Caveolin-1介导流体剪切应力调控MC3T3-E1成骨细胞增殖和凋亡

背景:流体剪切应力在成骨细胞增殖和凋亡中起着重要作用。然而,Caveolin-1(Cav-1)是否参与成骨细胞中流体剪切应力诱导的增殖与凋亡过程尚不清楚。目的:探讨Cav-1在流体剪切应力调控成骨细胞增殖和凋亡中的作用。方法:选择生长状态良好的MC3T3-E1成骨细胞,加载不同时间(0,30,60,90 min)且强度为1.2 Pa的流体剪切应力,观察Cav-1蛋白的表达,筛选出时间为60 min的条件进行实验。将MC3T3-E1细胞分为:对照组、流体剪切应力组、流体剪切应力+pcDNA 3.1组(对照)、流体剪切应力+pcDNA Cav-1组(过表达质粒),分别采用流体剪切应力和过表达Cav-1等方式干预,通过q RT-PCR和Western blot检测MC3T3-E1细胞内增殖以及凋亡相关分子的表达量;通过CCK-8与Ed U实验检测MC3T3-E1细胞增殖活性;采用Hoechst 33258染色以及流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡情况。结果与结论:加载流体剪切应力后MC3T3-E1细胞中Cav-1的表达显著下调,且加载60 min表达水平最低。过表达Cav-1减弱了流体剪切应力促进MC3T3-E1细胞增殖及抑制细胞凋亡的效应。说明Cav-1在流体剪切应力调节成骨细胞增殖和凋亡过程中具有重要的作用,并可能为骨质疏松症提供潜在治疗策略。

流体剪切力通过激活Piezo 1蛋白促进肾小球内皮细胞凋亡

目的探讨流体剪切力(FS)对肾小球内皮细胞(GECs)凋亡的影响及Piezo 1蛋白在其中的作用。方法对SD大鼠肾小球内皮细胞进行培养,使用Flexcell-T5000拉力仪模拟流体剪切力刺激,使用流式细胞测量技术检测细胞凋亡水平,通过免疫荧光染色试验检测Piezo 1蛋白在GECs中的表达水平。使用Ca 2+指示剂(Cal-590 AM)观察流体剪切力对Piezo 1通道的激活作用。使用化学激动剂Yoda1、抑制剂GsMtx 4及慢病毒Lv-shPiezo 1调控Piezo 1蛋白功能或表达后,观察Piezo 1对GECs凋亡的影响。结果与对照组相比,剪切力组细胞凋亡率增高(P<0.05),且随着流体剪切力强度升高,细胞凋亡率增高;Piezo 1在GECs中普遍表达,且流体剪切力可以激活Piezo 1通道并增强其表达;激动剂Yoda 1可以促进GECs的凋亡,抑制剂GsMtx 4可以抑制流体剪切力诱导的凋亡;Lv-shPiezo 1敲低GECs中Piezo 1的表达,且敲低组GECs的凋亡率较对照组及Lv-Ctrl组降低(P<0.05)。结论流体剪切力通过激活Piezo 1蛋白及增强其表达促进GECs的凋亡。

胡黄连苷Ⅱ调节RIP1/RIP3/MLKL信号对地塞米松诱导成骨细胞凋亡的影响

目的探讨胡黄连苷Ⅱ调节受体相互作用蛋白激酶(RIP)1/RIP3/混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)信号对地塞米松(DEX)诱导成骨细胞凋亡的影响。方法体外培养hFOB 1.19细胞,随机分为对照组、DEX组、DEX+胡黄连苷Ⅱ组、DEX+RIP1过表达组、DEX+空载质粒组、DEX+胡黄连苷Ⅱ+RIP1过表达组,分组处理后检测各组细胞活力、凋亡率、活性氧(ROS)相对水平、乳酸脱氢酶(LDH)、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及IL-6释放量、BCL-2及BAX相对表达、RIP1/RIP3/MLKL信号蛋白表达。结果与对照组相比,DEX组细胞活力、BCL-2相对表达降低(P<0.05),凋亡率、ROS相对水平、LDH及IL-1β、TNF-α、IL-6释放量、细胞BAX及RIP1、RIP3、MLKL蛋白相对表达升高(P<0.05)。与DEX组相比,DEX+胡黄连苷Ⅱ组细胞活力、BCL-2相对表达升高(P<0.05),凋亡率、ROS相对水平、LDH及IL-1β、TNF-α、IL-6释放量、细胞BAX及RIP1、RIP3、MLKL蛋白相对表达降低(P<0.05);DEX+RIP1过表达组细胞活力、BCL-2相对表达降低(P<0.05),凋亡率、ROS相对水平、LDH及IL-1β、TNF-α、IL-6释放量、细胞BAX及RIP1、RIP3、MLKL蛋白相对表达升高(P<0.05);DEX+空载质粒组细胞各指标差异无统计学意义(P>0.05);过表达RIP1可减弱胡黄连苷Ⅱ对DEX诱导的hFOB 1.19细胞的作用。结论胡黄连苷Ⅱ可通过下调RIP1/RIP3/MLKL通路而减轻炎症,从而抑制DEX诱导的成骨细胞凋亡。

岩藻黄质活化核因子E2相关因子2改善糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡

背景:骨质疏松症发病率高,易导致骨折等并发症的发生,而现有药物干预不良反应大,难以满足临床需求。目的:探索岩藻黄质对糖皮质激素诱导成骨细胞骨质疏松症模型的作用与潜在机制。方法:将原代大鼠成骨细胞接种于6孔板内,待细胞融合度达到80%后分4组干预:对照组单纯培养24 h,糖皮质激素组使用地塞米松干预24 h,岩藻黄质组使用岩藻黄质干预24 h,糖皮质激素+岩藻黄质组使用地塞米松与岩藻黄质同时干预24 h。干预结束后,检测细胞增殖、凋亡、细胞内活性氧含量以及凋亡相关蛋白、骨形成相关蛋白、细胞核核因子E2相关因子2的蛋白表达。结果与结论:①CCK-8检测显示,与对照组比较,糖皮质激素组细胞活性降低(P<0.05);与糖皮质激素组比较,糖皮质激素+岩藻黄质组细胞活性升高(P<0.05);②JC-1线粒体膜电位染色与流式细胞学检测显示,与对照组比较,糖皮质激素组细胞凋亡比例增加(P<0.05);与糖皮质激素组比较,糖皮质激素+岩藻黄质组细胞凋亡比例减少(P<0.05);③Western Blot检测显示,与对照组比较,糖皮质激素组BAX、裂解聚ADP核糖聚合酶的蛋白表达升高(P<0.05),BCL2、Ⅰ型胶原蛋白α1肽链、碱性磷酸酶、骨钙蛋白、RUNX2的蛋白表达降低(P<0.05);与糖皮质激素组比较,糖皮质激素+岩藻黄质组BAX、裂解聚ADP核糖聚合酶的蛋白表达降低(P<0.05),BCL2、Ⅰ型胶原蛋白α1肽链、碱性磷酸酶、骨钙蛋白、RUNX2的蛋白表达升高(P<0.05);④荧光探针检测显示,与对照组比较,糖皮质激素组活性氧含量增加(P<0.05);与糖皮质激素组比较,糖皮质激素+岩藻黄质组活性氧含量减少(P<0.05);⑤免疫荧光染色与Western Blot检测显示,与对照组比较,糖皮质激素组细胞核核因子E2相关因子2的蛋白表达降低(P<0.05);与糖皮质激素组比较,糖皮质激素+岩藻黄质组细胞核核因子E2相关因子2的蛋白表达升高(P<0.05);⑥结果表明,岩藻黄质通过活化核因子E2相关因子2改善糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡与骨形成相关分子表达。

流体剪切力影响成骨细胞生物学功能及分化机制的研究

目的探讨流体剪切力(FSS)作用下成骨细胞生物学功能及分化机制。方法4组大鼠成骨细胞分别施加0、30、60和120 min FSS(12 dyn/cm2)刺激,免疫荧光染色后观察FSS刺激成骨细胞不同时间后的细胞骨架变化,采用Image J软件计算细胞分形维数,比较细胞内部复杂程度;使用Ca2+试剂盒检测钙响应,碱性磷酸酶(ALP)测试盒检测ALP活性;Real-time PCR检测FSS刺激不同时间后成骨细胞的BMP2、Runx2、Osterix(Osx)基因表达;Western blot检测FSS刺激不同时间后成骨细胞的BMP2、Runx2、Osx蛋白表达水平,采用Quantity one进行光密度分析。结果12dyn/cm^(2) FSS刺激成骨细胞可引起细胞骨架形态、微丝丰富度及细胞复杂程度的变化,以60 min最明显。与0 min组相比,细胞Ca^(2+)浓度在FSS刺激30 min后明显升高,延续至60 min为高峰平台期(P<0.05),120 min后Ca2+浓度回落;60 min组的BMP2、Runx2、Osx基因和蛋白表达水平均明显上调(P<0.01);ALP活性升高,在刺激60 min时最为明显(P<0.05)。结论12 dyn/cm2 FSS刺激能改善成骨细胞生物学功能,促进BMP2、Runx2、Osx基因及其蛋白表达上调;能通过改变成骨细胞骨架促进Ca2+浓度升高,进而激活与分化高度相关的BMP2-Runx2-Osx信号通路,提高成骨细胞分化标志物ALP活性。

藤黄健骨胶囊通过SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路抑制绝经后骨质疏松大鼠成骨细胞凋亡

藤黄健骨胶囊可以提高绝经后骨质疏松模型鼠的骨密度来改善其骨微结构损害,但具体机制尚未阐明。本文主要研究藤黄健骨胶囊抑制绝经后骨质疏松症大鼠成骨细胞凋亡与SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路的关系,旨在探讨藤黄健骨胶囊对绝经后骨质疏松症的作用机制。采用去卵巢法建立绝经后骨质疏松大鼠模型,分别给予藤黄健骨胶囊(0.09、0.18、0.36 g/kg)灌胃,连续干预8周后进行指标检测。采用TUNEL染色观察股骨组织凋亡情况,结果发现,藤黄健骨胶囊各剂量组股骨组织凋亡阳性细胞和凋亡率均减少(P<0.01)。采用双重免疫荧光染色观察股骨组织成骨细胞中SIRT1、PGC-1α和Nrf2表达水平表达情况,结果发现,藤黄健骨胶囊中、高剂量组成骨细胞PGC-1α表达荧光面积明显升高,各剂量组成骨细胞SIRT1和Nrf2表达荧光面积也明显升高(P<0.01)。qPCR和Western印迹检测股骨组织SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Runx2、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表达水平和翻译水平变化,结果显示,藤黄健骨胶囊中、高剂量组股骨组织Runx2 mRNA水平和蛋白质水平、Nrf2蛋白质水平均明显升高,Caspase-9蛋白质水平明显下降,各剂量组股骨组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2 mRNA水平和蛋白质水平、Nrf2 mRNA水平也均明显升高,而其各剂量组股骨组织Caspase-3mRNA水平、蛋白质水平和Caspase-9 mRNA水平均则明显降低(P<0.01)。综上,本研究初步揭示了藤黄健骨胶囊对绝经后骨质疏松模型鼠成骨细胞凋亡的抑制与SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路有关,SIRT1可能是调控成骨细胞凋亡的重要靶点。

CaMKⅡ参与调控成骨细胞分化和凋亡的研究进展

成骨细胞分化和凋亡在维持骨稳态中起着至关重要的作用,异常的成骨细胞分化或凋亡会导致多种骨代谢疾病。钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是一类广泛存在于体内的多功能蛋白激酶家族,它通过将细胞内的Ca^(2+)信号转化为多种生理或病理的细胞反应,在成骨细胞的分化和凋亡调控中发挥着重要作用。CaMKⅡ对成骨细胞分化的影响主要通过3个信号通路实现:(1)通过1α-25(OH)_(2)D_(3)膜介导信号通路调节成骨细胞的分化;(2)参与WNT/Ca^(2+)信号通路;(3)通过RUNX2-OSX信号通路影响成骨细胞分化。这些信号通路共同作用于成骨细胞,促进其成熟和功能发挥。CaMKⅡ在成骨细胞凋亡中的作用则涉及调节内质网应激反应和调控Bax/Bcl-2表达比例。这些机制对于成骨细胞的存活和凋亡至关重要,影响骨组织的稳定性和重建。总体而言,CaMKⅡ作为一个多功能信号分子,在成骨细胞分化和凋亡的调控中扮演重要角色。对CaMKⅡ的进一步研究,特别是在骨代谢疾病治疗中的应用,是未来研究的一个重要方向。

Beclin 1基因突变对成骨细胞自噬-凋亡表达的影响

目的观察Beclin 1野生型、突变型质粒对成骨细胞自噬-凋亡表达的影响。方法采用原代分离培养的大鼠颅骨成骨细胞,构建Beclin 1突变型质粒转染成骨细胞(MUT)和野生型质粒转染成骨细胞(WT),使用自噬激活剂rapamycin(Rapa)、自噬抑制剂Baf-A1(Baf)和Beclin1/Bcl2结合抑制剂mifepristone(Mif)干预细胞,分为NC组、Beclin1 WT组、Beclin1 WT+Baf-A1组、Beclin1 WT+mif组、Beclin1 Mut组、Beclin1 Mut+Rapa组。使用免疫共沉淀检测Beclin1-Bcl2复合物结合水平,通过MDC染色、溶酶体染色、流式检测、线粒体膜电位检测、Hoechest染色、免疫荧光、WB分别检测成骨细胞的自噬和凋亡表达情况。结果免疫共沉淀检测:与NC组相比,MUT组中Beclin1-Bcl2复合物水平显著降低(P<0.05);MDC染色显示:相对于NC组,WT细胞中溶酶体染色明显增加;细胞凋亡方面:与NC组相比,WT组、WT+Mif组细胞凋亡率显著上升,MUT细胞凋亡率低于WT细胞,比较差异具有统计学意义;JC-1检测显示:与NC组相比,WT细胞的线粒体跨膜电位异常改变,而MUT细胞样本的跨膜电位表达活跃。结论①Beclin 1的过表达可以抑制Beclin 1-Bcl2复合物的生成;②Beclin 1是参与自噬的重要基因,适度的Bcilin 1表达有利于维持细胞群的代谢平衡,Beclin 1的过表达对细胞自噬无明显影响;③Beclin 1过表达能抑制成骨细胞凋亡。

冬凌草甲素调节Hippo/YAP信号通路对骨质疏松大鼠成骨细胞凋亡的影响

目的:探讨冬凌草甲素(Ori)调节Hippo/Yes相关蛋白(YAP)信号通路对骨质疏松(OP)大鼠成骨细胞凋亡的影响。方法:随机选取10只大鼠为假手术组仅分离但不切除卵巢,其余大鼠通过切除双侧卵巢建立OP模型,将造模成功的大鼠随机分为OP组、不同剂量Ori(5mg/kg Ori、10mg/kg Ori、20mg/kg Ori)组、20mg/kg Ori+Hippo/YAP激活剂-Verteporfin(10mg/kg)组。干预后,收集腹主动脉血液,ELISA检测血清中骨钙素(BGP)、碱性磷酸酶(ALP)水平;分离股骨组织,双能X射线骨密度仪检测股骨矿含量、骨密度;HE检测股骨组织形态学变化;TUNEL检测成骨细胞凋亡变化;Western blot检测YAP、转录共激活因子PDZ结合基序(TAZ)蛋白表达。结果:假手术组大鼠股骨结构变化不明显,与假手术组相比,OP组股骨组织形态发生明显改变,BGP、ALP水平、股骨组织矿含量、骨密度、YAP、TAZ蛋白表达显著降低(P<0.05),成骨细胞凋亡率显著增加(P<0.05);与OP组相比,5mg/kg Ori组、10mg/kg Ori组、20mg/kg Ori组股骨组织形态得到改善,BGP、ALP水平、股骨组织矿含量、骨密度、YAP、TAZ蛋白表达显著增加(P<0.05),成骨细胞凋亡率显著降低(P<0.05),不同剂量Ori间具有统计差异(P<0.05);与20mg/kg Ori组相比,20mg/kg Ori+Verteporfin组股骨组织形态变化加重,BGP、ALP水平、股骨组织矿含量、骨密度、YAP、TAZ蛋白表达显著降低(P<0.05),成骨细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。结论:Ori调节Hippo/YAP信号通路减少OP大鼠成骨细胞凋亡,减轻OP大鼠症状。

流体剪切力对成骨细胞凋亡及bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的影响

目的:探讨流体剪切力对成骨细胞凋亡及相关蛋白bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。方法:对培养的第3代新生大鼠成骨细胞分别加载0(对照组)、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0Pa流体剪切力1h后,静止培养24h。应用TUNEL法检测凋亡,采用免疫组化法检测bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白。采用SPSS11.5软件包对数据进行单因素方差分析。结果:在0、0.6、1.0、2.0Pa组,细胞凋亡及bcl-2、Caspase-3表达量无显著差异,P>0.05。3.0、4.0、5.0Pa组间,随剪切力增大,细胞凋亡增加,Bcl-2表达量减少,Caspase-3增加,P<0.05。所有实验组间Bax无显著差异,P>0.05。结论:生理范围的流体剪切力对成骨细胞凋亡无影响,而过大力值导致bcl-2表达减少,进而活化caspase-3,成骨细胞凋亡增加。

成骨细胞程序性死亡的研究进展

成骨细胞是促进骨骼生成并维持骨强度的主要细胞类型,其功能异常可以直接导致骨强度下降。程序性死亡是细胞代谢的终末事件之一,目前共有五种常见的细胞程序性死亡:凋亡、自噬、铁死亡、焦亡和坏死性凋亡,它们彼此间既协作又拮抗,在细胞代谢的不同阶段响应不同刺激发挥影响,是细胞正常行使职能的前提。成骨细胞的程序性死亡对骨生成及骨稳态的维持至关重要,因此调节成骨细胞的程序性死亡有望对骨质疏松起到直接治疗作用。本文拟对骨质疏松中成骨细胞程序性死亡的作用及串扰关联进行综述,以期为调控成骨细胞死亡从而缓解骨质疏松的研究提供新的思路与参考。

miR-199a-3p通过靶向CABLES-1调控流体剪切力介导的成骨细胞增殖

目的探讨miR-199a-3p在流体剪切力(fluid shear stress,FSS)诱导成骨细胞增殖中的作用及其可能的分子机制。方法对成骨细胞MC3T3-E1加载1.2 Pa FSS,时间分别为0、15、30、45、60、75、90 min。使用miR-199a-3p模拟物或miR-199a-3p抑制物转染MC3T3-E1细胞。使用将过表达的miR-199a-3p以及其阴性对照分别转染MC3T3-E1细胞,并以1.2 Pa FSS处理45 min。将pcDNA NC、pcDNA-CABLES-1、si RNA NC、si RNA CABLES-1转染至MC3T3-E1细胞中。分别共转染pc DNA-CABLES-1与miR-199a-3p mimic以及si RNA-CABLES-1与miR-199a-3p inhibitor。CCK-8实验检测细胞活性;RT-qPCR检测CABLES-1、miR-199a-3p、CDK 6、Cyclin D1、PCNA表达水平;荧光素酶报告实验检测CABLES-1和miR-199a-3p的靶向关系。免疫荧光检测CABLES-1蛋白表达。Western blot检测CABLES-1、CDK 6、PCNA、Cyclin D1的蛋白表达。结果FSS作用下MC3T3-E1细胞中的miR-199a-3p出现显著下调。过表达的miR-199a-3p抑制成骨细胞增殖,下调miR-199a-3p表达促进成骨细胞增殖。miR-199a-3p可以逆转FSS诱导的成骨细胞增殖。双荧光素酶实验表明,miR-199a-3p靶向作用于CABLES-1,过表达的miR-199a-3p可抑制CBALES-1蛋白表达。CABLES-1能够促进成骨细胞增殖。miR-199a-3p通过CABLES-1抑制FSS诱导的成骨细胞增殖。结论FSS诱导的成骨细胞增殖通过下调miR-199a-3p并通过靶向作用于CABLES-1实现。研究结果为FSS诱导成骨细胞增殖机制的研究提供新方向,也为未来机械刺激在骨关节疾病治疗中的临床应用研究提供新思路。

流体剪切力通过下调p21促进MC3T3-E1成骨细胞增殖

目的探讨流体剪切力(fluid shear stress,FSS)对成骨细胞p21表达的影响,并明确p21在FSS诱导的成骨细胞增殖过程中的作用。方法对成骨细胞加载不同时间(0、15、30、45、60 min)、1.2 Pa FSS。用CCK-8实验、EdU实验检测成骨细胞增殖活性。用siRNA p21或pcDNA p21转染成骨细胞,并用Western blotting检测转染效果。Western blotting检测不同干预条件下p21、cyclin D1、CDK4的表达变化。结果加载1.2 Pa FSS后,p21表达显著下调,且加载45 min后表达水平最低。加载FSS和下调p21表达都显著增强成骨细胞增殖,并增加cyclin D1、CDK4表达。而上调p21表达后,加载FSS不再具有增强成骨细胞增殖和增加cyclin D1、CDK4表达的作用。结论1.2 Pa FSS能够下调成骨细胞p21表达,在加载45 min时下调最为明显。p21下调对成骨细胞增殖具有促进作用,且FSS通过下调p21促进成骨细胞增殖。

流体剪切力抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡机制

流体剪切力(FSS)在骨生理和骨组织重建中起着十分重要的作用。现阶段FSS抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的成骨细胞凋亡机制研究主要集中在FSS诱导成骨细胞PI3K激活、诱导成骨细胞caspase-3抑制和刺激成骨细胞产生一氧化氮方面,三条抑制凋亡途径既相互独立又相互联系,构成了复杂的网络机制。回顾分析FSS抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡机制,有利于了解FSS对成骨细胞生物活性的影响,揭示骨愈合的相关分子机制。

成骨细胞调节性细胞死亡在牙周病中的作用研究进展

牙周病是以牙槽骨渐进性破坏为特征的慢性炎症性疾病。牙槽骨破坏最关键的机制是骨稳态失衡,而成骨细胞介导的骨基质合成在骨稳态调节中发挥重要作用。在炎性微环境和骨稳态调控中调节性细胞死亡举足轻重。慢性炎症、氧化应激等因素可直接参与线粒体、死亡受体介导的信号通路,调节B细胞淋巴瘤蛋白2家族和胱天蛋白酶(caspase)的活性,调节成骨细胞凋亡,从而影响牙槽骨稳态;慢性炎症与细胞损伤可经由RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路诱发成骨细胞坏死性凋亡,从而加剧炎症反应并加速牙槽骨破坏;病原微生物、细胞损伤等刺激可通过caspase-1依赖或非依赖性信号通路及GSDMD家族蛋白活化,促进成骨细胞焦亡,并释放促炎性细胞因子,介导牙槽骨破坏;牙周病中铁过载和脂质过氧化可诱发成骨细胞铁死亡,影响成骨细胞的存活和功能,从而导致骨稳态失衡。本文围绕牙周病通过调节性细胞死亡影响骨稳态的机制,以期探讨调控牙周病患者牙槽骨稳态失衡的对策。

连翘苷调节相关信号通路对地塞米松诱导的成骨细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨连翘苷(phillyrin, PHN)调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对地塞米松(dexamethasone, DEX)诱导的成骨细胞自噬和凋亡的影响。方法 将MC3T3-E1细胞分为对照组(NOR组)、DEX组(10μmol/L DEX处理MC3T3-E1细胞)、L-PHN组(5μmol/L PHN处理MC3T3-E1细胞)、M-PHN组(10μmol/L PHN处理MC3T3-E1细胞)、H-PHN组(20μmol/L PHN处理MC3T3-E1细胞)、ZSTK474组(用20μmol/L PHN和2μmol/L的PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂ZSTK474处理MC3T3-E1细胞);MTT法检测细胞毒性和细胞活力;流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡;透射电子显微镜(TEM)观察自噬小体;Western blot法检测MC3T3-E1细胞中自噬、凋亡和PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达;ALP活性及ALP染色检测MC3T3-E1细胞分化能力。结果 0~80μmol/L PHN对MC3T3-E1细胞无明显毒性影响。与NOR组相比,DEX组OD570值、Bcl-2蛋白水平、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR蛋白水平、ALP活性、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平以及自噬小体数目显著降低(P<0.05),凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3显著升高(P<0.05),与DEX组相比,L-PHN组、M-PHN组、H-PHN组凋亡水平显著降低(P<0.05),增殖活性、自噬水平、成骨分化能力、通路蛋白水平显著升高(P<0.05);而ZSTK474消除了PHN对MC3T3-E1细胞的有利作用。结论 PHN可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进成骨细胞自噬,进而抑制其凋亡。

BMP9通过P38 MAPK信号通路对成骨细胞自噬和凋亡的作用研究

目的研究BMP9对P38 MAPK信号通路的调控作用以及对成骨细胞自噬和凋亡的影响。方法体外培养小鼠MC3T3-E1成骨细胞系,用雷帕霉素(rapamycin)诱导细胞发生自噬,Western印迹检测BMP9、P38、p-P38的蛋白表达。再将细胞随机分组后进行相应处理,分别为pcDNA3.1-BMP9组(pcDNA3.1-BMP9)、BMP9 siRNA组(BMP9 siRNA)、P38激活组(茴香霉素,10μmol/L)、P38抑制组(SB-202190,10μmol/L)、pcDNA3.1-BMP9+P38抑制组(pcDNA3.1-BMP9+SB-202190,10μmol/L)、BMP9 siRNA+P38激活组(BMP9 siRNA+茴香霉素,10μmol/L)以及对照组。Western印迹检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62的表达,CCK-8和流式细胞技术检测细胞的增殖和凋亡情况。结果雷帕霉素处理后的MC3T3-E1细胞中LC3-Ⅱ、Beclin-1、BMP9和p-P38蛋白升高(P<0.05),P62蛋白降低(P<0.05)。pcDNA3.1-BMP9组、P38激活组LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白升高(P<0.05),P62蛋白降低(P<0.05);BMP9 siRNA组、P38抑制组LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白降低(P<0.05),P62蛋白升高(P<0.05)。pcDNA3.1-BMP9+P38抑制组和BMP9 siRNA+P38激活组LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62蛋白水平与对照组均无差异(P均>0.05)。pcDNA3.1-BMP9组细胞增殖率升高、凋亡率降低(P均<0.05);BMP9 siRNA细胞增殖率降低,凋亡率升高(P均<0.05)。P38激活组细胞增殖率升高,凋亡率降低(P均<0.05);P38抑制组细胞增殖率降低,凋亡率升高(P均<0.05)。pcDNA3.1-BMP9+P38抑制组和BMP9 siRNA+P38激活组细胞增殖率、凋亡率与对照组均无差异(P均>0.05)。结论BMP9能激活P38 MAPK通路,诱导成骨细胞自噬,减少细胞凋亡。

大豆皂苷Bb对牙槽骨成骨细胞增殖、凋亡及MEK/ERK通路的影响

目的探讨大豆皂苷Bb经丝裂原细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶(MEK/ERK)信号通路对牙槽骨成骨细胞增殖、凋亡的影响。方法培养人牙槽骨成骨细胞,Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)培养的细胞作为对照组(A组),以含400μg/mL雌二醇、400μg/mL和800μg/mL大豆皂苷Bb的DMEM培养的细胞分别作为雌二醇组(B组),大豆皂苷Bb低、高剂量组(C_(1)组和C2组)。采用MTT法测定细胞活力和计数细胞菌落数,采用流式细胞术测定细胞凋亡水平,采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法及蛋白印迹法测定细胞中MEK,ERK mRNA和蛋白表达水平。结果与A组比较,B组、C_(1)组、C2组光密度(OD)、细胞存活率、菌落数、MEK及ERK mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),且呈剂量依赖性;与B组比较,C_(1)组上述指标均明显降低(P<0.05),而C2组无明显差异(P>0.05)。与A组比较,B组、C_(1)组、C2组细胞凋亡率均明显降低(P<0.05),且呈剂量依赖性;与B组比较,C_(1)组细胞凋亡率明显升高(P<0.05),C2组细胞凋亡率无明显差异(P>0.05)。结论大豆皂苷Bb能促进牙槽骨成骨细胞增殖,抑制凋亡。其作用机制可能与大豆皂苷Bb促进牙槽骨成骨细胞MEK,ERK mRNA和蛋白表达,以及激活MEK/ERK信号通路传导有关。

地塞米松通过抑制p53蛋白降解诱导成骨细胞凋亡

目的观察地塞米松对成骨细胞凋亡的影响并探讨其作用机制。方法分别采CellTiter-Glo®荧光细胞活力检测试剂盒和Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒测定地塞米松作用后MC3T3-E1细胞的增殖和凋亡。蛋白质印迹法(Western blotting)检测地塞米松作用后MC3T3-E1细胞和hFOB1.19细胞胱天蛋白酶3(caspase-3)/裂解caspase-3和PARP/裂解PARP的表达。用Western blotting和PCR分析地塞米松作用后MC3T3-E1细胞中p53和检控点激酶2(Chk2)的表达。探讨p53敲除和Chk2敲除在地塞米松诱导MC3T3-E1细胞凋亡中的作用。结果地塞米松能显著抑制MC3T3-E1细胞的生长并诱导其凋亡。地塞米松能通过促进p53的表达诱导成骨细胞凋亡。地塞米松对P53蛋白表达的调节作用是通过上调Chk2来实现的,Chk2与P53相互作用,抑制P53蛋白的降解。P53基因敲除可通过降低裂解caspase-3和裂解PARP的表达来抑制地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞凋亡,经Dex处理的MC3T3-E1和hFOB1.19细胞中Ceaved PARP(0.38±0.02比0.20±0.01、0.29±0.02比0.20±0.02)和Ceaved caspase-3蛋白表达增加(均P<0.001)。结论地塞米松增加了Chk2蛋白的表达,稳定了p53蛋白的表达,进而促进成骨细胞的凋亡。

血管内皮生长因子165/骨形态发生蛋白改善缺氧复氧状态下成骨细胞损伤

背景:研究发现,血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白两种因子在缺氧复氧过程中相互作用,通过调节细胞内信号通路的活化,参与骨细胞损伤的修复过程。目的:进一步探究血管内皮生长因子165/骨形态发生蛋白与缺氧复氧成骨细胞损伤的关系分析。方法:取成骨细胞,建立缺氧复氧损伤模型,建模前后Real-Time PCR法和免疫印迹法检测血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白2的mRNA及蛋白表达。分别给予建模后成骨细胞不同质量浓度(10,20,40ng/mL)血管内皮生长因子165或骨形态发生蛋白2处理12,24,36,48,72 h,CCK-8法检测细胞增殖,DAPI检测细胞凋亡。结果与结论:(1)与建模前相比,建模后成骨细胞中血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白2的mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05);(2)成骨细胞增殖率随着血管内皮生长因子165质量浓度的升高而明显升高(P<0.05);成骨细胞凋亡率随着血管内皮生长因子165质量浓度的升高而明显降低(P<0.05);(3)成骨细胞增殖率随着骨形态发生蛋白2质量浓度的升高而明显升高(P<0.05);成骨细胞凋亡率随着骨形态发生蛋白质量浓度的升高而明显降低(P<0.05);(4)结果表明,血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白在缺氧复氧成骨细胞损伤中低表达,给予血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白处理后缺氧复氧成骨细胞损伤明显降低,且呈浓度依赖性,提示血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白对缺氧复氧成骨细胞损伤有明显保护作用。