猪圆环病毒3型四川株Cap蛋白的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好抗原性的重组Cap蛋白。基于纯化的重组Cap蛋白建立间接ELISA方法,确定最佳抗原包被浓度、待检血清最佳稀释比例、酶标抗体稀释比例和阴阳性临界值,对间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性、相关性和符合率进行分析,并对2018-2022年采自川东北地区猪场的351份临床猪血清进行检测,分析该区域PCV3流行情况。【结果】试验成功构建pET30a-PCV3-Cap重组表达载体,实现重组Cap蛋白(1-197位氨基酸)的原核截短表达,蛋白大小约为26 ku,可与PCV3阳性猪血清发生特异性反应;确定最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,酶标抗体稀释比例为1∶60000,阴阳性临界值D_(450 nm)为0.684;建立的间接ELISA方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒1型(PPV1)阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶1600,批内变异系数和批间变异系数均<10%,与病毒中和试验(VNT)结果呈正相关,与Western blotting方法的阳性符合率为95.8%;2018-2022年川东北地区的351份猪血清样品阳性率为7.12%。【结论】本研究成功截短表达了PCV3四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PCV3间接ELISA方法,为PCV3的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。

截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白的表达及其体外生物活性研究

利用PCR技术克隆截短型HPV5 8L1基因并重组入杆状病毒表达系统穿梭质粒pFastBac Htb ,通过转座反应 ,将目的基因片段重组入杆状病毒基因组 ,分离重组的BacmidDNA ,并转染Sf 9昆虫细胞 ,收集被转染的Sf 9细胞 ,提取细胞蛋白 ,SDS PAGE检测可见在大约 5 8Kda处出现一新生蛋白条带 ,Westernblot证实为HPV5 8L1蛋白。用ProBondTM 纯化系统纯化所表达的蛋白。小鼠红细胞凝集试验证实纯化的蛋白可介导小鼠红细胞凝集 ,透射电镜观察证实纯化蛋白可自组装成VLP。结果表明昆虫杆状病毒表达系统可高效表达截短型HPV5 8L1蛋白 ,纯化后的截短型HPV5 8L1蛋白在体外可自组装VLP 。

应用表达谱芯片技术对截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原截短型中蛋白(MHBst)的反式调节基因.方法:构建MHBst基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-MHBst,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-MHBst转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染MHBst后,有37条差异基因表达,其中14条基因表达增强,23条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式调节基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

Egr1介导的人截短型凋亡诱导因子表达载体的构建及其在乳腺癌MCF-7细胞中的辐射诱导表达规律

目的:克隆人截短型凋亡诱导因子(AIF)cDNA序列,并构建早期生长反应因子1(Egr1)介导的重组表达载体pcDNA3.1-Egr1-AIFΔ1-480(pEgr1-AIFΔ1-480),观察其在人乳腺癌MCF-7细胞中的辐射诱导表达规律。方法:以人白血病Jurkat细胞mRNA为模板,RT-PCR法扩增获得人AIFΔ1-480,与pMD18T载体连接后行全自动测序,限制性内切酶切取pMD19T-Egr1中Egr1片段,并利用基因重组技术构建Egr1启动子介导的人AIFΔ1-480表达质粒pEgr1-AIFΔ1-480。实验分为对照组、pcDNA3.1组、pAIFΔ1-480组和pEgr1-AIFΔ1-480组。各组质粒分别转染MCF-7细胞,Western blotting法检测AIF及AIFΔ1-480蛋白的辐射诱导表达时程-效应(2.0Gy照射后0、2、4、12、24和48h)和剂量-效应(0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0Gy照射后24h)规律。结果:经测序证实,RT-PCR获得的人AIFΔ1-480基因与预期一致,pEgr1-AIFΔ1-480经PCR和酶切鉴定完全正确;各组MCF-7细胞经2.0Gy照射后0～48h,AIF蛋白在各组中均有表达,从4h开始显著增加,4、12、24和48h各组AIF表达与0h组比较差异有统计学意义(P<0.05),48h达到最大;而在pAIFΔ1-480和pEgr1-AIFΔ1-480组,AIFΔ1-480从2h开始表达,4、12、28和48h各组AIFΔ1-480表达与2h比较差异有统计学意义(P<0.05),24h达到峰值;而且24和48h时pEgr1-AIFΔ1-480组AIFΔ1-480表达较pAIFΔ1-480组显著增加(P<0.05)。各组MCF-7细胞经0～5.0Gy照射后24h,各组均有AIF蛋白表达,而AIFΔ1-480只在pAIFΔ1-480和pEgr1-AIFΔ1-480组表达,二者均随着剂量增加而增加,0.2、0.5、1.0、2.0和5.0Gy照射后各组AIF表达与0Gy比较差异有统计学意义(P<0.05),在5.0Gy照射时达到最大,相同照射剂量pEgr1-AIFΔ1-480组AIFΔ1-480表达高于pAIFΔ1-480组。结论:成功构建Egr1介导的人截短型AIF重组表达载体pEgr1-AIFΔ1-480,AIF和AIFΔ1-480蛋白在MCF-7细胞中的表达随照射时间延长和照射剂量增加而增加。

截短型人Bid融合蛋白对HeLa细胞的促凋亡作用

目的 :观察截短型人bid及其N端融合蛋白的表达对HeLa细胞的促凋亡作用 .方法 :通过反转录PCR方法获取人全长bid基因 ,再经PCR方法克隆得到截短型bid(trun catedbid ,tbid)基因及其N端融合蛋白基因插入pcDNA3真核表达载体 ,脂质体法转染HeLa细胞 ,通过间接免疫荧光 ,电子显微镜以及流式细胞仪等方法观察被转染细胞的生长及凋亡状况 .结果 :成功获得人bid基因 ,构建了tbid基因及tbid与绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因的真核表达载体 (pcDNA3 tbid6 1 ,pcDNA3 PE tbid6 1 ) .与对照组相比 ,在转染后 1 2～ 4 8h内两种基因的表达均导致HeLa细胞发生凋亡 ,且两者活性相当 .结论

截短型人胰岛素样生长因子-Ⅰ 在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

利用PCR、删除突变和基因重组技术构建了N端缺失3个氨基酸的人胰岛素样生长因子-[des(1-3)IGF-]的表达载体pExSec/IGF,在大肠杆菌蛋白酶缺陷株BL21(DE3)中,通过用IPTG于超常规的12℃低温诱导16h,des(1-3)IGF-获得了可溶性表达。表达水平达到可溶性细菌总蛋白约15%。经超滤和SephadexG-50凝胶过滤,des(1-3)IGF-纯度分别达到49%和82%,且表现出明显的免疫学活性和刺激Balb3T3细胞增殖的生物学活性。

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的研究

0引言 乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生、发展过程密切相关[1-5].

猪卵透明带-3β截短型蛋白在原核系统中的表达研究

目的:制备具有猪卵透明带-3β抗原活性的截短型pZP3β蛋白(tunc-pZP3β),以便对该蛋白的抗原表位区域作深入研究。方法:采用PCR方法扩增原cDNA中编码第130个氨基酸到第290个氨基酸的DNA序列。获得的tunc-pZP3β基因片段通过引入其两端的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点被定向插入pET-3c质粒T7强启动子下游的多克隆区,筛选出重组子,经DNA测序验证正确后,转化表达菌株BL21(DE3)pLysS,再用IPTG对重组菌体进行诱导。结果:SDS-PAGE分析表明tunc-pZP3β在大肠杆菌系统中高水平表达,且在WesternBlot免疫印迹中能被特异性抗体识别。结论:对适当的抗原表位序列进行保留而截去两端一定的氨基酸序列,所获得的截短型蛋白能够实现在大肠杆菌中高效表达,这有利于深入研究该蛋白核心区域的功能。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25截短蛋白的多克隆抗体制备与免疫原性分析

鲫(Carassius auratus)造血器官坏死症是我国养殖鲫中新出现的一种传染性病毒性疾病,其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2),为研制针对该病的有效诊断试剂和疫苗,分析了Cy HV-2 ORF25基因编码蛋白的抗原表位,利用原核表达系统对Cy HV-2 ORF25编码蛋白富含抗原表位的区域进行截短表达,制备了抗Cy HV-2 ORF25编码蛋白的多克隆抗体,通过间接免疫荧光和免疫保护力测定等实验研究了截短表达蛋白的免疫原性。结果显示,原核表达的截短蛋白t ORF25分子质量约为28 k W,蛋白纯化后免疫日本大耳兔制备的多克隆抗体可特异性识别在Gi CB上增殖的Cy HV-2。将截短表达蛋白t ORF25免疫异育银鲫后,感染Cy HV-2,其相对免疫保护率达47%。

供转染的截短型PDGF-α受体高滴度腺病毒的制备及作用分析

目的 制备高滴度供转染的切除功能结构域的血小板衍生生长因子α受体 (truncatedPDGF αR)重组腺病毒 ,观察其在对平滑肌细胞增殖的影响。方法 通过基因重组技术 ,切除PDGF α受体功能结构域 ,将cDNA片段克隆入腺病毒载体 ,重组质粒导入病毒包装细胞 2 93扩增制备高滴度的腺病毒 ,感染大鼠主动脉平滑肌细胞 ,3 H TdR掺入法测定腺病毒对PDGF AA介导的增殖反应影响。结果 重组腺病毒滴度最高为 1.4× 10 5CFU/mL ;截短型PDGF α感染平滑肌细胞 ,PDGF AA介导的3 H TdR掺入减少。结论 制备高滴度供转染的截短型PDGF α受体腺病毒 ,感染平滑肌细胞后 ,PDGF AA介导的增殖反应减弱。

重组截短型人源结缔组织生长因子在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR法从人胎盘组织中克隆出人源结缔组织生长因子(h-CTGF)cDNA序列867bp,将此cDNA亚克隆至表达载体pET-9a,重组质粒转化BL21(DE3)pLysS,诱导表达出N端缺失61个氨基酸残基的截短型rh-CTGF,表达量占总菌体蛋白的7%,主要以不溶性包涵体形式存在。采用离心、洗涤和凝胶过滤分离纯化后,行活性检测表明截短型rh-CTGF无刺激增殖活性,并对用原核表达rh-CTGF作了讨论.为制备抗体、CTGF表达调控和功能研究打下了基础。

猪圆环病毒2型ORF2截短基因片段真核表达载体的构建及其DNA疫苗的免疫效果

为研究猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2截短基因片段核酸疫苗的免疫效果,以PCV-2 GXWZ-1株为模板,用PCR方法扩增出ORF2基因及其截短基因共8个片段[A(ORF2)、B(51～100 aa)、C(101～150 aa)、D(181～235 aa)、E(151～200 aa)、F(51～150 aa)、G(101～235 aa)、H(51～235 aa)],将其插入pcD-NA3.0载体中,成功构建了pcDNA-A、pcDNA-B、pcDNA-C、pcDNA-D、pcDNA-E、pcDNA-F、pcDNA-G、pcDNA-H。将纯化后的真核表达质粒转染PK-15细胞后,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的瞬时表达情况。分别用单独免疫和组合免疫的方法免疫小鼠,每只0.15 mg,用ELISA试剂盒检测小鼠血清中的抗体效价,并分析这两种方法的免疫效果。结果显示,6个片段较短的重组质粒(pcDNA-B、pcDNA-C、pcDNA-D、pcDNA-E、pcDNA-F、pcDNA-G)转染的细胞中均有明显且较亮的荧光出现,而2个片段较长的重组质粒(pcDNA-A、pcDNA-H)及空载体pcDNA3.0转染的细胞中没有荧光出现。在单独免疫组中,这8个片段的真核表达质粒都能刺激机体产生特异性抗体,其中片段较短的pcDNA-C、pcDNA-D、pcDNA-E的免疫效果比较理想;在组合免疫中,除pcDNA-C-F外,各个真核表达质粒都能产生较高水平且稳定的抗体,其中pcDNA-D-H、pcDNA-B-F的免疫效果最好。表明组合免疫要比单独免疫的效果好。

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活基因1的克隆化研究

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)羧基末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)的反式激活作用,利用差异显示技术,筛选克隆MHBst蛋白的反式激活作用的靶基因,发现新型基因,为阐明MHBst对于肝细胞表达基因谱的影响,探索新的研究方向。方法:利用多聚酶链反应技术(PCR)扩增MHBst的编码基因片段,构建真核表达载体pcDNA3.1-MHBst,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与仅转染空白载体pcDNA3.1的HepG2细胞进行差异显示,利用抑制性消减杂交技术(SSH)克隆鉴定MHBst的反式激活作用的靶基因,通过生物信息学技术,确定新基因的序列,设计序列特异性引物,利用HepG2细胞来源的mRNA进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,克隆新基因,并对于新基因的序列以及编码基因产物序列进行分析。利用生物信息学技术确定TTP1基因是新基因。结果:构建表达载体pcDNA3.1-MHBst,经过序列分析和酶切鉴定正确。转染HepG2细胞系,利用SSH技术获得差异表达的基因片段。经对于美国生物工程信息学中心(NCBI)建立的核苷酸序列的数据库(GenBank)检索,证实这是一个新型基因片段。通过对于同源基因序列的比对,根据Kozak规则和终止密码子下游的多聚腺苷酸信号序列,确定新基因的序列,将这种MHBst反式激活的新基因命名为TTP1,并在GenBank中注册登录。结论:克隆并鉴定了乙型肝炎病毒羧基末端截短型表面抗原中蛋白反式激活作用的新型靶基因TTP1,为今后研究MHBst的反式激活作用,开辟了新的研究方向和可能。

截短型转位肽重组抗体/颗粒酶B基因的构建及表达

目的 :构建携带截短型转位肽重组抗体 /颗粒酶B基因的真核表达载体 ,并将其在HER2阳性SKBR 3肿瘤细胞及HER2阴性Hela肿瘤细胞中表达。方法 :用PCR法获得截短型转位肽重组抗体 /颗粒酶B基因片段 ,并克隆构建真核表达载体 ,以脂质体法转染SKBR 3细胞及Hela细胞 ,用免疫细胞化学染色检测其在不同细胞中的表达及对细胞形态的影响。结果 :成功构建了编码截短型转位肽重组抗体 /颗粒酶B基因的真核表达载体pCMV e2 3sFv FSD GrB ,用免疫细胞化学检测发现 ,绝大多数Hela细胞可高表达e2 3sFv FSD GrB蛋白 ,且细胞形态正常 ,而表达e2 3sFv FSD GrB蛋白的SKBR 3细胞形态发生变化 ,出现固缩细胞。结论 :截短型转位肽重组抗体 /颗粒酶B基因真核表达体系的建立 ,为确定PE转位肽的最小转位功能区段奠定了基础。

血管性痴呆大鼠海马区pro-BDNF、截短型BDNF、mBDNF的变化及与认知的关系

目的探讨血管性痴呆(VD)大鼠海马中脑源性神经营养因子前体蛋白(pro-BDNF)、成熟脑源性神经营养因子(m BDNF)、截短型脑源性神经营养因子(BDNF)变化及与认知功能的关系。方法健康雄性SD大鼠120只,6月龄,体重350 g左右,随机分为模型组和假手术组,模型组结扎双侧颈总动脉,假手术组除不结扎血管外余同模型组,模型组和假手术组大鼠随机分为2、4、8和12周4个时间,水迷宫实验筛选造模成功大鼠,免疫组织化学法和Western blot检测假手术组及造模成功的大鼠不同时间点海马中pro-BDNF、m BDNF、截短型BDNF变化。结果术后各时间点模型组大鼠的潜伏期均较假手术组延长(P<0.05)。免疫组织化学法检测显示模型组大鼠海马神经元形态改变、数量减少、BDNF表达下降。术后模型组pro-BDNF、m BDNF、截短型BDNF较假手术组降低(P<0.05),pro-BDNF水平下降趋势较缓慢,截短型BDNF水平下降趋势在缺血早期变化显著,后期变化缓慢;m BDNF水平下降趋势在缺血早期变化不明显,后期变化显著。结论慢性缺血VD大鼠海马区pro-BDNF、m BDNF、截短型BDNF均有改变,3者比例的改变可能与VD大鼠认知功能障碍有关。

基因重组大肠杆菌表达截短型pZP3β的发酵条件优化

目的:对已构建好的表达pZP3β蛋白(pZP130)工程菌的培养条件进行优化,通过在5L罐中发酵和Ni柱纯化,以期获取较大量目的产物。方法:在摇瓶中改变不同的培养及诱导条件,比较工程菌的生长和目的蛋白的表达,优化发酵条件;并在5L发酵罐中进行发酵,获得菌体,破碎后进行Ni柱纯化。结果:优化的发酵条件是:10%的接种量,加入2%甘油的培养基培养菌体3h后加入0.5mmol/LIPTG,诱导4h后收样。在5L发酵罐中发酵,获得菌体量36g/L,经Ni柱纯化,获得蛋白粗制品33mg/L发酵液。结论:截短型pZP3β蛋白可以在E.coli中获得较高表达,并且可以通过发酵和Ni柱纯化得到较大量的蛋白,这有助于pZP的深入研究和应用。

诱导型衰老细胞模型的建立及Klotho启动子截短型突变体的构建和活性检测

目的:建立诱导型衰老细胞模型并检测抗衰老相关的Klotho基因启动子的不同截短型突变体的活性,为下一步研究奠定基础.方法:原代的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)经过流式细胞术分离鉴定后,通过设置不同过氧化氢的浓度,按时间梯度摸索诱导原代HUVEC细胞衰老的条件并最终通过SA-β-gal染色及定量PCR技术来确定其诱导条件.以全长的Klotho启动子为模版,通过PCR的方法,获得不同长度的Klotho启动子截短型突变体,并通过双萤光素酶报告基因系统检测试剂盒检测不同的启动子截短型突变体在诱导型衰老细胞内的激活程度.结果:培养基中过氧化氢浓度为600μM,处理96 h后,成功构建了诱导型衰老细胞模型;通过PCR的方法成功构建了长度分别为1 711 bp、1 262 bp、785 bp和735 bp的4个长度截短型突变体,并发现735 bp的截短型突变体在诱导型衰老细胞内的激活程度存在明显差异.结论:成功建立了诱导型衰老细胞模型,并成功构建了Klotho基因的启动子截短型突变体,检测和发现这些突变子在诱导型衰老细胞内的激活程度存在明显差异,为下一步治疗衰老相关疾病奠定了良好的工作基础.

重组人截短型IL-6表达载体的构建及表达

旨在建立人截短型 IL- 6原核高效表达系统。用 PCR方法获得截短的人 IL- 6基因 ( rh IL - 6c DNA) ,将其插入克隆载体 p UC1 8中 ,经证实后再克隆入表达载体 p BV2 2 0中 ,鉴定阳性表达载体。结果建立了截短型 IL- 6基因的克隆载体 ,经测序证实完全正确 ;构建了截短型 IL- 6的原核表达质粒 p BV2 2 0 /rh IL- 6并获得高效表达 ;初步纯化的表达蛋白的比活性为 5× 1 0 7μmol/min· mg蛋白 ;用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达了截短型 rh IL- 6,为大量制备 IL- 6奠定了基础。

猪细环病毒2型ORF1截短基因的原核表达

细环病毒（rITrV）又称输血传播病毒，是隶属于指环病毒科的一种环形DNA病毒。输血传播病毒于1997年由日本学者从一名输血后的肝炎患者血清中发现，人群感染率可达10％以上。1999年，美国学者在猪体内发现猪源细环病毒（TorquetenoSUSvirus，TTllSuV），之后世界各地陆续可见TTSuV病例的报道一。

一种新型的截短型转化生长因子-βⅡ型受体的构建

目的设计并构建一种新型的截短型转化生长因子-βⅡ受体(tTGF-βRⅡ)。方法 RT-PCR方法扩增TGF-βⅠ的CDS序列、tTGF-βRⅡ,并将其分别克隆至pGBKT7和pGADT7载体中。利用酵母双杂交和GST-pulldown试验检测tTGF-βRⅡ与TGF-βⅠ间的相互作用。人工合成该tTGF-βRⅡ多肽。结果成功地设计并克隆了一种新的tTGF-βRⅡ,其可以与配体TGF-βⅠ结合。结论制备的tTGF-βRⅡ可以作为TGF-βRⅡ的拮抗剂,竞争性的与TGF-βⅠ结合,为瘢痕治疗奠定了基础。