应用表达谱芯片技术对截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原截短型中蛋白(MHBst)的反式调节基因.方法:构建MHBst基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-MHBst,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-MHBst转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染MHBst后,有37条差异基因表达,其中14条基因表达增强,23条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式调节基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的初步研究

目的 探讨乙型肝炎病毒 (HBV )表面抗原中蛋白羧基末端缺失突变体 (MHBst)的反式激活功能。方法 用聚合酶链反应 (PCR)扩增截短的HBV表面抗原中蛋白 (MHBst167)基因 ,克隆至真核表达载体 pcDNA3 .1(-)中 ,转染COS 7细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞MHBst167蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒 pSV lacZ共转染COS 7细胞 ,检测 β 半乳糖苷酶的活性。 结果 构建成含有约 5 0 0bp基因的质粒 pcDNA3 .1(-) Mt ,在COS 7细胞表达出相应蛋白 ,对pSV lacZ的表达具有反式激活作用。 结论 构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达 ,并具有反式激活功能。

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的研究

0引言 乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生、发展过程密切相关[1-5].

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活基因1的克隆化研究

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)羧基末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)的反式激活作用,利用差异显示技术,筛选克隆MHBst蛋白的反式激活作用的靶基因,发现新型基因,为阐明MHBst对于肝细胞表达基因谱的影响,探索新的研究方向。方法:利用多聚酶链反应技术(PCR)扩增MHBst的编码基因片段,构建真核表达载体pcDNA3.1-MHBst,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与仅转染空白载体pcDNA3.1的HepG2细胞进行差异显示,利用抑制性消减杂交技术(SSH)克隆鉴定MHBst的反式激活作用的靶基因,通过生物信息学技术,确定新基因的序列,设计序列特异性引物,利用HepG2细胞来源的mRNA进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,克隆新基因,并对于新基因的序列以及编码基因产物序列进行分析。利用生物信息学技术确定TTP1基因是新基因。结果:构建表达载体pcDNA3.1-MHBst,经过序列分析和酶切鉴定正确。转染HepG2细胞系,利用SSH技术获得差异表达的基因片段。经对于美国生物工程信息学中心(NCBI)建立的核苷酸序列的数据库(GenBank)检索,证实这是一个新型基因片段。通过对于同源基因序列的比对,根据Kozak规则和终止密码子下游的多聚腺苷酸信号序列,确定新基因的序列,将这种MHBst反式激活的新基因命名为TTP1,并在GenBank中注册登录。结论:克隆并鉴定了乙型肝炎病毒羧基末端截短型表面抗原中蛋白反式激活作用的新型靶基因TTP1,为今后研究MHBst的反式激活作用,开辟了新的研究方向和可能。

乙型肝炎病毒表面抗原一级结构多态性的初步研究

目的 研究慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原一级结构的多态性。方法 设计特异性引物 ,自 7例慢性乙型肝炎患者血清中扩增S基因全长或全基因组片段 ,TA克隆法克隆到T载体中 ,随机选择克隆测序。结果 共 2 0个克隆被测序。 2 0个克隆全S蛋白的总一致率仅为 3 2 .0 % ,13株全长为 40 1氨基酸残基的克隆氨基酸一致率为 82 .5 %。患者血清中发现2株克隆编码截短型表面抗原中蛋白 ,在前S1或前S2的免疫决定区或可能的肝细胞结合部位均发现缺失突变。结论 慢性乙肝患者体内存有HBV准种群 ,病毒编码的截短型表面抗原中蛋白可为HBV诱导原发性肝癌提供一种途径 ,应加强对HBsAg一级结构多态性的研究。

表达乙型肝炎病毒表面抗原的非复制型重组痘苗病毒疫苗株RVJ123ΔCK的构建及其生物学性状鉴定

利用重组质粒 pNeo-CK与 pNeo-CKLacZ和表达乙型肝炎 (乙肝 )病毒S抗原的重组痘苗病毒RVJ12 3[1] ,构建了非复制型重组痘苗病毒RVJ12 3ΔCK。Southernblot证实 ,非复制型重组病毒RVJ12 3ΔCK基因组C和K片段间与宿主范围和毒力相关的基因稳定缺失 ,同时 ,J片段中插入的乙肝S抗原基因稳定存在。重组病毒RVJ12 3ΔCK在鸡胚成纤维母细胞中可良好繁殖 ,而在人源细胞系中不繁殖或仅低度繁殖 ,但都能表达HBsAg ,并且在病毒一个复制周期内 ,复制型和非复制型病毒HBsAg表达水平无明显差别。

乙肝病毒截短型表面抗原中蛋白与X蛋白对肾小管上皮细胞核转录因子的影响

目的:目的研究167例乙肝病毒截短型表面抗原中蛋白(C-terminally truncated middle size surface proteins,MHBst167)和X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对肾小管上皮细胞核转录因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)活化的影响及其相关机制探讨。方法:肾小管上皮细胞系(HK-2)转染mhbst167或(和)hbx后,蛋白印迹法检测NF-κB核易位及其抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor-kappa B,IκBα)磷酸化水平的变化,凝胶电泳迁移率和双萤光素酶报告基因分析进一步检测NF-κB活性;通过对蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性和细胞外调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化水平检测探讨NF-κB活化的机制。结果:HK-2细胞转染mhbst167或(和)hbx基因后,NF-κB核易位、磷酸化IκBα、κB结合活性及κB基因转录均增加(P<0.05);且PKC激酶活性和磷酸化ERK水平也增加(P<0.05),而Raf蛋白均无表达。结论:在肾小管上皮细胞中,MHBst167/HBx可能通过PKC/ERK通路(非Raf依赖性)活化NF-κB。

乙型肝炎表面抗原基因重组2型腺相关病毒的免疫原性研究

目的观察含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的2型重组腺相关病毒(rAAV-2-HBsAg)在Balb/c小鼠体内的免疫原性。方法以5×1011的重组病毒颗粒单次注射Balb/c小鼠,RT-PCR扩增肝脏组织中HBsAg基因cD-NA:ELISA检测肝组织中HBsAg的表达;RIA法检测血清中表面抗体(抗一HBs)滴度;51Cr释放分析检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果外源性HBsAg基因己整合到肝细胞染色体DNA并有效地转录和翻译,表达水平最高可达33.8pg/(mglivertissue),rAAV-HBsAg免疫小鼠后可以诱导机体产生表面抗体并激发特异性CTL。结论外源性HBsAg基因可以转移到小鼠肝细胞并稳定表达;rAAV-2-HBsAg免疫小鼠可以同时诱导体液和细胞免疫反应的出现。提示基于rAAV-2载体的乙型肝炎(HBV)疫苗,对于防止HBV感染,尤其是作为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗可能只有潜在的应用价值,值得做进一步的系统研究。

乙型肝炎病毒S基因与截短C基因融合的穿梭表达载体的构建

研究目的是构建HBVS基因和截短C基因融合的胞壁型和分泌型大肠杆菌和分枝杆菌(E.coli-BCG)穿梭质粒。采用PCR方法从结核分枝杆菌MTB毒株H37Rv的基因中扩增出相对分子质量为19000的抗原胞壁区及其上游调控元件基因,克隆入穿梭载体pOLYG中。以含HBV基因组的质粒pCP10序列为模板,PCR扩增获得S基因片段Sw和C基因编码氨基端的部分基因片段Ct,克隆入胞壁型穿梭表达载体pCW和分泌型穿梭表达载体pDE22。经酶切和序列测定证实,胞壁型和分泌型载体pCW-Sw-Ct和pDE22-Sw-Ct构建成功。为进一步研究含S基因和截短C基因融合的重组BCG活疫苗奠定了基础。

羧基末端截短型乙型肝炎病毒X蛋白在肝细胞癌与癌旁组织中的表达及其在术后预后中的作用

目的探讨肝细胞癌(HCC)患者肝癌组织和癌旁组织中羧基末端截短型乙型肝炎病毒X蛋白(Ct-HBx)的表达及其与患者术后预后的关系。方法采用免疫组织化学染色法检测462例肝癌组织、配对的263例癌旁组织和配对的25例癌栓组织中Ct-HBx蛋白的表达,分析其与临床病理参数的关系,探讨Ct-HBx蛋白的表达与HCC患者术后预后的关系。结果 Ct-HBx蛋白表达在配对的263例肝癌组织和癌旁组织中阳性率分别为43.73%(115/263)和11.79%(31/263);多因素Cox风险回归模型分析结果显示年龄、门静脉癌栓(PVTT)、术前天冬氨酸转氨酶(AST)、术前甲胎蛋白(AFP)、主瘤旁微小子灶、术前巴塞罗那临床肿瘤(BCLC)分期和术后抗病毒治疗是HCC患者术后复发的独立危险因素(P均<0.05),门静脉癌栓、术前AFP、肿瘤包膜、术前BCLC分期和Ct-HBx蛋白表达是HCC患者术后生存的独立危险因素(P均<0.05)。在263对配对样本中,肝癌组织中Ct-HBx蛋白的表达与性别、糖类抗原19-9(CA19-9)、术后抗病毒治疗有关(P均<0.05)。肝癌组织和癌旁组织中Ct-HBx蛋白均为阴性表达的患者术后3年无瘤生存率高于Ct-HBx蛋白在肝癌组织阴性表达且在癌旁组织阳性表达的患者(P=0.050 1)。结论当HCC患者肝癌组织中Ct-HBx蛋白表达呈阴性时,癌旁组织中Ct-HBx蛋白的表达情况可能与术后预后有关,可作为预测术后肿瘤生存和复发的标志物。

乙型肝炎病毒相关性肾炎肾组织中HBx、MHBs^t mRNA的表达及其意义

目的:检测乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBVGN)肾组织中乙型肝炎病毒X基因(HBx)及截短型乙型肝炎病毒表面抗原(MHBst)mRNA的表达,探讨HBx、MHBst在HBVGN发生中的意义。方法:采用原位杂交的方法对40例HBVGN患者的肾组织进行HBx、MHBst mRNA检测。结果:HBVGN患者肾组织中存在HBx、MHBst mRNA,HBx、MHBst mRNA主要分布于肾小管上皮细胞的胞质内,少数肾小球上皮、内皮、系膜细胞的胞质内也有分布;肾小管上皮细胞内HBx、MHBst mRNA阳性率分别为82.5%(33/40)、80%(32/40),肾小球内HBx、MHBst mRNA阳性率分别为30%(12/40)、22.5%(9/40),HBx、MHBst mRNA在肾小管上皮细胞的表达明显高于肾小球(P<0.01)。结论:在HBVGN肾组织,特别是在肾小管上皮细胞的胞质存在HBx、MHBst mRNA的表达,提示HBV感染及其基因整合可能在HBVGN发生中有一定意义。

血清病毒学标记物预测慢性乙型肝炎肝组织病理状态的评价

目的评价血清病毒学标记物预测慢性乙型肝炎(CHB)肝组织病理状态的有效性。方法 CHB患者211例,其中HBe Ag阳性和阴性患者分别为125例和86例。血清HBs Ag、HBe Ag、抗-HBc和HBcr Ag分别采用化学发光微粒子免疫法和化学发光酶免疫法检测,血清HBV DNA采用实时荧光定量PCR检测。结果 HBe Ag阳性患者,血清HBs Ag、HBe Ag、HBcr Ag、HBV DNA与病理学分级和分期均呈显著负相关(P<0.05);血清抗-HBc与病理学分级和分期均呈显著正相关(P<0.05);HBe Ag阴性患者,血清HBs Ag、抗-HBc与病理学分级和分期无显著相关性(P>0.05);血清HBcr Ag、HBV DNA与病理学分级和分期均呈显著正相关(P<0.01)。有序logistic回归分析显示,HBe Ag阳性患者,血清HBs Ag预测病理学分级和HBs Ag、HBe Ag预测病理学分期的偏回归系数有统计学意义(P<0.05);HBe Ag阴性患者,血清HBcr Ag和HBV DNA预测病理学分级和分期的偏回归系数均有统计学意义(P<0.05)。结论血清HBs Ag和血清HBs Ag、HBe Ag分别有预测HBe Ag阳性患者肝组织病理学分级和分期的价值,血清HBcr Ag和HBV DNA均有预测HBe Ag阴性患者肝组织病理学分级和分期的意义。

羧基末端截短的HBV表面抗原中蛋白反式激活c-myc表达

目的构建羧基末端截短的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst)反式激活基因的消减文库,并观察其对细胞原癌基因c-myc的反式激活作用。方法以重组表达质粒pcDNA3.1(-)-MHBst和空载体pcDNA3.1(-)瞬时转染HepG2细胞,提取细胞mRNA并逆转录为cDNA,分别标记为实验组与对照组,应用抑制性消减杂交技术,构建MHBst反式激活的cDNA消减文库。针对其中的原癌基因c-myc,进一步克隆其启动子序列并构建报告基因表达载体pCAT3-c-myc,与pcDNA3.1(-)-MHBst共转染HepG2细胞,ELISA法检测报告基因氯霉素乙酰转移酶CAT的表达活性。同时,应用反转录聚合酶链反应和免疫印迹方法检测表达MHBst的细胞中c-myc基因的mRNA转录和蛋白表达水平。结果随机挑选消减文库中的50个阳性克隆进行测序和生物信息学分析,显示19种已知功能基因,涉及细胞代谢、信号转导、细胞凋亡和肿瘤发生等生物学过程。细胞内瞬时表达的MHBst蛋白能够反式激活细胞原癌基因c-myc启动子的转录活性,并且RT-PCR和Western blotting结果也证明了表达MHBst蛋白的细胞中原癌基因c-myc的表达水平明显增强。结论成功构建MHBst反式激活基因的消减文库,MHBst可以反式激活细胞原癌基因c-myc的表达,为深入了解乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制提供理论基础。

猪圆环病毒2型截短的衣壳蛋白的表达和抗原特征

设计三对特异性引物扩增F2—1．F2-2和XF2—2截短猪圆环病毒2型（PCV-2）衣壳蛋白基因。扩增序列分别克隆到pET-32a（＋）载体，并在Rosetta（DE3）大肠杆菌中IPTG诱导表达。融合蛋白可与猪圆环病毒2型抗体和His—XF2—2反应。

乙型肝炎病毒核心质粒的构建及原核表达

目的 构建乙型肝炎病毒核心区原核表达质粒并进行原核蛋白表达、纯化和鉴定。方法 应用基因工程技术将编码截短型乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcAg 1～14 4aa)的基因片段装入原核表达载体pRSET B内,在宿主菌B12 1(DE3 )plysS内进行诱导表达,运用Ni NTA方法纯化目的蛋白。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)及Westernblot检测蛋白的灵敏度和特异性。结果 成功地构建了含截短型乙型肝炎病毒核心区基因的质粒,并纯化得到了分子量约为19.5kD的目的蛋白。结论 本方法所获得的重组截短型乙型肝炎病毒核心抗原(1～14 4a)纯度高,免疫反应性强。

乙型肝炎病毒的血清学基因分型及亚型

目的 :探讨长春地区HBsAg阳性的慢性肝病患者HBV的基因型及亚型分布特点。方法 :应用新开发的ELISA ,检测HBV基因组PreS2区表达的产物b、u、m、k、s、f、g ,产物的不同组合代表不同的基因型。亚型的检测用已知的免疫学方法进行。结果 :长春地区HBV基因型以C型为主 ,亚型以adr为主。结论 :血清学方法基因分型简单经济 ,不必进行繁琐的基因测序 ,适于大规模研究。

乙肝患者乙肝三系、乙型肝炎病毒的脱氧核糖核酸检测的临床意义

乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）是引起乙型病毒性肝炎的病原体。我国乙型肝炎表面抗原（hepatitis Bsllrface antigen，HbsAg）阳性有1．2亿人，慢性乙型病毒性肝炎2000万～3000万人，其中每年约30万人进展到肝硬化、肝癌。严重损害了人民的身体健康。然而HBsAg（＋）并不代表着疾病的活动和需要治疗，作为基层的医生，掌握患者的最佳治疗时机尤为重要。本次研究乙肝三系、HBV—DNA检测，结合肝功能和影像学检查的临床意义。现报道如下。

乙型肝炎病毒感染患儿的家庭预防及护理

小儿感染乙型肝炎病毒后,大多表现为无黄疸型肝炎、亚临床型肝炎和乙肝表面抗原携带者。由于多数患儿临床症状不重,感染后不易被发现,成为传染源散杂在健康人群中,造成控制乙型肝炎病毒流行上的困难。小儿感染HBV后,除少数于短期内产生血抗HBS抗体而结束HBV感染外,大多病程迁延。

乙肝病毒表面抗原和抗体双阳性者中病毒S区基因序列分析

为了解乙肝病毒 (HBV)表面抗原和抗体双阳性患者中病毒的基因型及其HVBS区是否有变异。用放射免疫试剂检测HBsAg阳性样品中的抗 HBs抗体 ,用聚合酶链反应法检测双阳性样品中的HBVDNA ,然后对阳性样品进行克隆和基因序列分析 ,并将所得序列与HBV不同基因型的代表株进行比较分析。结果显示 389例HBsAg阳性样品中有 10例为抗HBs抗体阳性 ;该 10例双阳性样品中有 5例为HBVDNA阳性 ;序列分析显示该 5株HBV均为B基因型 ,其中 4株为adw亚型 ,1株为adr亚型 ;其中有 2株在S区的“a”