成骨肉瘤细胞SOSP-9607中miRNA的克隆与验证

背景与目的:microRNA(miRNA)是一类非编码蛋白,并参与转录后调节的单链小分子RNA(约20～25个碱基),对基因表达具有重要调控作用,与肿瘤的发生存在着密切的关系。本研究拟克隆成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中miRNA,并对部分功能性基因进行验证。方法:以SOSP-9607细胞作为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),多聚腺苷酸化和5′连接子连接后,通过RT-PCR进行反转录和扩增,克隆到pCR4-TOPO载体上得到大约109bpDNA片段,测序后经过生物信息学分析确定miRNA的表达情况。根据当前miRNA的研究现状,在克隆到的miRNA中选取部分功能性miRNA和新发现miRNA,合成相应探针后与从SOSP-9607细胞、HeLa细胞和成骨肉瘤组织中分离出的小片段RNA进行Northern印迹验证。结果:克隆测序后得到182个克隆体,经生物信息学分析发现有47个miRNA(25种),其中含有23种已知的miRNA和2种Nature杂志上预测的miRNA(miR-165和miR-166)。选取的三条实体瘤相关的miRNA(miR-21、miR-20a、miR-17-5p)以及两条预测的miRNA进行Northern印迹验证,miR-21、miR-20a、miR-17-5p在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中均表达,预测的miR-165和miR-166在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中亦均表达,但miR-166在HeLa细胞中没有表达。结论:克隆了SOSP-9607细胞中的miRNA,并验证了部分功能性miRNA的表达,提示miRNA与肿瘤发生可能有密切的关系。

人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607的建立及其生物学特性的观察

目的 建立人成骨肉瘤细胞系。方法 采用原代组织块培养法对成骨肉瘤手术标本进行培养 ,对存活细胞进行形态学观察、组织化学染色、乳酸脱氢酶 (LDH)同工酶谱、细胞周期检查、核型分析、异种移植。结果 建立细胞系SOSP 96 0 7,其形态学表现、组织化学染色、LDH同工酶谱等均符合成骨肉瘤的特征。经 1年体外培养 ,已连续传代 12 0次 ,细胞倍增时间 2 9.8h ,细胞周期测定G1期为 48.2 %、G2 期为 2 0 .9%、S期为 30 .9%。染色体具有亚三倍体核型 ,众数为 6 4～ 6 6条。异种移植成瘤率 10 0 % ,无支原体污染。结论 人成骨肉瘤细胞系SOSP 96 0 7可用于对成骨肉瘤的研究。

microRNA-192抑制物对骨肉瘤细胞系SOSP_9607增殖和凋亡的影响

目的:探讨miR-192抑制物对于骨肉瘤细胞系SOSP_9607细胞增殖和凋亡的影响。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡和周期。将SOSP_9607细胞分为对照组和实验组,对照组分为阴性对照和正常细胞对照组。实验组采用miR-192抑制物(hsa-miR-192inhibitors)抑制SOSP_9607细胞内miR-192的活性。结果:与对照组相比,实验组显著抑制SOSP_9607细胞的增殖,有明显的剂量依赖性(P<0.01)。随着浓度从50nmol/L逐渐增加至200nmol/L,抑制率逐渐增高(P<0.01)。与对照组相比,实验组细胞周期G_0/G_1细胞比例显著增加,G_2/M期细胞比例显著减少,S期细胞比例显著减少(P<0.01)。实验组凋亡率(13.6±2.1)%与阴性对照组凋亡率(7.1±0.5)%相比明显增高(P<0.01)。结论:miR-192抑制物通过抑制SOSP_9607细胞中miR-192的活性对SOSP_9607细胞的增殖和凋亡发挥重要作用,可能成为骨肉瘤生物治疗的新靶点。

不同转移潜能骨肉瘤细胞株的筛选与建立

目的获得不同转移潜能的骨肉瘤细胞株。方法从我室建立的人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中通过有限稀释法获得不同的单细胞克隆,经过侵袭试验初筛后获得5株转移潜能不同的细胞株,再通过裸鼠体内连续传代法筛选出具有不同转移能力的细胞系。结果获得两株转移潜能不同的骨肉瘤细胞株。结论这两株细胞株它们来源于同一亲本,他们之间的差异集中在转移表型上,为今后利用分子生物学的方法筛选出转移相关基因,从而为成骨肉瘤的转移机制及临床研究奠定基础。

miR-15a和miR-16-1模拟物对人骨肉瘤细胞系SOSP-9607凋亡和增殖的影响

目的:探讨miR-15a和miR-16-1模拟物对于人骨肉瘤细胞系SOSP-9607凋亡和增殖的影响。方法:将SOSP-9607细胞分为实验组和对照组。实验组分为miR-15a组、miR-16-1组、miR-15a+miR-16-1组。以miR-15a组为例,采用miR-15a模拟物(hsa-miR-15a mimics)上调SOSP-9607细胞内的miR-15a表达量。对照组分为阴性对照组和空白对照组。采用流式细胞仪测定细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖,并计算细胞增殖效率。结果:通过统计学分析,实验组凋亡率与阴性对照组凋亡率相比明显增高(P<0.05);实验组的细胞增殖率明显低于对照组(P<0.05)。结论:上调SOSP-9607细胞内miR-15a和miR-16-1的表达量可促进SOSP-9607细胞的凋亡并抑制其增殖。

microRNA-194模拟物对成骨肉瘤细胞系SOSP_9607生物学特性的影响

目的:观察miR-194模拟物对于成骨肉瘤细胞系SOSP_9607细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞凋亡和周期。将SOSP_9607细胞分为对照组和实验组,对照组分为阴性对照和正常细胞对照组。实验组采用miR-194模拟物(hsa-miR-194mimics)转染成骨肉瘤细胞系SOSP_9607,增强SOSP_9607细胞内miR-194的活性。结果:与对照组比较,实验组细胞的增殖能力明显下降。实验组凋亡率(10.1±0.22)%与阴性对照组凋亡率(3.3±0.19)%相比明显增高(P<0.01)。与对照组比较,实验组细胞周期G0/G1细胞比例显著增加,G2/M期细胞比例显著减少,S期细胞比例显著减少(P<0.01)。结论:通过转染miR-194模拟物增强SOSP_9607细胞中miR-194的活性对SOSP_9607细胞的增殖和凋亡造成显著影响。

mirRNA-17-5p抑制物对骨肉瘤细胞系SOSP_9607增殖和凋亡的影响

目的:探讨miR-17-5p抑制物对于骨肉瘤细胞系SOSP_9607细胞增殖和凋亡的影响。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖,进一步计算抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡。将SOSP_9607细胞分为对照组和实验组,对照组分为阴性对照和正常细胞对照组。实验组采用miR-17-5p抑制物(hsa-miR-17-5pinhibitors)抑制SOSP_9607细胞内miR-17-5p的活性。结果:与对照组相比,实验组显著抑制SOSP_9607细胞的增殖,有明显的剂量依赖性(P<0.01)。随着浓度从50nmol/L逐渐增加至200nmol/L,抑制率逐渐增高(P<0.01)。实验组凋亡率(9.6±1.8)%与阴性对照组凋亡率(3.5±0.4)%相比明显增高(P<0.01)。结论:miR-17-5p抑制物通过抑制SOSP_9607细胞中miR-17-5p的活性对SOSP_9607细胞的增殖和凋亡发挥重要作用。