大鼠正畸牙移动牙周组织中叉头框蛋白O1和成骨特异转录因子RUNX2的表达

目的:检测大鼠正畸牙移动牙周组织中叉头框蛋白O1(forkhead box O1,Fox O1)和Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)的表达变化,初步探讨Fox O1和Runx2在正畸牙移动牙周组织改建中的作用及相互关系。方法:将40只8周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为5组,建立正畸牙移动模型,以上颌左侧加力的第一磨牙为实验侧,右侧不加力的第一磨牙为对照侧。分别加力1、3、5、7、14 d后处死大鼠,解剖分离出含有第一磨牙的牙槽骨制备标本,进行苏木精-伊红(H-E)染色和Fox O1、Runx2免疫组织化学染色,利用Image Pro Plus图像分析系统对染色后的切片做定量分析,采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学处理。结果:Fox O1在牙周膜主要表达于成骨细胞及成牙骨质细胞中,Runx2主要表达于成骨细胞、成纤维细胞及成牙骨质细胞中。实验组加力后,大鼠牙周组织中Fox O1和Runx2的表达增强,在3~5 d内达到峰值,而后表达降低;14 d时与对照组相比无显著差异(P>0.05),其余组与对照组相比均有显著差异(P<0.05)。结论:Fox O1和Runx2参与了正畸牙移动中的牙周组织改建,且主要参与了成骨细胞和骨形成的过程。

miR-21对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响

目的探讨miR-21对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)增殖及成骨的影响,旨在为干细胞治疗牙周炎提供实验基础。方法酶解组织块法分离培养hPDLSCs,通过流式细胞仪检测表面分子CD34、CD45、CD90、CD105对hPDLSCs进行鉴定,采用Lipofectamine 2000将miR-21的mimics(pre-miR-21)、inhibitor(anti-miR-21)以及各自的阴性对照转染至hPDLSCs。实验分组:过表达组(mimics组)、过表达阴性对照组(mimics-NC组);抑制阴性对照组(inhibitor-NC组)、抑制组(inhibitor组)。实时荧光定量PCR检测miR-21转染效率;CCK-8、流式细胞术检测hPDLSCs的增殖;茜素红染色检测hPDLSCs的成骨能力和Western blot检测成骨相关基因Runx2的蛋白表达。结果miR-21的mRNA表达量mimics组较mimics-NC组明显升高,inhibitor组较inhibitor-NC组明显降低(P<0.05)。hPDLSCs增殖及S期细胞比例mimics组较mimicsNC组升高,inhibitor组较inhibitor-NC组减少,差异有统计学意义(P<0.05)。经茜素红染色后,mimics组矿化结节多于mimics-NC组;inhibitor组矿化结节少于inhibitor-NC组;Western blot检测mimics组Runx2蛋白表达高于mimics-NC组,inhibitor组Runx2蛋白表达量较inhibitor-NC组减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-21调控hPDLSCs的增殖和成骨向分化。

高糖环境下GATA4通过调节RUNX2影响成骨细胞增殖分化的研究

目的:探讨高糖环境下GATA锌指转录因子蛋白4(GATA4)对成骨细胞增殖分化的影响,及对转录因子蛋白2(Runx2)的调控作用。方法:取MC3T3-E1成骨细胞,在高糖(25 mmoL/L)的条件下分别培养1 d、4 d、7 d、14 d,免疫印迹法(Western blotting)法检测GATA4、Runx2蛋白表达水平。将MC3T3-E1成骨细胞分为空白对照组、高糖诱导组、GATA4过表达腺病毒(Ad-GATA4)组、GATA4空载腺病毒组(Ad-eGFP)组,CCK-8法检测各组细胞的存活率,碱性磷酸酶(ALP)染色法及茜素红染色法检测细胞分化能力;Western blot法检测各组细胞GATA4、Runx2、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、骨唾液蛋白(BSP)蛋白表达水平。共转染Ad-GATA4及Runx2干扰腺病毒(Ad-si-Runx2),将MC3T3-E1成骨细胞分为Ad-GATA4-si-Runx2组、AdGATA4-eGFP2组、Ad-eGFP-si-Runx2组、Ad-eGFP-eGFP2组及未转染组(高糖组),高糖条件下培养7 d后检测GATA4、Runx2、OSX、BSP蛋白表达水平。结果:随着高糖培养时间延长,细胞中GATA4、Runx2蛋白表达持续降低,在第7天降低至最低,选取高糖培养7 d为后续培养条件。转染Ad-GATA4后,与空白对照组比较,高糖诱导组细胞矿化结节形成较少,细胞存活率、ALP活性、GATA4、Runx2蛋白表达、OSX、BSP蛋白表达降低(P<0.05);与高糖组相比,Ad-GATA4组细胞矿化结节形成较多,细胞存活率、ALP活性、GATA4、Runx2蛋白表达、OSX、BSP蛋白表达升高(P<0.05),Ad-eGFP组与高糖诱导组相比上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。Ad-GATA4与Ad-si-Runx2共转染后,与高糖诱导组相比,Ad-GATA4-eGFP2组细胞GATA4、Runx2、OSX及BSP蛋白表达升高(P<0.05);Ad-eGFP-si-Runx2细胞Runx2、OSX及BSP蛋白表达降低(P<0.05),GATA4蛋白表达变化差异无统计学意义(P>0.05)。与Ad-GATA4-eGFP2组比较,Ad-GATA4-si-Runx2细胞Runx2、OSX及BSP蛋白表达降低(P<0.05),GATA4蛋白表达变化差异无统计学意义(P>0.05)。结论:高糖可抑制成骨细胞增殖分化,伴随GATA4、Runx2蛋白表达降低。过表达GATA4则可促进成骨细胞在高糖环境中的增殖、分化,其可能与激活Runx2表达有关。

miR-214抑制牙囊细胞成骨分化的体外研究

目的探讨miR-214对于牙囊细胞(dental follicle cells,DFCs)成骨分化的影响。方法双向差速传代法体外培养提纯牙囊细胞,以未转染的DFCs为对照(DFCs组),通过向DFCs中转染miR-214-3p mimics(miR-214 mimics组)或miR-214-3p inhibitor(miR-214 inhibitor组)分别上调和下调DFCs中的miR-214的表达。成骨诱导7 d,qRT-PCR检测miR-214表达及相关成骨基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨粘连蛋白(osteonectin,OSN)、成骨相关转录因子2(runt-related transcription factor-2,RUNX-2)的mRNA表达,免疫蛋白印迹检测各组RUNX-2、β-catenin蛋白表达;成骨诱导14 d茜素红染色观察矿化结节形成的情况。结果骨诱导7d,相较DFCs组,miR-214 mimics组miR-214的表达上调,miR-214 mimics组成骨相关基因ALP、OSN及RUNX-2的mRNA表达均低于DFCs组,但仅ALP在两组的差异具有统计学意义(P>0.05),而miR-214 inhibitor组成骨相关基因ALP、OSN、RUNX-2的mRNA表达均高于DFCs组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。miR-214mimics组RUNX-2、β-catenin的蛋白表达均低于miR-214 inhibitor组。miR-214 mimics组钙化结节明显少于DFCs组,而miR-214 inhibitor组钙化结节却明显多于DFCs组。结论miR-214上调可使β-catenin表达下调,并抑制成骨相关基因ALP、OSN及RUNX-2的表达,抑制成骨分化;下调miR-214,结果相反;miR-214可能是通过下调β-catenin的表达,抑制DFCs的成骨分化。

左旋肉碱经Runx2/COL1A1通路抑制老年鼠肿瘤恶液质的骨骼肌纤维化

目的探讨左旋肉碱经Runx2/COL1A1通路抑制老年鼠肿瘤恶液质的骨骼肌纤维化。方法用结肠癌MC38细胞在C57老年鼠右侧腹股沟皮下植瘤构建肿瘤恶液质模型,实验分为非荷瘤组、荷瘤组和左旋肉碱组,并进行相应干预。实验结束后取一侧腓肠肌称重,行苏木精‑伊红染色(HE染色)和Masson染色后,分别测量腓肠肌横截面积和胶原纤维面积占比;对侧腓肠肌提取总蛋白,蛋白质印迹法检测Runx2和COL1A1蛋白水平。体外实验用转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导NIH/3T3细胞,建立体外纤维化模型,经左旋肉碱干预后,分别提取总蛋白和mRNA,蛋白质印迹法检测Runx2和COL1A1蛋白水平,并用qRT‑PCR检测COL1A1 mRNA水平,转染cDNA‑Runx2验证左旋肉碱通过Runx2调控COL1A1。结果三组进行比较,荷瘤组腓肠肌重量明显低于非荷瘤组[(98.12±17.04)mg比(122.18±6.91)mg](P<0.05);荷瘤组腓肠肌横截面积(207.46±54.55)μm^(2)显著低于非荷瘤组(488.61±46.72)μm^(2)和左旋肉碱组(434.54±113.84)μm^(2)(P<0.05);胶原纤维面积占比荷瘤组(9.69±1.55)%明显高于左旋肉碱组(5.48±1.19)%和非荷瘤组(3.88±0.86)%(P<0.05)。蛋白质印迹法结果显示,与其他两组相比,荷瘤组Runx2和COL1A1高表达(P<0.05)。体外研究表明,左旋肉碱可逆转TGF‑β1诱导的Runx2蛋白和COL1A1 mRNA高表达。过表达Runx2结果证实左旋肉碱通过抑制Runx2蛋白的表达下调COL1A1 mRNA。结论左旋肉碱通过降低Runx2/COL1A1改善老年鼠肿瘤恶液质的骨骼肌纤维化。

Runx2,Osterix及MMP-13在大鼠激素性股骨头无菌性坏死组织中的表达及意义

目的探讨Runx2,Osterix及MMP-13蛋白及基因在大鼠激素性股骨头无菌性坏死组织中的表达。方法40只成年Wistar大鼠随机分为模型组(30只)和对照组(10只)。模型组大鼠接受地塞米松20 mg/kg肌肉注射,1次/周,注射后,在跑步机上对动物进行训练。模型组根据训练时间分为3组(各10只):A组8周;B组10周;C组12周。采用PCR和Western blot方法检测大鼠股骨头组织中基因及蛋白变化。结果模型组大鼠脂肪细胞最大直径、空骨陷窝率高于对照组,且随着训练时间的增加,脂肪细胞最大直径、空骨陷窝率逐渐增加,差异具有统计学意义(P<0.00);模型组骨小梁面积低于对照组,且随着训练时间的增加,骨小梁面积逐渐降低,差异具有统计学意义(P<0.00)。模型组大鼠Runx2,Osterix蛋白与基因表达量低于对照组,且随着时间的延长,表达量逐渐降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠MMP-13蛋白与基因表达量高于对照组,且随着时间的延长,表达量逐渐增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论激素性股骨头坏死组织中Runx2,Osterix在mRNA和蛋白表达水平均低于正常股骨头组织,MMP-13高于正常股骨头组织。

成骨微环境中低剂量射线对成骨细胞的影响

目的 观察成骨诱导微环境中低剂量X射线对成骨细胞的影响.方法 照射后分别检测细胞增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性、细胞矿化、成骨特异性转录因子2（Runx2）、骨钙素（0C）的mRNA和蛋白表达.结果 1.0Gy组与对照组比较增殖受到抑制（P ＜0.05）;ALP活性在0.1Gy组[（5.88 ±0.14） nmol对硝基苯磷酸二钠（pNPP）/μg蛋白]与对照组[（4.75±0.05） nmol pNPP/μg蛋白]比较升高（P＜0.05）;矿化定量0.1Gy组（6.57±0.20）与对照组（5.39±0.28）比较升高（P＜0.05）;诱导组Runx2基因0.1 Gy组（5.51±1.52）与对照组（2.43±0.3）比较升高（P＜0.05）,OC基因0.1 Gy组（2.92±1.34）与对照组（1.03±0.41）比较升高（P＜0.05）;诱导组Runx2蛋白表达0.1 Gy组（0.84±0.03）高于对照组（0.44 ±0.02,P＜ 0.05）,OC蛋白表达0.1 Gy组[（427.7±64.2）ng/L]高于对照组[（278.9±53.7） ng/L,P＜0.05].结论 成骨诱导微环境在低剂量射线促进成骨细胞的分化和矿化中起重要呈递作用.