R(-)-扁桃酸脱氢酶产生菌的筛选

选用酵母、乳酸菌、粪链球菌、假丝酵母等 4个种属 18种菌株 ,研究其对苯乙酮酸和苯乙酮酸甲酯的不对称还原催化特性。筛选出一株酵母sp .strainby1,对两种底物皆具有较高的转化活性和光学选择性。底物浓度为 10mmol L ,微生物转化 72h后 ,扁桃酸的得率 80 .83% ,对映体过量值e .e .达 95 .5 % ;微生物转化 2 8h后 ,扁桃酸甲酯的得率 92 .11% ,e .e .值达 91.1%。

D-扁桃酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶级联催化的L-苯甘氨酸对映选择性生物合成

L-苯甘氨酸是重要的手性非天然α-氨基酸,可广泛用于合成多种食品添加剂及药物中间体,探索其绿色合成工艺具有重要的意义。本研究将新型高活性的D-扁桃酸脱氢酶(LhDMDH)和L-亮氨酸脱氢酶(EsLeuDH)偶联,在辅酶内循环的前提下,仅需较低浓度的辅酶即可实现生物催化D-扁桃酸合成L-苯甘氨酸。通过对加酶量、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD^+)浓度、NH+4浓度和底物浓度等因素进行优化,获得了一个最经济的反应条件:200 mmol/L的D-扁桃酸、6.5 kU/L的加酶量、0.1 mmol/L NAD^+、0.5 mol/L NH4^+的条件下、30℃,反应12h,在此条件下,产物的得率和对映体过量(e.e.)值分别可达98%和99%以上,具有较大的产业化潜力,为实现L-苯甘氨酸规模化的生物合成奠定了坚实的基础。

酿酒酵母中的D-(-)-扁桃酸脱氢酶

酿酒酵母BY1.1b对苯乙酮酸不对称还原成D-(-)-扁桃酸的反应具有高度的催化还原活性和光学选择性。采用超声波细胞破碎、硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换层析及Sephacryl S-200分子筛层析等步骤,从酵母BY1.1b中分离纯化得到D-(-)-扁桃酸脱氢酶。该酶的相对分子质量约60000。该酶的生物合成模式为非细胞生长偶联型和非底物诱导型。该酶与酵母醇脱氢酶、马肝醇脱氢酶、乳酸脱氢酶及丙酮酸脱氢酶的底物特异性具有显著差别,是一种新型的脱氢酶。

酿酒酵母by1.1b产D-(-)-扁桃酸脱氢酶的发酵条件优化

对一株产D-(-)-扁桃酸对映选择性脱氢酶的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae sp. strain by1.1b)发酵产酶条件进行了优化。研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响,应用正交试验优化发酵培养基组成,结果为:蛋白胨60 g/L,麦芽糖30 g/L,MgSO_4 0.5 g/L,ZnSO_4 0.01 g/L, KCl 1.0 g/L。优化后酶产量提高了7.9倍(由2.56 U/mL增至20.21 U/mL)。摇瓶培养最佳条件为:装液量40%,发酵pH 6.5,接种量10%,发酵温度30℃。考察了细胞生长及产酶的时间进程,最佳培养时间为25 h。

新型R-扁桃酸脱氢酶的基因挖掘及表达鉴定

R-扁桃酸脱氢酶在苯乙酮酸的生物合成中起着关键的作用,挖掘具有高催化活性及稳定性的新型R-扁桃酸脱氢酶具有重要的意义。为了获得理想的R-扁桃酸脱氢酶,采用了基因组挖矿技术从Lactobacillus harbinensis菌株中获得了一个新型的R-扁桃酸脱氢酶LhDMDH,重组LhDMDH的比酶活高达1264.3 U/mg,约为探针的4倍,在已报道的R-扁桃酸脱氢酶中处于领先水平。同时,考察了4个重组酶主要的酶学特性,它们的最适反应温度在25-30℃,最适反应pH在9.0-9.5。动力学参数的结果表明,LhDMDH对底物的K_（cat）值为30.28 S^-1,明显高于其它重组酶。此外,底物谱分析的结果也表明LhDMDH在外消旋扁桃酸的手性拆分及苯乙酮酸的生物合成中更具优势。在R-扁桃酸脱氢酶基因挖掘方面取得了较为理想的结果,为进一步的改造及应用奠定了坚实的基础,也为其它酶的挖掘提供了可资借鉴的经验。

酿酒酵母中D-(-)-扁桃酸脱氢酶性质研究

采用DEAE Sepharose离子交换层析、Butyl Sepharose疏水层析和Blue Sepharose亲和层析等分离方法,从高产D-（-）-扁桃酸的酵母菌株BY1.1b中纯化得到电泳纯的D-（-）-扁桃酸脱氢酶.采用Sephacryl S-200分子筛层析柱测得该酶的相对分子质量约60 kDa,用SDS-PAGE电泳测得该酶亚基分子量为32 kDa,表明该酶属于同型二聚体.该酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.0.该酶在低于30℃,pH5.5~8.0较为稳定.以NADH和苯乙酮酸为底物,其Km值分别为Km（NADH）=99.2μmol/L和Km（苯乙酮酸）=263.3μmol/L.

S-扁桃酸脱氢酶基因的克隆及表达

S-扁桃酸脱氢酶能够选择性催化S-扁桃酸生成苯甲酰甲酸。通过PCR扩增获得Pseudomonas putida NUST的S-扁桃酸脱氢酶全长基因(mdlA),并构建了表达载体pET30a(+)-mdlA,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导获得表达,SDS-PAGE结果显示表达蛋白为43kDa。所以工程菌细胞具有转化S-扁桃酸生成苯甲酰甲酸能力。

L-扁桃体酸脱氢酶的电化学特性

应用电化学方法研究了基因工程酶 (L 扁桃体酸脱氢酶 )的电化学性质 ,探讨了其催化机理。以聚赖氨酸为促进剂 ,L 扁桃体酸脱氢酶黄素微区在裂解石墨棱面 (EPG ,edge planepyrolyticgraphite)电极上有两对氧化还原峰 ( -0 .4 81V和 -0 .60 5Vvs.SCE ,Tris缓冲溶液pH 7.5,扫描速度 2 0mV/s) ,显示出酶的辅基黄素单核苷酸 (FMN)与电极之间的电子传递过程。在此条件下 ,L 扁桃体酸脱氢酶黄素微区不能催化L 扁桃体酸脱氢 ,但用二茂铁甲酸和细胞色素C作为媒介体 。

产碱杆菌ECU0401催化拆分扁桃酸及其衍生物

从土壤中分离的1株产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401具有扁桃酸脱氢酶活性,可以以扁桃酸、苯甲酰甲酸或苯甲酸为唯一C源生长,并且具有较高的脱氢酶活力。以外消旋扁桃酸为C源,采用分批补料策略培养(或反应)99h,扁桃酸累计投入量为30.4g/L,(S)-(+)-扁桃酸被完全降解,(R)-(-)-扁桃酸回收产率为32.8%,对映体过量值(e.e.)>99.9%。利用静息细胞作为催化剂不对称降解外消旋扁桃酸的氯代衍生物,制备获得光学活性的(R)-(-)-邻氯扁桃酸、(S)-(+)-间氯扁桃酸和(S)-(+)-对氯扁桃酸,光学纯度均超过99.9%e.e.。

恶臭假单胞菌CGMCC1388对映选择性生物降解制备(S)-扁桃酸及其衍生物的研究

从土壤中分离得到一株(R)-扁桃酸选择性降解菌,经鉴定为恶臭假单胞菌,保存于中国普通微生物保藏中心,编号为CGMCC1388。考察了扁桃酸及其降解产物对扁桃酸脱氢酶活力的影响。研究表明,在培养基中添加少量扁桃酸、苯甲酰甲酸或苯甲酸均可显著提高其产量,以扁桃酸的诱导效果最佳。3种诱导物的最适添加质量浓度分别为4、4和2 g/L。当以消旋扁桃酸为反应底物时,该菌可高选择性降解(R)-扁桃酸,回收得到的(S)-扁桃酸对映体过量值(e.e.)高于99%,反应的对映选择率(E)达130。用静息细胞催化扁桃酸降解的最适温度和pH分别为30℃和6.0,最适底物浓度为60 mmol/L,以双倒数法求得Km为47 mmol/L。考察了该菌对扁桃酸苯环取代衍生物的生物转化,并以高产率制备获得高对映纯度的(S)-对羟基扁桃酸和(S)-对氯扁桃酸。

重组大肠杆菌全细胞用于苯乙酮酸的绿色生物合成

苯乙酮酸是化学合成中重要的合成砌块,可用于合成多种药物中间体,探索苯乙酮酸的绿色合成工艺具有重要的意义。以包含D-扁桃酸脱氢酶Lh DMDH编码基因的重组大肠杆菌全细胞为催化剂,考察了它在无辅酶和辅底物添加的条件下对D-扁桃酸生物转化的效果,并对催化产物进行了纯化和鉴定。结果表明,本研究成功实现了在无辅酶和辅底物添加条件下苯乙酮酸的生物合成,产物的得率和纯度分别为45%和99%左右。成果也为外消旋扁桃酸的手性拆分及苯乙酮酸的生物合成奠定了基础。