田鼠巴贝西虫Babesiamicroti截短型分泌抗原的重组表达及其在诊断上的应用

田鼠巴贝西虫分泌抗原l（Babesiamicrotisecretedantigen1，BmSA1）是一个重要的诊断抗原候选分子，但全长蛋白的表达量少，也不宜纯化。本研究在此基础上，通过生物信息学分析，选取N-末端信号肽后，C-末端跨膜区前，包含CPSF73-100_C功能区的228个氨基酸所编码基因片段，重组高效表达了一个可溶性截短型抗原，解决了完整蛋白重组表达纯化的困难。纯化的截短型抗原作为酶联免疫试验（ELISA）诊断抗原，可清晰地区分阴性及阳性鼠血清，并与其他病原感染无交叉反应，显示其诊断的特异性。鼠人工感染田鼠巴贝西虫系列血清检测表明，该抗原可检测早期感染（5天）和感染（55天）以后的样本，显示其对不同时期感染的宿主均具有诊断价值。结果表明，重组B．microti截短型抗原可作为一种诊断制剂检测田鼠巴贝西虫抗体。

应用表达谱芯片技术对截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原截短型中蛋白(MHBst)的反式调节基因.方法:构建MHBst基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-MHBst,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-MHBst转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染MHBst后,有37条差异基因表达,其中14条基因表达增强,23条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式调节基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的研究

0引言 乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生、发展过程密切相关[1-5].

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活基因1的克隆化研究

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)羧基末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)的反式激活作用,利用差异显示技术,筛选克隆MHBst蛋白的反式激活作用的靶基因,发现新型基因,为阐明MHBst对于肝细胞表达基因谱的影响,探索新的研究方向。方法:利用多聚酶链反应技术(PCR)扩增MHBst的编码基因片段,构建真核表达载体pcDNA3.1-MHBst,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与仅转染空白载体pcDNA3.1的HepG2细胞进行差异显示,利用抑制性消减杂交技术(SSH)克隆鉴定MHBst的反式激活作用的靶基因,通过生物信息学技术,确定新基因的序列,设计序列特异性引物,利用HepG2细胞来源的mRNA进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,克隆新基因,并对于新基因的序列以及编码基因产物序列进行分析。利用生物信息学技术确定TTP1基因是新基因。结果:构建表达载体pcDNA3.1-MHBst,经过序列分析和酶切鉴定正确。转染HepG2细胞系,利用SSH技术获得差异表达的基因片段。经对于美国生物工程信息学中心(NCBI)建立的核苷酸序列的数据库(GenBank)检索,证实这是一个新型基因片段。通过对于同源基因序列的比对,根据Kozak规则和终止密码子下游的多聚腺苷酸信号序列,确定新基因的序列,将这种MHBst反式激活的新基因命名为TTP1,并在GenBank中注册登录。结论:克隆并鉴定了乙型肝炎病毒羧基末端截短型表面抗原中蛋白反式激活作用的新型靶基因TTP1,为今后研究MHBst的反式激活作用,开辟了新的研究方向和可能。

乙肝病毒截短型表面抗原中蛋白与X蛋白对肾小管上皮细胞核转录因子的影响

目的:目的研究167例乙肝病毒截短型表面抗原中蛋白(C-terminally truncated middle size surface proteins,MHBst167)和X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对肾小管上皮细胞核转录因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)活化的影响及其相关机制探讨。方法:肾小管上皮细胞系(HK-2)转染mhbst167或(和)hbx后,蛋白印迹法检测NF-κB核易位及其抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor-kappa B,IκBα)磷酸化水平的变化,凝胶电泳迁移率和双萤光素酶报告基因分析进一步检测NF-κB活性;通过对蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性和细胞外调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化水平检测探讨NF-κB活化的机制。结果:HK-2细胞转染mhbst167或(和)hbx基因后,NF-κB核易位、磷酸化IκBα、κB结合活性及κB基因转录均增加(P<0.05);且PKC激酶活性和磷酸化ERK水平也增加(P<0.05),而Raf蛋白均无表达。结论:在肾小管上皮细胞中,MHBst167/HBx可能通过PKC/ERK通路(非Raf依赖性)活化NF-κB。

猪圆环病毒2型截短的衣壳蛋白的表达和抗原特征

设计三对特异性引物扩增F2—1．F2-2和XF2—2截短猪圆环病毒2型（PCV-2）衣壳蛋白基因。扩增序列分别克隆到pET-32a（＋）载体，并在Rosetta（DE3）大肠杆菌中IPTG诱导表达。融合蛋白可与猪圆环病毒2型抗体和His—XF2—2反应。

乙型肝炎病毒相关性肾炎肾组织中HBx、MHBs^t mRNA的表达及其意义

目的:检测乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBVGN)肾组织中乙型肝炎病毒X基因(HBx)及截短型乙型肝炎病毒表面抗原(MHBst)mRNA的表达,探讨HBx、MHBst在HBVGN发生中的意义。方法:采用原位杂交的方法对40例HBVGN患者的肾组织进行HBx、MHBst mRNA检测。结果:HBVGN患者肾组织中存在HBx、MHBst mRNA,HBx、MHBst mRNA主要分布于肾小管上皮细胞的胞质内,少数肾小球上皮、内皮、系膜细胞的胞质内也有分布;肾小管上皮细胞内HBx、MHBst mRNA阳性率分别为82.5%(33/40)、80%(32/40),肾小球内HBx、MHBst mRNA阳性率分别为30%(12/40)、22.5%(9/40),HBx、MHBst mRNA在肾小管上皮细胞的表达明显高于肾小球(P<0.01)。结论:在HBVGN肾组织,特别是在肾小管上皮细胞的胞质存在HBx、MHBst mRNA的表达,提示HBV感染及其基因整合可能在HBVGN发生中有一定意义。

乙型肝炎病毒核心质粒的构建及原核表达

目的 构建乙型肝炎病毒核心区原核表达质粒并进行原核蛋白表达、纯化和鉴定。方法 应用基因工程技术将编码截短型乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcAg 1～14 4aa)的基因片段装入原核表达载体pRSET B内,在宿主菌B12 1(DE3 )plysS内进行诱导表达,运用Ni NTA方法纯化目的蛋白。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)及Westernblot检测蛋白的灵敏度和特异性。结果 成功地构建了含截短型乙型肝炎病毒核心区基因的质粒,并纯化得到了分子量约为19.5kD的目的蛋白。结论 本方法所获得的重组截短型乙型肝炎病毒核心抗原(1～14 4a)纯度高,免疫反应性强。

人乳头瘤病毒58型截短型L1蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6的融合表达及其抗血清的制备

目的原核表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型截短型L1(Truncated L1,tL1)蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6(Early secreted antigenic target-6,ESAT-6)融合蛋白,并制备其抗血清。方法利用PCR技术分别从HPV基因组DNA和ESAT-6-18T质粒DNA中扩增tL1和ESAT-6基因,构建重组原核表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a,分别转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白ESAT-6-tL1经镍离子亲和层析柱纯化后免疫昆明小鼠,ELISA检测血清抗体效价。结果 PCR扩增出750 bp的tL1基因片段和320 bp的ESAT-6基因片段,测序结果与GenBank登录的序列一致;重组表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a经双酶切鉴定,构建正确;表达的ESAT-6-tL1融合蛋白相对分子质量约40 000,在E.coli Rosetta中的表达形式为包涵体,纯化后纯度为85%,免疫小鼠血清抗体效价为1:4 000。结论成功表达了ESAT-6-tL1融合蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研制检测HPV58的抗体奠定了基础。

应用弓形虫截短型SAG1纳米金免疫传感器检测弓形虫抗体的研究

目的克隆表达弓形虫主要表面抗原1截短型片段(tSAG1),建立tSAG1纳米金免疫传感器,用于检测弓形虫抗体。方法 PCR扩增tSAG1基因片段并克隆至pMD18-T载体,测序鉴定后亚克隆至表达载体pET-28a(+),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达tSAG1,金属螯合层析法进行纯化,Western blot分析其免疫活性;采用种子生长法制备金纳米棒,偶联tSAG1,构建纳米金免疫传感器,用于检测人血清弓形虫抗体,计算其敏感度、特异度、阳性及阴性预测值和诊断效率。结果构建了重组表达质粒pET-28a (+)-tSAG1,表达纯化获得具有反应原性的tSAG1,其相对分子质量约为30×10^3。用制备的tSAG1纳米金免疫传感器检测人血清弓形虫抗体的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及诊断效率分别为80.9%、90.0%、90.2%、80.6%和85.2%。结论基于重组tSAG1的纳米金免疫传感器可用于弓形虫抗体的检测。