Ad-BMP-2促进兔骨髓间质干细胞成骨转化的研究

探讨用携带有人BMP 2基因片段的复制缺陷重组腺病毒 (Ad BMP 2 )转染对体外培养MSCs成骨转化的影响。取日本大耳白兔 2 0只自双侧股骨大转子取材培养MSCs,左侧来源细胞为实验组 ,右侧为对照组。以复制缺陷重组腺病毒介导人BMP 2基因转染MSCs后用RT PCR法及免疫组化染色证实转基因MSCs的BMP 2蛋白表达情况 ,通过改良Gomori钙钴法及ALP检测试剂盒检测两组细胞的ALP活性 ;通过RT PCR及Westernblot检测两组细胞Ⅰ型胶原的表达 ;通过BGP放免分析试剂盒检测两组细胞的OCN含量 ;并通过透射电镜观察转基因前后MSCs超微结构的变化。实验证实用Ad BMP 2转染的MSCs具有成骨细胞的结构特征和生物学特性。定量分析显示转基因组MSCs培养上清中ALP活性为 ( 7 0 1± 0 5 9)U L ,对照组为 ( 5 2 3± 0 5 5 )U L。Ⅰ型胶原表达的半定量分析显示转基因组为 1 3 5± 0 12 ,对照组为 3 65± 0 3 7。OCN含量在转基因组为 ( 2 4 5 0± 0 93 ) μg L ,对照组为 ( 15 45± 1 81) μg L。认为Ad BMP

辛伐他汀诱导促进骨形成蛋白-7基因修饰的兔间充质干细胞的成骨转化

目的:研究辛伐他汀诱导对骨形成蛋白-7(BMP-7)基因修饰的间充质干细胞(MSCs)增殖和分化表型的影响。方法:将辛伐他汀诱导和未经诱导的兔MSCs分别转导BMP-7基因后,Westernblotting检测转导后细胞BMP-7的表达;通过观察细胞生长以及碱性磷酸酶活性和测定骨钙素含量,分析辛伐他汀诱导对BMP-7基因修饰的MSCs的增殖和分化表型的影响。结果:转导后BMP-7基因在诱导组和未诱导组MSCs中均有表达,诱导组细胞BMP-7表达量、碱性磷酸酶活性和骨钙素含量均比较未诱导组明显增高。结论:转导前辛伐他汀诱导能够促进BMP-7基因修饰的MSCs的成骨转化。

胰岛素样生长因子-1对rhBMP-2诱导下成纤维细胞增殖及成骨转化的影响

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)在重组人骨形态蛋白2(rhBMP-2)诱导成纤维细胞(Fb)转化为成骨细胞过程中是否具有促进作用。方法从成年新西兰大白兔背部皮肤中分离、纯化提取成纤维细胞,然后培养。将细胞分为空白对照组、rhBMP-2干预组和IGF-1+rhBMP-2干预组。空白对照组:常规培养液培养,不加入任何诱导剂及干预因子;rhBMP-2干预组:常规培养液中加入100μg/L的rhBMP-2;IGF-1+rhBMP-2干预组:常规培养液中加入100μg/L的rhBMP-2与终浓度为50μg/L的IGF-1。定期在倒置显微镜下观察Fb生长状况,并采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况,同时行碱性磷酸酶(ALP)活性检测、茜素红染色及钙钴染色评价其成骨分化的能力。结果与其他2组相比,IGF-1+rhBMP-2组细胞增殖速度快,周期短,MTT法检测示细胞生长旺盛,而空白对照组与rhBMP-2干预组之间无显著性差异。rhBMP-2干预组ALP表达高于空白对照组;而IGF-1+rhBMP-2组ALP表达明显高于其他2组。茜素红染色空白对照组未见明显钙化结节,rhBMP-2干预组细胞可见红色钙化结节,而IGF-1+rhBMP-2组钙化结节数目明显较rhBMP-2干预组多,面积增大。钙钴染色:rhBMP-2干预组和IGF-1+rhBMP-2干预组细胞胞浆中均可见浅棕色至棕黑色的细胞颗粒,但以IGF-1+rhBMP-2干预组棕黑色颗粒较多。空白对照组未见明显阳性细胞。结论 Fb在体外一定条件下经过诱导剂诱导后,可向成骨细胞方向转化。IGF-1可以促进Fb在rhBMP-2诱导下的增殖及成骨表型表达。

地塞米松诱导促进BMP-2基因转染的兔MSCs的成骨转化

目的: 研究地塞米松诱导对BMP 2基因修饰的rMSCs的增殖和分化表型的影响.方法: 将地塞米松诱导和未经诱导的兔MSCs分别转导BMP 2基因后,以RT PCR和免疫组化方法检测转导后细胞BMP 2的表达;通过观察细胞生长及碱性磷酸酶活性和骨钙素含量的测定,分析地塞米松诱导对BMP 2基因修饰的rMSCs的增殖和分化表型的影响.结果: 转导后BMP 2基因在两组rMSCs中均有表达,定量分析显示诱导组细胞碱性磷酸酶活性 ( 134 36±8 84 )nkat/L较对照组(104 02±7 83)nkat/L明显增高;诱导组细胞骨钙素含量(14 68±0 73)μg/L较对照组(6 52±1 21)μg/L明显增高.结论: 转导前地塞米松诱导能够促进BMP 2基因修饰的rMSCs的增殖和成骨转化.

外源性Ⅵ型胶原对人后纵韧带细胞增殖和成骨转化的影响

目的观察外源性VI型胶原蛋白（collagenVI,CⅥ）对人后纵韧带细胞增殖和成骨转化的影响.方法取颈椎后纵韧带骨化症（ossificationoftheposteriorlongitudinalligament,OPLL）患者手术切除的后纵韧带未骨化部分和非OPLL患者因外伤手术切除的正常后纵韧带,原代培养至第3代细胞,分别记作O细胞和N细胞;两种细胞均采用0、6.25、12.5、25、50、100g/mlCⅥ刺激;CCK8法测定刺激后两种细胞1～7天光密度（D）值,评价CⅥ对细胞增殖的影响;骨形态生成蛋白-2（BMP-2）对不同浓度CⅥ刺激的细胞进行诱导骨化,用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组细胞成骨细胞转录因子-2（RunX2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）的基因表达情况.结果CⅥ对两种细胞的增殖均起促进作用,且随着CⅥ浓度增加,其对细胞增殖的促进作用随之增强,但达到一定浓度后这种作用会保持不变或减弱,同一时间点内50g/mlCⅥ刺激时两种细胞的D值最大;BMP-2诱导后的两组细胞有CⅥ刺激的ALP、RunX2和OC的基因表达均高于无CⅥ刺激的对照组（P〈0.05）;在无CⅥ刺激的情况下,O细胞的基因表达高于N细胞（P〈0.05）.结论CⅥ能够促进人后纵韧带细胞的增殖和成骨转化,而来自后纵韧带骨化患者的细胞则更易被促进增殖和诱导骨化,CⅥ可能具有促进后纵韧带细胞成骨的功能.

黄芪总黄酮通过调节Notch-Wnt信号通路对强直性脊柱炎模型大鼠炎症反应和成纤维细胞成骨转化的影响

目的 探究黄芪总黄酮对强直性脊柱炎(AS)模型大鼠炎症反应和成纤维细胞成骨转化的影响及作用机制。方法 将72只大鼠随机分为6组,每组12只,分别为空白对照组、模型组、黄芪总黄酮低、中、高剂量组(25、50、100 mg/kg)和阳性药物组(柳氮磺胺吡啶825 mg/kg)。除空白对照组外,其余各组大鼠建立AS大鼠模型,药物干预28 d后,ELISA分别检测血清和脊柱组织中炎症因子(IL-6、IL-1β、IL-8),显色法检测成纤维细胞成骨型表达标志物[碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(BGP)、Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP)含量]的变化,Western blot检测成骨分化相关细胞因子[骨形态发生蛋白2(BMP-2)、转化生长因子-β1(TGF-β1)]和Notch-Wnt信号通路相关蛋白表达。结果 与空白对照组比较,模型组大鼠血清、脊柱组织中IL-6、IL-1β和IL-8水平升高(P<0.05),血清ALP活性、BGP含量升高(P<0.05),PINP含量降低(P<0.05),脊柱组织中BMP-2、TGF-β1蛋白表达水平降低(P<0.05),Notch1、Hes1、Wnt1、β-catenin蛋白表达水平均升高(P<0.05);与模型组比较,黄芪总黄酮中、高剂量组和阳性药物组血清、脊柱组织中IL-6、IL-1β和IL-8水平降低(P<0.05),血清ALP活性、BGP含量降低(P<0.05),PINP含量升高(P<0.05),脊柱组织中BMP-2、TGF-β1蛋白表达水平升高(P<0.05),Notch1、Hes1、Wnt1、β-catenin蛋白表达水平均降低(P<0.05)。结论 黄芪总黄酮可减轻AS模型大鼠炎症反应,改善成纤维细胞成骨转化,可能与抑制Notch-Wnt信号通路相关。

肝素钠对骨髓基质细胞增殖及成骨转化的影响

:目的 观察肝素钠对成人骨髓基质细胞增殖及成骨转化的影响。方法 从成人来源的骨髓基质细胞在含不同浓度肝素钠的 16 40培养液中培养 48、72小时 ,MTT比色法观察肝素钠对其增殖的影响 ;采用碱性磷酸酶细胞化学染色 ,计数成骨细胞转化率。结果 肝素钠在 6 0、15 0U/ml时 ,光吸收值明显高于对照组 (P <0 0 1) ,其余浓度组无明显差异 ;对成骨转化率无影响。结论 肝素钠在一定浓度范围内对骨髓基质细胞增殖及成骨转化无抑制作用。

过表达CKLF1基因对强直性脊柱炎滑膜成纤维细胞增殖及成骨转化影响的实验研究

目的探索趋化素样因子1 (chemokine-like factor1,CKLF1)对强直性脊柱炎(ankylosingspondyliti,AS)髋关节滑膜成纤维细胞增殖和成骨转化的影响。方法对照组和AS髋关节滑膜组织分别取自我科4例股骨颈骨折和3例重度AS拟行髋关节置换患者。滑膜组织经常规消化后获得单个细胞,并在倒置相差显微镜下进行观察和抗vimentin免疫荧光染色(immunofluorescence,IFC)检测。对上述髋关节滑膜组织及成纤维细胞分别行原位和体外培养,重组腺相关病毒(rAAV)-lacZ、rAAV-hCKLF1转染后21天收集标本。分别采用ELISA、IFC和荧光定量RT-PCR检测细胞增殖、致炎性细胞因子分泌、成骨分化的关键靶基因CKLF1及CCR4的表达。结果第3代正常和AS细胞抗vimentin IFC检测均为阳性,表明分离培养的细胞为成纤维细胞。rAAV-hCKLF1转染后21天,HE染色并计数单位面积下的细胞数、水溶性四氮唑法(WST-1)检测细胞增殖能力和Hoechst 33258检测细胞DNA含量均显示,CKLF1转染促进细胞增殖,且与无病毒转染组、lacZ组相比,差异有统计学意义(P=0.0000,P=0.0260,P=0.0020);正常和AS髋关节滑膜组织及成纤维细胞分泌的致炎性细胞因子(IL-6和TNF-α),均明显升高,且与无病毒转染组、lacZ组相比,差异有统计学意义(P=0.0060、P=0.0020);CKLF1尚能促进AS成纤维细胞表达特异性骨细胞外基质蛋白(OCN和OPN)表达;荧光定量RT-PCR与上述检测结果一致。结论过表达CKLF1促进AS髋关节滑膜成纤维细胞增殖和致炎性细胞因子分泌,增强成骨转化相关靶基因的转录,CKLF1可能在AS关节病理性骨化过程中发挥重要作用。

CC趋化因子受体2在瓣膜间质细胞成骨转化中的作用及其机制

目的探讨CC趋化因子受体2(CCR2)在瓣膜间质细胞成骨转化中的作用及其机制。方法2020年6月东南大学附属中大医院实验室通过胶原酶消化法改良后实施体外分离大鼠瓣膜间质细胞后进行培养、鉴定,并以随机抽签法将细胞分成试验组及对照组。对照组细胞培养基中加入2 ml的RPMI 1640完全培养液,试验组细胞培养基中则加入RPMI 1640完全培养液以及1.0 ng/ml的MCP-1。比较两组细胞中CCR2蛋白表达水平,碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白(BMP)-2蛋白与内参灰度比值,ALP、BMP-2基因与内参灰度比值,采用Pearson法进行相关性的分析。结果试验组细胞中CCR2蛋白表达水平高于对照组(1.549±0.392比0.742±0.257,t=5.444,P<0.05)。试验组ALP蛋白与内参灰度比值明显高于对照组(0.732±0.052比0.189±0.029,t=28.840,P<0.05)。试验组BMP-2蛋白与内参灰度比值明显高于对照组(0.891±0.058比0.401±0.033,t=23.220,P<0.05)。试验组ALP基因与内参灰度比值明显高于对照组(0.248±0.006比0.104±0.003,t=67.882,P<0.05)。试验组BMP-2基因与内参灰度比值明显高于对照组(0.518±0.048比0.198±0.039,t=16.362,P<0.05)。CCR2蛋白表达量与ALP蛋白和内参灰度比值(r=0.513,P<0.05)、BMP-2蛋白和内参灰度比值(r=0.513,P<0.05)、ALP基因和内参灰度比值(r=0.602,P<0.05)、BMP-2基因和内参灰度比值(r=0.616,P<0.05)均呈正相关关系。结论CCR2可促进瓣膜间质细胞向成骨样细胞转化。

非编码RNA调控血管平滑肌细胞成骨样表型转化的研究进展

分化成熟的血管平滑肌主要功能是收缩血管、调节血管周径及血压等.在高磷、高糖、维生素D3、炎症等因素的作用下,平滑肌细胞可转分化为成骨样细胞参与血管钙化的形成,诱发心脑血管不良事件.非编码RNA是经基因转录但不翻译为蛋白质的一类RNA总称,其通过调控多种细胞活动来参与机体的生理和病理过程.已有研究表明,非编码RNA可通过调控血管平滑肌细胞成骨样表型转化影响血管钙化的发生、发展.本文从微小RNA、长链非编码RNA、环状RNA几方面综述非编码RNA在血管平滑肌成骨样表型转化中的调节作用,有助于进一步了解血管钙化的分子机制以及发现防治血管钙化的新靶点.

颅底软骨联合软骨内成骨的研究进展

颅底最初以软骨形式形成，之后通过软骨内成骨转化为骨。随着钙化的进行，骨化中心继续保留着称为软骨联合的软骨带。其在颅底生长发育过程中有重要作用。其发育异常对颅面骨性错牙合畸形的发生发展有重要意义。很多学者对于其发生机制已从基因和细胞水平作了大量研究，本文将此作一综述。

骨不连断端及周围组织骨形态发生蛋白2与核心蛋白多糖的表达

背景:骨形态发生蛋白2和核心蛋白多糖两种因子均具有促进成骨的活性,并有相关报道两者在促进成骨方面相互促进。目的:了解骨不连骨折区不同部位组织骨形态发生蛋白2、核心蛋白多糖的表达情况。方法:11例骨不连患者,骨折持续时间平均11个月。在手术中分类获取骨折端及其周围的组织,包括骨断端、髓腔内容物和贴骨瘢痕,采用免疫组化染色、Real-timePCR检测不同部位组织中骨形态发生蛋白2、核心蛋白多糖的表达。结果与结论:贴骨瘢痕组织骨形态发生蛋白2的表达最高,与骨断端和髓腔内容物组织比较,差异有显著性意义(P<0.05);骨断端组织核心蛋白多糖的表达最高,与髓腔内容物和贴骨瘢痕组织比较,差异有显著性意义(P<0.05)。结果可见骨不连接区组织的抗纤维化和成骨能力的低下,与骨形态发生蛋白2和核心蛋白多糖不能同时高表达有关,因此骨不连区联合注射促成骨因子骨形态发生蛋白2和核心蛋白多糖不但可以促进骨诱导能力的提高,还有可能增强陈旧瘢痕的转化,从而使骨不连的治疗效果更好。

山茱萸总甙干预骨质疏松模型大鼠骨代谢:TRPV6、TRPV5通路的变化

背景:钙离子通道的调控直接影响骨的代谢,但骨代谢与TRPV6、TRPV5通路的联系及相互作用目前尚未明确。研究认为山茱萸具有防治骨质疏松作用。目的:探讨山茱萸总甙调节TRPV6、TRPV5通路表达防治骨质疏松症的机制。方法:健康6月龄雌性SD大鼠50只,体质量(350±15) g,由广州中医药大学实验动物中心提供。随机将大鼠分为5组,即正常对照组,模型组,山茱萸总甙干预低剂量组、中剂量组及高剂量组。除正常对照组外,其余各组大鼠行双侧卵巢切除术建立骨质疏松模型。造模后山茱萸总甙干预各组依剂量每天予药物灌胃,正常对照组及模型组予等量生理盐水灌胃,共12周。实验结束时,双能X射线骨密度仪扫描各组大鼠获取骨密度,取右侧股骨组织RT-PCR检测TRPV6、TRPV5 RNA基因表达情况。结果与结论:(1)山茱萸干预各组大鼠骨密度均较模型组提高(P<0.05);(2)各组大鼠骨组织均有TRPV6、TRPV5表达,其中山茱萸总甙干预各组TRPV6、TRPV5表达均较正常对照组及模型组增加,以中剂量组表达升高最明显,但高剂量组TRPV6/TRPV5倍比关系为最高,成骨效能最好;(3)结果说明,山茱萸总甙可调节骨质疏松大鼠骨组织TRPV6、TRPV5通道蛋白表达,改变TRPV6/TRPV5倍比关系,影响成骨细胞和破骨细胞功能,促进成骨方向的骨代谢转变及提高骨密度。

白藜芦醇抑制血管平滑肌细胞成骨样转化的实验研究

目的研究白藜芦醇(resveratrol,Res)对血管钙化的抑制作用,观察不同浓度的Res对高钙高磷诱导的人脐动脉血管平滑肌细胞(hVSMC)成骨样转化的影响。方法体外培养hVSMC细胞,通过形态学和α-SMA标记进行鉴定。用高钙高磷(钙2.5 mmol/L、磷3.0 mmol/L)培养基诱导hVSMC成骨样转化,通过茜红素染色法鉴定成骨样转化。以普通培养hVSMC作为对照组,加高钙高磷为阳性对照组,实验组为阳性对照加不同浓度的Res(5、10、20μmol/L)干预,培养12 d后,检测各组细胞含钙量,实时荧光定量PCR检测hVSMC成骨样转化相关基因骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、骨形态蛋白(BMP-2)、骨桥蛋白(OPN)的表达水平;Western blotting和免疫荧光标记方法检测BAP、BMP-2、OPN蛋白的表达。结果与对照组比较,阳性对照组细胞内含钙量明显升高约5倍,α-SMA蛋白表达下降,而成骨样细胞特异性标记BAP、BMP-2、OPN mRNA和蛋白质表达均显著升高(P<0.01)。不同浓度Res干预后后,细胞内含钙量下降,BAP、BMP-2、OPN mRNA水平降低(P<0.05、0.01);BMP-2及OPN的蛋白表达显著降低(P<0.01),并与Res浓度呈负相关。结论 hVSMC在高钙高磷条件下发生成骨样转化,而Res抑制此过程的进展并与其浓度呈正相关。

血管外膜细胞钙化及其钙化机制研究

目的:研究经体外诱导钙化建立大鼠血管外膜细胞钙化模型,检测钙化过程中成骨相关指标及凋亡、自噬相关蛋白的表达变化,旨在为心血管疾病模型提供更精确的细胞模型,并初步探讨其钙化机制。方法:原代提取大鼠胸主动脉外膜纤维细胞,取3~6代细胞使用诱导培养基(高糖DMEM+10%胎牛血清+10 mmol/Lβ-甘油磷酸+0.05 mmol/L抗坏血酸+100 mmol/L地塞米松)诱导钙化,诱导时间为3 d、6 d、9 d、12 d、15 d,筛选出诱导细胞钙化的最佳时间。对细胞采用茜素红S染色、细胞内钙含量测定和碱性磷酸酶(ALP)活性检测,鉴定是否成功构建钙化模型。采用实时定量聚合酶链式反应(PT-PCR)检测成骨相关因子骨形态生成蛋白2(BMP2)和核心结合因子α1(Runx2)的mRNA含量,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2和自噬相关蛋白微血管相关蛋白(LC3)、Beclin-1的表达水平,找出血管外膜细胞钙化的潜在机制。结果:当诱导钙化时间为15 d时,血管外膜细胞中主要钙化指标胞内钙含量及ALP活性上调(P<0.05),茜素红S染色显示钙化组有明显钙盐沉积。血管外膜细胞经钙化诱导后,BMP2和Runx2的mRNA水平上调,Bax蛋白水平上调,Bcl-2和Beclin-1蛋白水平下调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调(P<0.05)。结论:钙化诱导培养基培养血管外膜细胞15 d可成功构建钙化细胞模型,血管外膜细胞钙化可能与细胞向成骨样表型转化有关,血管外膜细胞钙化过程涉及细胞自噬及凋亡调控。

镁对人血管平滑肌细胞钙化的作用

目的:研究镁对高钙高磷诱导的人血管平滑肌细胞(hVSMC)钙化的影响。方法:无菌条件下提取胎儿脐动脉平滑肌细胞,分为正常对照组(A组)、高钙高磷组(B组)、高钙高磷+硫酸镁组(C组)。B组、C组培养3d后,部分(B1组、C1组)继续高钙高磷培养液培养,部分(B2组、C2组)换用普通培养液培养。于12h、24h、72h、第4、第7、第10天测定细胞层钙含量,并采用Western blot法测定核心结合因子1(cbfa1)、磷酸核糖焦磷酸合成酶2(Prps2)蛋白表达水平。结果:B组钙含量升高,C组较B组、C1组较B1组、C2组较B2组,钙含量均明显下降(P<0.05)。Western blot结果显示,12h、24h、72h B组Cbfa1表达升高,C组表达降低(P<0.05);第4、第7、第10天,C1组较B1组、C2组较B2组,Prps2表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:高钙高磷促进hVSMC钙化,镁抑制了hVSMC钙化进展,激活了Prps2蛋白表达,促进了钙化消退。

血管平滑肌细胞内质网应激与血管钙化的研究进展

血管钙化是指羟基磷灰石沉积于血管壁,由多因素参与及调控,类似于骨、软骨形成的主动生物学过程。内质网应激是机体内适应性调节反应,适当的内质网应激帮助维持内质网稳态,但过度的内质网应激会促进血管钙化的发生与发展。本文综述内质网应激尤其是未折叠蛋白反应在血管钙化中的潜在作用和分子机制,希望为血管钙化的防治提供新的思路。

冠状动脉钙化调控机制及评估技术的研究进展

血管钙化广泛存在于心血管疾病、糖尿病等疾病中,是导致心血管并发症的重要因素。随着钙化评估和诊断技术的发展,钙化过程为主动炎症过程的观点逐渐被接受,而调控冠状动脉钙化(CAC)的信号通路也被进一步探索。CAC的评估技术在不断革新,以期更清晰地显示斑块结构,评估斑块的钙化程度及预测术后并发症的风险。该文主要对CAC的分子调控机制及相关评估技术的研究进展作一综述,旨在结合目前的检测技术更好地识别病变,全面了解CAC的发生发展过程。

miRNA-205在慢性肾脏病患者血管钙化中的作用及诊断价值

目的探讨miRNA-205在慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者血管钙化中的作用及诊断价值。方法该研究分为体外细胞实验和回顾性队列研究。采用大鼠胸主动脉平滑肌细胞进行体外实验,茜素红染色法、钙含量检测血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的钙化情况,碱性磷酸酶检测试剂盒测定碱性磷酸酶活性,Western印迹检测VSMCs成骨转录因子Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及平滑肌22α蛋白(smooth muscle 22α,SM-22α)的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测VSMCs中miRNA-205和Runx2的表达含量。双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-205与Runx2的靶向关系。回顾性选择2020年6月至2021年1月河北医科大学第四医院肾内科的CKD 3~5期非透析患者,并按照冠状动脉钙化积分(coronary artery calcium score,CACs)将患者分为无钙化组(CACs=0)、轻中度钙化组(0400)。采用Spearman相关分析法评价血清miRNA-205、Runx2与CKD患者血管钙化的相关性,Logistic回归模型及受试者工作特征曲线分析miRNA-205预测CKD患者血管钙化的价值。结果(1)与对照组相比,高磷组VSMCs钙结节较多,钙含量、碱性磷酸酶活性、Runx2蛋白表达均显著较高,α-SMA、SM-22α蛋白及miRNA-205表达水平均较低(均P<0.05)。过表达miRNA-205时,VSMCs钙化减轻,α-SMA和SM22α蛋白表达水平均升高,Runx2蛋白表达水平降低(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miRNA-205-5p过表达后野生型Runx23’端非编码区质粒荧光素酶活性降低。(2)纳入CKD患者80例,年龄(57.50±14.93)岁,其中男性49例(61.3%)。无钙化组(n=26)、轻中度钙化组(n=30)和重度钙化组(n=24)患者miRNA-205和Runx2表达水平比较结果显示,钙化程度越高,miRNA-205表达水平越低,Runx2 mRNA表达水平越高(均P<0.05)。血清miRNA-205与CACs呈负相关(r=-0.50,P<0.01),Runx2与CACs呈正相关(r=0.55,P<0.01)。多因素Logistic回归分析结果显示,miRNA-205(OR=0.451,95%CI 0.122~0.873)是CKD患者发生血管钙化的独立影响因素。miRNA-205和miRNA-205联合Runx2预测血管钙化的受试者工作特征曲线下面积分别为0.796(95%CI 0.697~0.859)和0.924(95%CI 0.866~0.982)。结论miRNA-205通过靶向Runx2负向调控VSMCs成骨样表型转化进而抑制血管钙化,有望成为早期诊断CKD患者血管钙化的生物标志物。

松油烯-4-醇通过改善线粒体动力学抑制血管平滑肌细胞钙化

本研究旨在探讨松油烯-4-醇(terpinen-4-ol,T4O)对高糖(high glucose,HG)诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)钙化的作用及机制。研究T4O对HG诱导的VSMC钙质沉积、成骨表型转化及线粒体动力学的作用。采用线粒体动力相关蛋白Drp-1(dynamin-related protein 1,Drp-1)抑制剂Mdivi-1分析线粒体动力学和VSMC钙化之间的相关性以及T4O的作用。采用茜素红S染色观察钙盐沉积,流式细胞术检测细胞内Ca^(2+)含量;Western blot、免疫荧光检测表型转化相关标志物[α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)和Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)和线粒体动力学相关标志物[线粒体融合蛋白1(mitofusin1,MFN1)、线粒体融合蛋白2(mitofusin2,MFN2)和Drp-1]的表达。结果显示,T4O低、高剂量能够不同程度抑制HG诱导的α-SMA、MFN1、MFN2表达水平的下调,抑制BMP2、Runx2、Drp-1表达水平的上调,减少细胞内Ca^(2+)含量和钙盐沉积,有效抑制HG诱导的VSMC钙化和线粒体动力学紊乱。T4O组、Mdivi-1组、T4O+Mdivi-1组能够上调HG诱导的α-SMA、MFN1、MFN2的表达水平,下调BMP2、Runx2、Drp-1的蛋白表达水平,抑制钙盐沉积,且T4O组与T4O+Mdivi-1组上述指标无明显差异。上述研究结果表明,松油烯-4-醇能够抑制Drp-1的表达水平,调节线粒体动力学紊乱,抑制HG诱导的VSMC钙化。