诱导型衰老细胞模型的建立及Klotho启动子截短型突变体的构建和活性检测

目的:建立诱导型衰老细胞模型并检测抗衰老相关的Klotho基因启动子的不同截短型突变体的活性,为下一步研究奠定基础.方法:原代的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)经过流式细胞术分离鉴定后,通过设置不同过氧化氢的浓度,按时间梯度摸索诱导原代HUVEC细胞衰老的条件并最终通过SA-β-gal染色及定量PCR技术来确定其诱导条件.以全长的Klotho启动子为模版,通过PCR的方法,获得不同长度的Klotho启动子截短型突变体,并通过双萤光素酶报告基因系统检测试剂盒检测不同的启动子截短型突变体在诱导型衰老细胞内的激活程度.结果:培养基中过氧化氢浓度为600μM,处理96 h后,成功构建了诱导型衰老细胞模型;通过PCR的方法成功构建了长度分别为1 711 bp、1 262 bp、785 bp和735 bp的4个长度截短型突变体,并发现735 bp的截短型突变体在诱导型衰老细胞内的激活程度存在明显差异.结论:成功建立了诱导型衰老细胞模型,并成功构建了Klotho基因的启动子截短型突变体,检测和发现这些突变子在诱导型衰老细胞内的激活程度存在明显差异,为下一步治疗衰老相关疾病奠定了良好的工作基础.

小鼠RHOX5蛋白两种截短型突变体的原核表达及其与MDFIC互作的鉴定

目的:表达和纯化两种小鼠RHOX5蛋白的截短型突变体,确定完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。方法:生物信息学分析小鼠同源异型框蛋白RHOX5的cDNA序列,分别对RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C进行PCR、分别扩增RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C并将其克隆至pGEX4T3原核表达载体,构建重组表达质粒。用重组表达质粒分别转化大肠杆菌RosettaTM2(DE3)菌株,经IPTG诱导后,使用Glutathione-Sepherase 4B颗粒对融合蛋白进行小批量亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳分离目标蛋白,确定融合蛋白的表达。进行GST-pull down实验,检测完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。结果:在大肠杆菌RosettaTM2(DE3)中有效地实现了GST-RHOX5、GST-RHOX5 N和GST-RHOX5 C 3种融合蛋白的可溶性表达;经Glutathione Sepherase 4B颗粒亲和纯化后,获得了纯化后GST融合蛋白;GST-pull down实验证实,含有homeodomain的RHOX5蛋白和RHOX5C截短型突变体可以与MDFIC蛋白相结合,而RHOX5N截短型突变体则丧失了与MDFIC蛋白结合的能力。结论:实现了RHOX5及其两种截短型突变体的原核表达和纯化,证实RHOX5蛋白的homeodomain结构域是其与MDFIC结合的关键部位。

截断型突变体HBx-Mut120稳定表达真核细胞系的建立

目的 成功构建HBx及其截断型突变体HBx-Mut120的真核载体,建立了两者稳定表达的HepG2细胞系,并研究了目的基因对细胞生长的影响。方法 采用PCR扩增HBx及其截断型突变体HBx-Mut120基因,然后分别克隆到PCMVTag2B载体中,并构建成重组质粒HBx-PCMV-Tag2B和HBx-Mut120-PCMV-Tag2B,经过PCR、酶切、测序鉴定重组质粒后,将其转染人肝癌细胞HepG2,经Game 418筛选后得到稳定表达目的基因的Hep G2细胞,最后通过RT-PCR和Western blot鉴定HBx、HBx-Mut120的mRNA和蛋白在HepG2细胞中的表达情况,并用流式细胞仪检测了各组细胞的周期。结果 (1)成功构建目的基因表达载体PCMV-Tag2B-HBx、PCMV-Tag2B-HBx-Mut120。(2)成功建立稳定表达HBx及其缺失片段的HBx蛋白的HepG2细胞系。(3)通过流式细胞仪检测各组细胞周期及对比,发现HepG2-HBx细胞和HepG2-HBx-Mut120细胞的生长分数(G_2+S)明显高于HepG2细胞及空载体转染的HepG2细胞。结论 本实验成功构建携带HBx及其截断型突变体HBxMut120基因的重组表达质粒,转染人肝癌细胞HepG2细胞后分别能够稳定表达HBx蛋白和截断型HBx蛋白,HBx及其突变体稳转细胞后更能促进HepG2细胞的增殖,且突变型目的基因稳转细胞系转移能力较前明显增强。为进一步研究截断型HBx突变体在肝癌的发生、发展中的作用奠定了实验基础。

截短型rBTI的表达、纯化及其对EC9706细胞生长的抑制作用

依据先前获得的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)氨基酸序列及三维分子构像,分别构建了rBTI C末端缺失VVM、TPVVM或VDTPVVM的截短型pExsecI-BTI-t1,pExsecI-BTI-t2和pExsecI-BTI-t3重组质粒.转入大肠杆菌BL21中进行表达,并通过Resource Q阴离子交换层析分离.实验结果显示,3个工程菌均以可溶方式表达,目的蛋白在SDS-PAGE图谱中显示单一条带,其纯度达98%以上.理化性质分析表明,截短型rBTI与野生型rBTI具有相似的胰蛋白酶抑制活性,并具有很好的热稳定性及酸碱稳定性.将野生型和截短型rBTI分别作用于人食管癌EC9706细胞.MTT检测发现,C末端截短不同数目的氨基酸后,与野生型rBTI相比,在相同浓度下截短型rBTI仍具有一定的抑制肿瘤细胞生长作用,其抑制作用范围是截短前的50%左右.这些结果提示,rBTI的C末端氨基酸残基缺失未引起活性区域或功能部位的较大改变,从而保留了其对胰蛋白酶的抑制作用和部分生物学功能.

ΦC31位点特异性整合酶DNA结合功能域的鉴定

DNA结合功能域的确定是阐明位点特异性重组酶整合机制的关键,而对酶DNA结合功能域进行突变研究是提高酶整合效率和整合特异性的重要方法.为了鉴定ΦC31位点特异性整合酶的DNA结合功能域,依据对ΦC31整合酶序列的生物信息学分析结果,利用PCR和克隆技术在pET22b原核表达载体上构建ΦC31整合酶重组截短突变体表达质粒,将获得的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株扩大培养并用IPTG诱导融合蛋白的表达,经镍柱纯化获得了纯度达90%以上的重组蛋白,分子量也与预期大小一致,Western印迹确定了重组蛋白的特异性.凝胶迁移滞后实验显示野生型以及截短突变体蛋白ΦC311-528、ΦC311-472、ΦC311-413能与细菌附着位点DNAattB和噬菌体附着位点DNAattP结合的条带,而截短突变体ΦC311-353、ΦC311-279、ΦC311-120观察不到相应的结合条带.6个截短突变体质粒在体内重组活性蓝白斑实验中均表现为蓝斑,显示出皆丧失体内重组活性.研究证实,ΦC31整合酶半胱氨酸富集域(第353～413位氨基酸)具有DNA结合的功能,而C末端缬氨酸富集区(第528～613位氨基酸)也与其重组活性相关.这为进一步了解ΦC31整合酶的结构与功能,最终引导其结构进化,提高其特异性和整合效率奠定了基础.