刚地弓形虫SRS29C截短型基因的克隆及原核表达质粒的构建

为构建刚地弓形虫SRS29C基因原核表达质粒,利用SignalP-5.0软件预测信号肽序列,去除SRS29C前端信号肽序列,设计引物并扩增SRS29C截短型基因序列,克隆并构建原核表达质粒。结果显示:SRS29C基因前51位氨基酸为信号肽区域,故将此段信号肽序列切除,获得长度为966bp的SRS29C截短型基因片段(SRS29Ccut),成功构建原核表达质粒p ET-28a-SRS29Ccut和p ET-32a-SRS29Ccut。此研究为今后对刚地弓形虫SRS29C蛋白的生物学功能及免疫特性进行更深入研究打下基础。

C基因截短型HBV载体的复制、包装与表达

目的 探索C基因截短型重组HBV载体的复制、包装和表达。方法 采用分子克隆、定点突变技术构建C基因截短型HBV载体 ;瞬时转染HepG2细胞 ,在荧光显微镜下观察外源目的基因绿色荧光蛋白 (GFP)的表达 ;提取转染细胞胞内、胞外DNA分别进行半巢式聚合酶链反应 (PCR)、非变性凝胶电泳杂交技术、southernblot杂交定量分析及常规PCR等分析 ,检测重组HBV载体的复制、包装及子代病毒的生成。结果 经酶切鉴定 ,C基因截短型HBV载体构建成功 ;转染HepG2细胞 ,外源目的基因能够高效表达 ;在辅助载体的辅助下 ,C基因截短型HBV载体能够在肝细胞进行复制 ,包装 ,通过定量分析 ,C基因截短型HBV载体的包装效率比C基因非截短型HBV载体提高 4～ 8倍 ;另外 ,C基因截短型HBV载体可以在辅助载体的辅助下包装成携带外源目的基因的子代病毒颗粒分泌到胞外。结论 C基因部分截短不影响HBV载体外源基因的表达和病毒的复制 ,而且可以提高载体的包装效率。

Survivin shRNA-APC双基因对结肠癌裸鼠皮下移植瘤细胞内质网通路中GRP78、Caspase-12 表达的影响

目的探讨细胞增殖因子短截型核糖核酸-腺瘤样结肠息肉基因(Survivin shRNA-APC)双基因对内质网应激凋亡通路中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-12(Caspase-12)表达的影响。方法将40只健康裸鼠随机分成5组(每组8只):SurvivinshRNA-APC双基因组(简称双基因组)、APC组、Survivin shRNA组、空载组和空白组。将前期构建好的Survivin shRNA-APC、APC、Survivin shRNA、空载稳转株及人HT-29结肠癌细胞分别接种至对应组裸鼠的左前腋下,采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-timePCR)及免疫组化方法分别检测5组移植瘤组织细胞中GRP78、Caspase-12mRNA及蛋白的表达情况。结果与空白组、空载组比较,双基因组、APC组、SurvivinshRNA组GRP78.Caspase-12mRNA及蛋白的表达明显增强(P<0.05),与APC组和Survivin shRNA组比较,双基因组增加更显著(P<0.05),空载组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论Survivin shRNA-APC双基因可能通过抑制Survivin表达,上调内质网通路中GRP78、Caspase-12mRNA及蛋白表达,最终诱导结肠癌细胞发生凋亡,且Survivin shRNA-APC双基因调控GRP78、Caspase-12mRNA及蛋白表达、诱导细胞凋亡能力较APC组和Survivin shRNA组强。

结肠癌患者ΔNp63和NF-κB的表达及意义

目的探讨结肠癌患者N末端截短型p63基因(ΔNp63)和核转录因子κB(NF-κB)的表达及意义。方法采用免疫组织化学法检测结肠癌患者ΔNp63和NF-κB的表达;采用实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)和Western blot检测ΔNp63和NF-κB信使核糖核酸(m RNA)和蛋白的表达;采用半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)活性检测试剂盒检测凋亡蛋白Caspase-3表达。结果与对照组比较,结肠癌患者ΔNp63蛋白表达升高35.57%,NF-κB蛋白表达升高58.93%,差异有统计学意义(P<0.05);结肠癌患者ΔNp63和NF-κB m RNA和蛋白表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05);结肠癌患者Caspase-3活性升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论结肠癌患者ΔNp63和NF-κB呈过度表达状态;ΔNp63和NF-κB的过表达在结肠癌发生、发展机制中可能起到重要作用。