降钙素基因相关肽对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响

目的 探讨外源性降钙素基因相关肽 (CGRP)对大鼠颅盖骨来源成骨细胞的影响 ,以进一步了解CGRP促进成骨的作用机制。方法 利用二次酶消化法培养的成骨细胞 ,加入含不同浓度CGRP的条件培养液 ,2 4小时后通过MTT比色 ,3 H TdR掺入以及细胞内碱性磷酸酶 (ALP)含量的测定来观察CGRP对成骨细胞增殖和分化的影响。结果 CGRP可以明显促进成骨细胞增殖 ,而且作用呈剂量依赖性。CGRP对细胞内ALP含量无明显影响。结论 CGRP能够直接作用于成骨细胞并通过促进其增殖而有利于骨形成。

降钙素基因相关肽通过抑制Nod样受体蛋白3表达促进小鼠成骨细胞分化的研究

目的研究降钙素基因相关肽(CGRP)作用下相关炎症体和信号因子的表达变化,探讨CGRP对成骨细胞分化的作用机制。方法将不同浓度的CGRP(0、10、30、100 ng·m L-1)加入到成骨细胞中,采用实时聚合酶链反应技术检测细胞内Nod样受体蛋白3(NLRP3)及白细胞介素-1β(IL-1β)m RNA的表达水平,蛋白质印迹法检测NLRP3的蛋白表达,酶联免疫吸附测定检测IL-1β的蛋白表达,流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)含量,茜素红染色显示成骨细胞分化情况。结果随着CGRP浓度的增加,NLRP3和IL-1β的蛋白表达及m RNA表达均呈降低趋势(P<0.05),而且细胞内ROS浓度逐渐下降(P<0.05)。100 ng·m L-1CGRP实验组较0 ng·m L-1CGRP对照组显著促进成骨细胞分化。结论 CGRP在一定条件下,可通过抑制细胞内炎症因子的表达促进成骨细胞分化。

降钙素基因相关肽诱导脂肪干细胞向成骨细胞的分化

背景:已证实降钙素基因相关肽可促进成骨细胞的增殖与分化,并加速骨折的愈合、促进异位骨化的形成,但其是否具有促使脂肪干细胞向成骨细胞定向分化的作用作者未查到相关报道。目的:探讨降钙素基因相关肽在体外定向诱导脂肪干细胞向成骨细胞增殖分化的可行性。设计、时间及地点:细胞学体外观察,基因及蛋白质学检测,于2006-10/2007-08在武汉大学医学院中心实验室和三峡大学医学院病理实验室完成。材料:清洁级4月龄健康新西兰大耳白兔2只。方法:密度梯度离心+贴壁法体外分离培养兔脂肪干细胞,传至第3代分为2组:对照组加入含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50mg/L抗坏血酸、1×10-8mol/L地塞米松、体积分数为0.15的胎牛血清的RPMI1640骨诱导培养基,实验组在此基础上加入1μg/L降钙素基因相关肽进行诱导培养。主要观察指标:细胞形态学变化,免疫组织化学染色测定细胞碱性磷酸酶活性,四环素标记法检测矿化结节的形成,RT-PCR和Westernblot法检测成骨细胞标志性蛋白I型胶原、骨钙素的表达。结果:实验组脂肪干细胞经成骨诱导培养后,形态规则、多角型细胞增多,细胞倍增时间明显短于对照组。随诱导时间的延长,实验组细胞碱性磷酸酶活性呈增加趋势,诱导7,10,14d细胞碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(t=13.26,P<0.01)。诱导21d与对照组比较,实验组形成的金黄色圆形矿化结节数量增多,结节增大。诱导7d,14d实验组I型胶原及骨钙素mRNA、蛋白水平的表达均强于对照组。结论:在体外降钙素基因相关肽能诱导并促进兔脂肪干细胞向成骨细胞方向分化。

山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因表达的变化

目的:研究山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因ALP、OCN、COL I mRNA表达水平的变化。方法:采用全骨髓培养法培养骨髓基质干细胞,使用成骨条件培养液体外诱导成骨细胞,通过细胞形态学观察、免疫组化染色、钙结节等检测手段进行成骨细胞鉴定,采用RT-PCR和实时定量PCR检测诱导2周后骨髓基质干细胞ALP、OCN、COL I的表达水平,未诱导的骨髓基质干细胞作为对照组。结果:通过成骨细胞鉴定,骨髓基质干细胞成功诱导分化为成骨细胞;OCN和COL I基因在细胞诱导组表达上调,ALP基因表达在诱导组和未诱导组间无显著差异。结论:成功诱导山羊BMSCs向成骨细胞分化,成骨分化相关基因在诱导后为适应成骨细胞的功能发生变化。

降钙素基因相关肽对兔成骨细胞OPG/RANKLmRNA表达的影响

目的:探讨外源性降钙素基因相关肽(CGRP)对成骨细胞核因子- κB受体活化因子配体(RANKL)及其饵受体骨保护素(OPG)基因表达的影响,了解CGRP在破骨细胞性骨吸收调节中的作用机制。方法:将体外培养的兔成骨细胞用不同浓度的CGRP处理24h,通过半定量逆转录聚合酶链反应(RT -PCR)来观察成骨细胞两种目的基因(OPG, RANKL)的mRNA表达强度变化。结果:CGRP呈剂量依赖性的刺激成骨细胞OPGmRNA表达,同时亦下调RANKLmRNA表达。结论:CGRP通过调节成骨细胞OPG/RANKL的比值可间接地调节破骨细胞活性,从而影响骨代谢。

rhIGF-1对成骨细胞增殖、分化及骨保护素、骨保护素配体基因mRNA表达的影响

目的 观察不同剂量rhIGF 1对成骨细胞增殖、分化及骨保护素、骨保护素配体mRNA基因表达的影响 ,为明确骨保护素、骨保护素配体在骨质疏松症发病的作用机理及rhIGF 1在临床中的应用提供实验依据。方法 取 2代培养的大鼠成骨细胞 ,在rhIGF 1为 0ng/ml,10ng/ml,2 0ng/ml,5 0ng/ml的浓度中培养。观察细胞的生长及钙结节的形成 ,MTT法、碱性磷酸酶 (ALP)、骨钙素 (OCN)测定细胞增殖和分化 ,RT PCR测定rhIGF 1对成骨细胞骨保护素、骨保护素配体基因mRNA表达的影响。结果 成骨细胞在 7d可铺满瓶壁 ,3 0d可形成钙结节 ,rhIGF 1可促进成骨细胞的增殖、ALP和OGN的分泌 ,促进骨保护素、骨保护素配体基因的表达 ,以促进骨保护素表达明显 ,在rhIGF 1为 10ng/ml时作用明显。结论rhIGF 1可促进大鼠成骨细胞的增殖、分化 ,及骨保护素、骨保护素配体基因mRNA的表达 ,骨保护素mRNA表达显著。rhIGF 1可能通过影响骨保护素、骨保护素配体而调节成骨细胞、破骨细胞的平衡 ,使骨重建 。

降钙素基因相关肽对兔成骨细胞增殖和TGF-β_1表达的影响

目的检测外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-ralated peptide,CGRP)对体外培养兔成骨细胞转化生长因子-β1(transformation growth factor-β1,TGF-β1)表达的调控作用,探讨其对成骨细胞增殖的影响。方法将出生5 d以内新西兰大白兔头骨成骨细胞进行原代培养,用不同浓度的CGRP分别在不同时间段处理后,用MTT法检测细胞生长活力增殖情况;用Western blot检测成骨细胞TGF-β1的蛋白表达。结果成功分离并培养兔颅骨原代成骨细胞,进行碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨细胞。结果显示同一浓度的CGRP随着时间的增加MTT值呈增加趋势;而就同一时间点做比较,随着CGRP浓度的不断增加,MTT值也呈上升趋势,并且在48h和72h,这种趋势愈加明显(P<0.05)。另外随CGRP浓度的增加TGF-β1条带灰度显著升高,显示TGF-β1蛋白的表达逐渐增强(P<0.05),CGRP可能促进兔成骨细胞TGF-β1的表达。结论 CGRP可能通过调节成骨细胞TGF-β1蛋白的表达促进成骨细胞的增殖分化从而影响骨代谢。

Dlx2基因过表达与前成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化过程中的细胞凋亡和周期调控

背景:Dlx2基因在颅神经嵴细胞迁徙进入第一鳃弓过程和颅颌面骨骼发育中起重要作用,但Dlx2基因对成骨细胞分化过程中细胞凋亡和细胞周期调控的影响尚未见报道。目的:观察Dlx2基因过表达对前成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化过程中细胞凋亡和细胞周期调控的影响。方法:构建反转录病毒pMSCV-puro-Dlx2并转染矿化诱导液培养下的MC3T3-E1细胞,构建稳定过表达Dlx2基因的细胞系MC3T3-E1-Dlx2。RT-PCR和Western blot验证Dlx2基因过表达细胞系的建立。Annexin V/PI双染色后流式细胞分选检测细胞凋亡,PI/RNase双染色后流式细胞分选检测细胞周期变化。结果与结论:实验成功构建稳定过表达Dlx2基因的细胞系MC3T3-E1-Dlx2。发现Dlx2基因过表达促进细胞凋亡(P<0.05),同时阻滞细胞周期于G1/G0期(P<0.05),减低细胞增殖性,促进细胞分化行使功能。

TGF-β对成骨细胞增殖、分化及OPG基因mRNA表达的影响

目的 观察不同剂量TGF-β对成骨细胞增殖、分化及OPGmRNA基因表达的影响,明确其作用机理。方法 取新生24h内的Wistar大鼠颅盖骨分离成骨细胞,在TGF-β为Oμg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L的浓度中培养。对细胞的生长及钙结节的形成观察其生长状态,经MTT法测定细胞增殖,细胞分化由碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)水平测定得到。用RT-PCR技术测定TGF-β对成骨细胞OPC基因mRNA表达的影响。结果 成骨细胞在7d可铺满瓶壁,30d可形成钙结节,TGF-β可促进成骨细胞的增殖、ALP和OCN的分泌,以TGF-β为1μg/L时作用明显。TGF-β可促进OPG基因的表达在为1μg/L时作用明显。结论 1μg/L可促进大鼠成骨细胞的增殖、分化,促进成骨细胞OPG基因mRNA的表达。TGF-β可能通过影响OPG而调节成骨细胞、破骨细胞的平衡,使骨重建。

降钙素基因相关肽对大鼠成骨细胞表达转录因子RUNX2的影响

目的:探讨外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对大鼠颅盖骨来源成骨细胞RUNX2因子表达水平的影响,进一步了解CGRP促进成骨的作用机制。方法:用酶消化法培养原代大鼠成骨细胞并鉴定;MTT法筛选促进成骨细胞增殖的有效浓度,将含有不同浓度CGRP的条件培养基加入大鼠成骨细胞培养体系中,药物作用48 h后,用半定量RT-PCR和Western blotting方法检测大鼠成骨细胞转录因子RUNX2在mRNA和蛋白水平的表达。结果:当CGRP浓度在10-8～10-6mol/L范围时,对成骨细胞增殖有明显促进作用,增殖率分别为71.9%,142.1%,321.0%,P<0.05;浓度为10-7和10-6mol/L的CGRP作用于成骨细胞48 h后,转录因子RUNX2在mRNA水平的表达量明显上调,分别增强(46.2±11.2)%和(58.6±14.0)%,P<0.05;转录因子RUNX2的蛋白表达变化趋势与其mRNA的表达变化趋势基本一致。结论:一定浓度的CGRP对大鼠成骨细胞转录因子RUNX2的表达有直接促进作用,RUNX2可能参与了CGRP刺激成骨细胞增殖反应的机制。

降钙素基因相关肽对乳腺癌细胞与成骨细胞共培养中骨代谢调控的研究

目的:建立体外乳腺癌细胞与成骨细胞共培养体系,观察降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对共培养条件下成骨细胞成熟和矿化能力的影响及其骨调节因子的变化。方法:乳腺癌细胞MDA-MB-231与成骨样细胞MG63共培养后,行CGRP干预,观察共培养条件下骨代谢调节因子护骨素(osteoprotegerin,OPG)、细胞核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,Rankl)和Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2,Runx2)mRNA及蛋白的表达以及碱性磷酸酶的表达量和细胞矿化能力的变化。结果:与MG63细胞单独培养相比,MG63细胞与MDA-MB-231细胞共培养时Runx2和Rankl mRNA及蛋白的表达上调,同时伴有OPG mRNA及蛋白表达的下调(P<0.05);CGRP处理后,上述改变被逆转。此外,CGRP能明显增加MG63与MDA-MB-231细胞共培养后碱性磷酸酶的表达量,并促进细胞矿化结节的形成(P<0.05)。结论:乳腺癌细胞通过调节成骨细胞OPG-Rankl的表达促进破骨细胞的活性,通过调节Runx2的表达抑制成骨细胞的矿化活性。CGRP可逆转这一作用,进而促进骨修复。CGRP有望成为治疗乳腺癌骨转移的新制剂之一。

降钙素基因相关肽对鼠成骨细胞IGF-I及IGF-IR mRNA表达的影响

目的 :探讨降钙素基因相关肽 (CGRP)对成骨细胞胰岛素样生长因子I(IGF -I)和胰岛素样生长因子I型受体(IGF IR)基因表达的影响。方法 :将体外培养的鼠成骨细胞用不同浓度的CGRP分别处理 8h和 2 4h ,通过半定量逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)来观察成骨细胞二种目的基因 (IGF I ,IGF IR)的mRNA表达强度变化。结果 :CGRP可以刺激成骨细胞IGF ImRNA表达 ,以 10 -8M作用 8h最为明显。CGRP亦能够上调成骨细胞IGF -IRmRNA表达 ,而且维持时间达 2 4h。结论 :CGRP通过增强IGF I的自分泌作用来间接地调节成骨细胞活性 ,从而发挥成骨效应。

小鼠骨髓基质细胞Kusa-A1成骨分化中Notch信号相关基因表达分析

目的:检测骨髓基质细胞系Kusa-A1成骨分化过程中Notch信号相关分子的表达变化,分析Notch信号途径在成骨细胞分化和骨形成中的可能作用.方法:培养小鼠Kusa-A1细胞,在常规培养和诱导培养(添加维生素C和β磷酸甘油)条件下用Real-time PCR方法分别检测Delta1、Jagged1、Notch1、CBF1、HES1基因的表达变化.同时也检测了成骨标志基因骨桥蛋白(OPN)的表达变化.结果:常规培养下Kusa-A1细胞汇片后0～5d,OPN表达有轻微下调,Notch相关分子表达维持不变或有轻微下调.诱导培养条件下细胞汇片后0～5d,OPN表达上调,而Delta1、Jagged1、Notch1、HES1表达大幅度下调,惟有CBF1表达有轻度上调趋势.结论:Notch信号分子表达与Kusa-A1细胞成骨分化负相关,Notch信号对细胞成骨分化可能有抑制作用,而CBF1则可能对成骨细胞分化有正向调节作用.

人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达

目的:系统研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。方法:应用密度梯度离心法分离hBMSCs,取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定;应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。结果:第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90,具有成脂和成骨分化潜能。成骨相关基因在诱导早期部分表达,中期均有表达,基因表达大部分在14天达高峰,与矿化相关的基因表达在21天达高峰。结论:hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达,其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。

成骨细胞表型分化及基因调控研究进展

对成骨细胞矿化发生和调控的研究将有利于理解骨源性疾病的发生机制。本文从基因、蛋白质和形态学研究的角度对成骨细胞的表型发育过程及其基因调控的可能机理进行了综述。

miR-130a-5p靶向Runx2对牙槽骨成骨细胞增殖和分化的影响及其调控机制研究

目的:探究miR-130a-5p靶向Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)对牙槽骨成骨细胞(Alveolar osteoblast,AOB)增殖、凋亡、成骨分化的影响及其机制。方法:将AOB分为NC组、miR-NC组、miR-130a-5p组、miR-130a-5p+Runx2组和miR-130a-5p+SHH组。双荧光素酶报告验证miR-130a-5p对Runx2、Sonic hedgehog(SHH)的调控关系;CCK-8及EdU染色检测细胞增殖能力;AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡能力;ALP染色、茜素红染色检测细胞成骨分化能力;RT-qPCR检测miR-130a-5p、Runx2、SHH、神经胶质瘤关联癌基因同源物1(Gli1)mRNA水平;Western Blot检测增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Ki67、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 related X protein,Bax)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP2)、Runx2、SHH、Gil1水平。结果:miR-130a-5p靶向调控Runx2、SHH。过表达miR-130a-5p后,细胞24 h、48 h、72 h OD值及EdU阳性率降低,细胞凋亡率升高,成骨分化能力降低,miR-130a-5p、Bax蛋白水平升高,Runx2、PCNA、Ki67、Bcl-2、ALP、OCN、BMP2蛋白及SHH、Gil1 mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)。过表达miR-130a-5p和Runx2或过表达miR-130a-5p和SHH可减弱过表达miR-130a-5p对细胞增殖、凋亡、成骨分化的影响。结论:miR-130a-5p靶向Runx2抑制AOB增殖和成骨分化,并促进AOB凋亡,其可能通过抑制SHH信号通路发挥作用。

降钙素基因相关肽对MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤的保护作用研究

目的探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤的保护作用及其潜在机制。方法 1)构建细胞氧化损伤模型,将实验分为4组,H_2O_2组使用含不同浓度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 mol·L^(-1))H_2O_2的培养液,CGRP+H_2O_2组使用含不同浓度(10-6、10-7、10-8、10-9、10-10 mol·L^(-1))CGRP的培养液预处理后再加入含10-4 mol·L^(-1) H_2O_2的培养液,对照组为常规培养液,空白组不接种细胞。培养12、24、36、48 h后,CCK-8法检测细胞增殖活性,筛选最佳建模浓度和CGRP对成骨细胞氧化损伤的最佳保护浓度。2)采用含10-4 mol·L^(-1) H_2O_2(H_2O_2组)、10-8 mol·L^(-1) CGRP(CGRP组)的培养液和10-8 mol·L^(-1) CGRP+10-4 mol·L^(-1) H_2O_2培养液(CGRP+H_2O_2组)、常规培养液(对照组)培养成骨细胞,测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性、活性氧(ROS)的含量以及炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6的水平。结果 1)在10-4 mol·L^(-1) H_2O_2时细胞增殖开始出现抑制(P<0.01),并呈浓度和时间依赖性;10-8 mol·L^(-1) CGRP预处理后细胞增殖活性最高,与只加入10-4 mol·L^(-1) H_2O_2有统计学差异(P<0.01)。2)与H_2O_2组相比,CGRP+H_2O_2组SOD活性升高(P<0.01),TNF-α、IL^(-1)β、IL-6水平降低(P<0.05),ROS含量降低(P<0.01)。结论 H_2O_2会对MC3T3-E1成骨细胞造成氧化损伤,CGRP对MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤具有保护作用。

nHA/PCL复合材料组分配比对成骨细胞骨相关基因表达的影响研究

通过半定量反转录RT-PCR的方法,研究了不同配比的复合材料纳米羟基磷灰石/聚已内酯/(nHA/PCL)(nHA∶PCL1=40∶60和nHA∶PCL2=60∶40)对成骨细胞骨相关基因(成骨细胞碱性磷酸酶、骨钙素蛋白、骨粘连蛋白和骨桥蛋白等)表达的影响.结果表明:在nHA/PCL复合材料上生长的成骨细胞的骨钙蛋白、骨粘连蛋白和骨桥蛋白mRNA表达量上调;在PCL材料上生长的成骨细胞的骨钙蛋白、骨粘连蛋白和骨桥蛋白mRNA的表达量下调;而nHA/PCL和PCL均使碱性磷酸酶基因的表达下调。