA和相应蛋白质表达被miR-27b模拟物抑制,并被miR-27b抑制剂显著增强;③miR-27b过表达减弱了地塞米松抑制MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化;与二甲基亚砜+NC-mimic组相比,地塞米松显著抑制成骨细胞分化;而地塞米松介导的抑制作用则被miR-27b模拟物所逆转,细胞碱性磷酸酶活性和骨形态发生蛋白2、Runx2和骨钙素蛋白表达水平部分恢复;④抑制miR-27b通过上调PPARγ2抑制MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化;miR-27b的敲除明显增加了PPARγ2的表达,并降低了细胞活力、成骨细胞分化、碱性磷酸酶活性以及骨形态发生蛋白2、Runx2和骨钙素的表达水平;PPARγ2可能是miR-27b的直接作用靶点。

炎症微环境下miR-30a调控Runx相关转录因子2对人牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的:探究炎症微环境下微小RNA-30a(miR-30a)调控Runt相关转录因子2(Runx2)对人牙周膜干细胞成骨分化的影响。方法:体外培养人牙周膜干细胞(hPDLSCs),随机分为对照组、模型组、miR-30a mimics(模拟物)组、miR-30a mimics阴性对照组、miR-30a inhibitor(抑制剂)组、miR-30a inhibitor阴性对照组,除对照组外,其余各组以脂多糖诱导细胞炎症微环境,构建体外炎症模型,然后分组处理并诱导其成骨分化,采用碱性磷酸酶(ALP)及茜素红染色检测各组细胞成骨分化情况;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞miR-30a、成骨相关基因Runx2 mRNA表达水平;采用蛋白免疫印迹实验检测各组细胞Runx2、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)蛋白表达情况。结果:与对照组相比,模型组细胞miR-30a表达、细胞上清液中TNF-α及IL-6水平均升高(均P<0.05),Runx2 mRNA表达水平、ALP阳性细胞相对比例、矿化结节相对比例、Runx2、OPN及OCN蛋白表达水平均降低(均P<0.05)。与模型组相比,miR-30a mimics组细胞miR-30a表达、细胞上清液中TNF-α及IL-6水平均升高(均P<0.05),Runx2 mRNA表达水平、ALP阳性细胞相对比例、矿化结节相对比例、Runx2、OPN及OCN蛋白表达水平均降低(均P<0.05);miR-30a inhibitor组细胞miR-30a表达、细胞上清液中TNF-α及IL-6水平均降低(均P<0.05),Runx2 mRNA表达水平、ALP阳性细胞相对比例、矿化结节相对比例、Runx2、OPN及OCN蛋白表达水平均升高(均P<0.05);miR-30a mimics阴性对照组、miR-30a inhibitor阴性对照组细胞各指标无明显变化(均P>0.05)。结论:炎症微环境下hPDLSCs中miR-30a高表达,可下调Runx2表达,促进炎症进展,进而抑制hPDLSCs成骨分化。

构建靶向Runx2基因成骨样细胞MC3T3-E1慢病毒载体

背景:研究表明成骨细胞特异性转录因子(Runx2)的杂合突变、基因插入、缺失等是造成颅骨锁骨发育不全的重要原因。目前关于Runx2基因沉默后成骨细胞功能会发生怎样的变化,及如何沉默成骨细胞Runx2基因表达的相关研究未见报道。目的:构建靶向Runx2基因的小鼠成骨样细胞MC3T3-E1慢病毒载体,为颅骨锁骨发育不全的研究提供实验依据。方法:根据预实验结果在含5 mg/L Polybrene的ENi.S培养液中,病毒按MOI=40进行感染,按病毒序号分为4组:NC组:pFU-GW-016PSC53349-1;KD1组:LVpFU-GW-016PSC60107-1;KD2组:LVpFU-GW-016PSC60108-1;KD3组:LVpFU-GW-016PSC60109-1。转染后16 h换液,72 h后,Celigo全视野细胞扫描分析仪观察检测基因的表达情况;两步法进行Real-Time PCR检测Runx2基因的沉默效果。结果与结论:(1)病毒转染后72 h,NC组未见荧光表达;KD1组可见少量荧光表达;KD2组荧光表达增强;KD3组可见强绿色荧光;(2)Real-Time PCR结果提示KD3组获得较好Runx2基因沉默效果;(3)实验成功构建靶向Runx2基因的MC3T3-E1细胞慢病毒载体,筛选出特异性抑制成骨细胞Runx2基因的病毒,并初步确定其作用的时间、相应的计量。

补肾活血汤水提物调控Cbfal/RUNX2基因沉默骨髓间充质干细胞SP7/Osterix及碱性磷酸酶的表达

背景:补肾活血汤可以促进骨髓间充质干细胞成骨分化,探究分子机制利于推向临床。目的:探讨补肾活血汤水提物对Cbfal/RUNX2基因沉默的骨髓间充质干细胞Osterix、碱性磷酸酶表达的影响。方法:骨髓贴壁筛选法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞,Cbfal/RUNX2基因沉默慢病毒转染骨髓间充质干细胞。取第3代骨髓间充质干细胞(空白对照组)、慢病毒沉默骨髓间充质干细胞(沉默组)和阴性病毒载体预处理骨髓间充质干细胞(阴性对照组),以及上述3组骨髓间充质干细胞加入100 mg/L补肾活血汤水提物干预3 d后,检测RUNX2、Osterix蛋白和mRNA表达以及碱性磷酸酶活性。结果与结论:(1)Cbfal/RUNX2基因沉默慢病毒转染效率达约90%;(2)与空白对照组和阴性对照组比较,沉默组骨髓间充质干细胞RUNX2和Osterix的蛋白及mRNA表达均下降,碱性磷酸酶活性也明显下降,差异有显著性意义(P<0.01);(3)补肾活血汤水提物干预后,沉默组骨髓间充质干细胞RUNX2、Osterix的表达和碱性磷酸酶活性明显增加,差异有显著性意义(P<0.01);(4)结果表明,补肾活血汤水提物可以促进骨髓间充质干细胞的RUNX2、Osterix表达,亦增加了碱性磷酸酶活性,从而促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

尿酸对人骨髓间充质干细胞成骨分化中Cbfα1/Runx2表达的影响

目的观察不同浓度尿酸对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化过程中核心结合因子α1(Cbfα1/Runx2)表达变化的影响。方法以体外培养的健康成年hBMSCs为研究对象,分为5个组,分别为对照组(完全培养基组)和加入不同浓度尿酸(0 mmol/l、0.2 mmol/l、0.4 mmol/l、0.8mmol/l)的成骨诱导组,通过倒置显微镜观察细胞形态,碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定细胞。在干预诱导第7天和第14天行RT-PCR检测Cbfα1/Runx2的表达。结果碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果均阳性,表示诱导后细胞为成骨细胞。RT-PCR结果表明,对照组各时间点均无Cbfα1/Runx2表达,尿酸培养组随尿酸浓度增加和时间的延长,Cbfα1/Runx2表达逐渐增强,呈现时间依赖性和浓度依赖性。结论尿酸可能通过促进Cbfα1/Runx2的表达,从而促进hBMSCs向成骨细胞分化。

Runx2、Osterix转录因子过表达驱动内皮细胞成骨分化的机制探讨

目的:探讨Runx2和Osterix(OSX)过表达对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)成骨分化的调控作用。方法:通过慢病毒载体,将Runx2和Osterix基因分别转染入HUVECs。通过碱性磷酸酶(ALP)染色、半定量活性检测,探讨过表达Runx2和Osterix对HUVECs成骨分化的影响。通过RT-PCR、蛋白免疫印迹、免疫荧光染色检测成骨相关标志物Runx2、OSX、ALP、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)在HUVECs中的表达。采用Graph Pad Prism 6.01软件包对数据进行统计学分析。结果:Runx2过表达有利于HUVECs的成骨分化,而Osterix过表达则无此作用。HUVECs转染Runx2过表达慢病毒后,成骨相关基因Runx2、OSX、ALP、BSP、OPN及OCN的转录水平上调,同时Runx2、OSX、OPN及OCN的蛋白表达水平亦有所上调。结论:Runx2过表达可促进HUVECs的成骨分化。